Summary
Denne rapporten beskriver en CUBIC protokoll for å avklare fulle tykkelse muse hud biopsier, og visualisere protein uttrykk mønstre, prolifererende celler, og sebocyttene på celle-oppløsning i 3D. Denne metoden gjør det mulig nøyaktig vurdering av hud anatomi og patologi, og av unormale epidermal fenotyper i genmodifiserte mus linjer.
Abstract
Huden er avgjørende for å overleve. Det ytre epidermal lag består av interfollicular epidermis, som er et lagdelt plateepitel dekker det meste av kroppen vår, og epidermal vedheng som hårsekkene og svettekjertlene. Epidermis undergår regenerering gjennom hele livet, og som respons på skade. Dette er aktivert som K14-uttrykke basale epidermal stilk / stamcellepopulasjoner som er tett regulert av flere reguleringsmekanismer aktive innenfor epidermis og mellom epidermis og dermis. Denne artikkelen beskriver en enkel metode for å klargjøre full tykkelse musehud biopsier, og visualisere K14 protein uttrykk mønstre, Ki67-merket prolifererende celler, Nile Red-merket sebocytter, og DAPI atom merking ved enkelt celle oppløsning i 3D. Denne metoden gjør det mulig nøyaktig vurdering og kvantifisering av hud anatomi og patologi, og av unormale epidermal fenotyper i genmodifiserte mus linjer. Den CUBIC protokollen er the beste metoden tilgjengelig for å date for å undersøke molekylære og cellulære interaksjoner i full tykkelse hud biopsier på enkelt celle oppløsning.
Introduction
Huden er avgjørende for å overleve. Det består av tre hoved lag de ytre epidermis, dermis og hypodermis. Overhuden er en meget regenererende vev. Det er en squamous stratifisert epitel, som hovedsakelig består av keratinocytter. Keratinocytter er født i basal laget, og bevege seg oppover gjennom suprabasal lag mens differensiering, og til slutt de er utgytt i det ytre forhomede lag en måned etter fødselen. Overhuden utvikler en rekke vedheng inkludert hårsekkene og talgkjertler. Hårsekkene også regenerere i en syklisk måte gjennom hele livet en. Evne til reproduksjon av epidermis er aktivert ved tilstedeværelsen av stamceller og forløperceller som er lokalisert i basallaget av epidermis og interfollicular hårsekken 2.
Mange signalveier har vært innblandet i epidermal utvikling og fornyelse. Noen av disse forekommer innenforepidermis, som f.eks the Hedgehog veien. Andre signal arrangementer finner sted mellom dermis og epidermis 3. For eksempel er wnt signaler fra dermis antas å være viktig for hårsekken utvikling, og de utskilles av dermal papilla ved begynnelsen av anagen å aktivere hårsekken bule stilk / forløper- celle-proliferasjon og hårsekken vekst 4. Det er viktig å forstå de cellulære og molekylære mekanismer som styrer epidermal utvikling og fornyelse for å bedre forstå hvordan de kan bli forstyrret i regenerativ hudsykdom som hudkreft.
Denne artikkelen beskriver en C lear, U nobstructed B regn I maging cocktailer og C omputational analyse (CUBIC) protokoll 5-7 for å klargjøre hele mount hud preparater, og visualisere protein uttrykk mønstre i 3 dimensjoner ved enkelt celle oppløsning av konfokal mikroskopi. Den CUBIC metoden innebærer nedsenking av hudvevet i to aminoalkoholkjemi baserte kjemiske cocktails. Disse løsningene justeres brytningsindeksene i huden prøven, slik at vev gjennomsiktig og proteinene intakt, slik at immundeteksjon ved enkelt celle oppløsning.
Ved hjelp av denne CUBIC protokollen, basal og prolifererende keratinocytt populasjoner i interfollicular epidermis og i hårsekken ble fotografert i sin helhet tykkelse hud biopsier av villtype mus ved hjelp av anti-Keratin14 (K14) og anti-Ki67 antistoffer. Talgkjertler i villtype hud biopsier ble også visualisert ved hjelp av Nile Red farging. Til slutt ble de basale keratinocytt populasjoner i hvete og hyperplastiske YAP2-5SA-A C hud biopsier forhold åtte.
Dette CUBIC protokollen gjør det mulig visuell vurdering av protein uttrykk i full tykkelse hud biopsier på enkelt celle oppløsning, og er et viktig verktøy for å sette pris på epidermal anatomi og morfologiske defekter i huden av genmodifisertmus, og for å undersøke de cellulære og molekylære mekanismer bak epidermal utvikling og fornyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer som involverer dyr fag følge retningslinjene i Animal Care og etisk komité (ACEC) ved UNSW Australia under godkjente ACEC protokoll 13 / 64B.
1. Klargjøring av Transparent Mouse huden vev
Merk: Alle mus brukt i denne studien var på C57BL / 6 genetisk bakgrunn
- Innsamling av mus hud vev.
- Humant avlive mus ved halshugging.
- fjerne hårene forsiktig fra det aktuelle hudområdet med en trimmer tar seg ikke å såre huden.
- Vask huden for å dekontaminere med 70% etanol i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Løft rygg halsen huden med pinsett og lage snitt med saks.
- Disseksjon av et stort område av dorsal hud mus (ca. 1,5 x 4 cm).
- Flat hud dermis siden ned på et filter papir, og gjøre oppmerksom på anterior-posterior retning av prøven.
- Trim filterpapiret rundt dissekert huden, og plasser i et 15 ml rør fylt med nylagde 4% paraformaldehyde (PFA) løsning i PBS.
- Fix i 1 time ved romtemperatur, eller over natten i kjøleskap ved 4 ° C.
- Vask huden 2 x 5 min i PBS i en 15 ml tube.
Merk: Følgende (1.1.10 - 1.1.12) er valgfrie trinn for langtidslagring av vev. - Dehydrere dissekert hud i PBS med økende konsentrasjon av etanol (25%, 50% 70%) i et 15 ml rør i løpet av 1 time vasketrinn ved romtemperatur.
- Oppbevar dehydrert hud i 70% etanol i PBS i et 15 ml rør ved 4 ° C inntil videre anvendelse.
- 4 timer før lysning, rehydrere hudvev i PBS med avtagende konsentrasjon av etanol (70%, 50%, 25%, 0%) i et 15 ml rør i løpet av 1 time vasketrinn ved romtemperatur.
- Sletting av mus hud biopsier
- Klargjør CUBIC1 clearing løsning ved å løse 3,85 g urea og 3,85 g N, N, N ', N'N'-tetrakis (2-hydroksypropyl) etylendiamin i 5.38 ml destillert vann i en ovn innstilt på 60 - 70 ° C. Bruk en varm rører.
- Legg 2,31 g polyetylenglykol mono-p-isooktylfenyleter / Triton X-100 til løsningen når den er klar og har kjølt ned til romtemperatur.
- Skjær musen huden med en skarp barberblad i biopsier av omtrentlige mål 0,2 x 0,5 cm, og senk i 5 ml CUBIC1 clearing løsning i en 15 ml tube. For å optimalisere visualisering av hårsekkene, sørge for at den lengste siden av biopsi er skåret langs Antero-posterior retning av prøven.
- Plasser på en roterende plattform i en hybridiserings-ovn ved 37 ° C.
- Endre clearing løsning etter 7 dager. Fremstille frisk CUBIC1 løsning før bruk.
- Sjekk gjennomsiktigheten i vevet etter 7 dager. Om nødvendig, la biopsier i CUBIC1 clearing løsning inntil vevet er helt gjennomsiktig.
- Når huden biopsi er gjennomsiktig,fjerne CUBIC1 løsning, og tilsett 4 ml av 1 x PBS for å vaske vevet 4 ganger i 6 timer ved 37 ° C.
- Vask hudvevet i 20% vekt / volum sukrose i PBS i et 15 ml rør i 4 timer ved 37 ° C.
- Fryse vevet i monteringsmedium Optimal oppskjæring Temperatur (OCT) Forbindelse i et 15 ml rør over natten i en -80 ° C fryser.
Merk: Dette trinnet vil øke biopsi permeabilitet for antistoff penetrasjon i etterfølgende trinn.
2. immunfluorescens Farging
- Tine vev fra 1.2.9) til værelsestemperatur i 2 - 3 timer.
- Vask vev i 15 ml rør med 5 ml PBS i 8 timer ved romtemperatur for å fjerne oktober forbindelse.
- Overfør biopsier til en 2 ml rør, og inkuber vev i 1 ml kanin anti-Keratin14 eller kanin-anti-Ki67-antistoff, begge fortynnet 1: 100 i PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) i 3 dager på en ristemaskin i en 37 ° C ovn.
- Overfør biopsier til en 15 ml tube, ennd vaske vevet 4 ganger i 6 timer i 5 ml PBST på en ristemaskin i en 37 ° C ovn.
- Overfør biopsier til en 2 ml rør, tilsett 1 ml anti-kanin Alexa594 sekundært antistoff fortynnet 1: 100 i PBST og inkuberes 3 dager på en ristemaskin i en 37 ° C ovn.
- Overfør biopsier til et 15 ml rør og vaskes 4 ganger vev i 6 timer i 5 ml PBST på en ristemaskin i en 37 ° C ovn.
- Overfør biopsier til en 2 ml rør, tilsett 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) kjerne counterstain-løsning (1: 1000) i PBST og inkuberes over natten på en ristemaskin i en 37 ° C ovn.
- Fjern DAPI kontra løsning, og tilsett 1 ml PBST til 2 ml rør for å vaske vevet 4 ganger i 6 timer på et risteapparat i en 37 ° C ovn.
Merk: Valgfritt trinn: Biopsier kan lagres i mørke i 1 x PBS med 0,02% natriumazid i minst 3 uker.
3. Nile Red Farging
- Oppløs Nile Red pulver i dimetylsulfoksyd (DMSO) til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml
- Tilsett 1 mL Nile Red oppløsning til 1 ml PBS til en sluttkonsentrasjon på 1 ug / ml.
- Tine vev fra 1.2.9) til værelsestemperatur i 2 - 3 timer, og vask med 5 ml PBS i 8 timer ved romtemperatur.
- Overfør biopsier til en 2 ml rør, og senk vev i 1 ml Nile Red farging løsning i 2,5 timer ved romtemperatur.
- Vask huden biopsier i 2 ml rør med 1 ml PBST 4 ganger i 30 minutter ved romtemperatur.
- Fjern PBST oppløsning fra 2 ml rør, tilsett 1 ml av DAPI atomkontra-løsning (1: 1000) i PBST og inkuber over natten ved romtemperatur.
- Fjern DAPI kontra løsning, og tilsett 1 ml PBST i 2 ml rør for å vaske huden vev 4 ganger i 6 timer ved romtemperatur.
Merk: Valgfritt trinn: Biopsier kan lagres i mørke i 1 x PBS med 0,02% natriumazid i minst 3 uker.
4. Imaging
- Klargjør CUBIC2 clearing løsning, som inneholder 50% (Vekt / volum) sukrose, 25% (w / v) urea, 10% (w / v) 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol, og 0,1% (v / v) Triton X-100.
- Inkuber hudvevet i 1 ml CUBIC2 oppløsning i en 2 ml rør på en ristemaskin i 24 timer i en 37 ° C ovn. Dette trinnet vil selv brytningsindeksen av vevet.
- Kontroller klarheten av vevet. Når den er klar til å plassere det hele huden biopsi (0,2 x 0,5 cm) på sin langside på et dekkglass, slik at retningen av lengden på hårfolliklene er parallelt med dekkflaten (# 1 24 x 60 mm)
Merk: Valgfritt trinn: Antistoff-farget biopsier kan lagres i CUBIC2 løsning for ca 7 dager. Nile Red-fargede biopsier kan bare lagres i CUBIC2 løsning i opp til 1 dag, og skal avbildes så snart som mulig. - Forbered bildekammeret (figur 1)
Merk: Forbruksvarer som kreves for utarbeidelse av bildekammeret er: blå takle, spille dough eller lignende, og 2 Dekk (24 x 50 mm) (Figur 1A).- Forbered to tynne strimler av blå tack (diameter ca 1 mm x 2 cm), og to dekk (Figur 1b).
- Plasser blå tack strimler på en dekkglass, slik at nok plass for hudbiopsi (figur 1C). 4.4.3)
- Plasser hud biopsi på mellom strimlene på dekkglass i en dråpe CUBIC2 oppløsning (figur 1C).
- Dekk hud biopsi med den andre dekkglass (figur 1D).
- Plasser bildekammeret med montert hudbiopsi på scenen av en konfokalmikroskop og flytte vevet inn i lysbanen.
- Skann prøven ved hjelp av et kvikksølv eller halogen lyskilde og standard epifluorescence filtre (f.eks DAPI / GFP / Cy3 / Cy5) for å identifisere fluorescerende farget områder av interesse.
- Bilde regioner av interesse med en 10X og 20X objektiv (NA 0,75) og standard confocal fluorescens bildeteknikker (f.eks., Med DAPI farget prøver belyse med en 405 nm laser og samle fluorescens signal mellom 425-475 nm, og med Alexa Fluor 594 eller Nile Red-farget prøver belyse med en 561 nm laser og samle fluorescens signal mellom 570-620 nm).
- Generere bildet Z-stabler av hver region av interesse ved hjelp av mikroskop Z-stack image oppkjøpet programvare (f.eks. Ved bruk av NIS elementer bildebehandlingsprogrammer 4,13 som beskrevet nedenfor).
- Sørg for optimal laser makt og PMT HV / Offset innstillingene har blitt valgt til å samle fluorescens.
- Åpne "ND Acquisition" verktøylinje fra «Anskaffelses Controls".
- Velg "Z-serien Oppsett" -kategorien (sikre alle andre kategoriene er umerket).
- Mens levende skanning, fokus til toppen av prøven og trykk på "Top" -knappen.
- Fokus til bunnen av prøven, og trykk på "bunn" -knappen.
- Input nødvendig steg størrelse (eller trykk optimalisert trinnstørrelse knappen).
- press av "Kjør nå" -knappen.
- Spar resulterende Z-stabler som individ Tiff bildestakker (1 fluorochrome per bilde Z-stack).
- Bruk bilde Z-stabler å rekonstruere 3D volum regioner av interesse ved hjelp av 3D analyseprogramvare (f.eks. Ved hjelp Imaris x64 7.2.3 som beskrevet nedenfor).
- Begynn analyse programvare.
- Velg "overgå" knappen på verktøylinjen for 3D-volum generasjon.
- Åpne første fargebilde Z-stack (f.eks., DAPI).
- Bruk 'legge kanalen "verktøy for å legge til flere fargekanaler, en kanal per fluorochrome. Dermed en prøve som inneholder både DAPI og Alexa Fluor 594 fluorokromer vil kreve to kanaler.
- Bruk "Bildeegenskaper" verktøyet for å sette riktig pixel (voxel) dimensjoner (XYZ), som fastsatt i 4.7 ovenfor.
- Bruk "Display justering" verktøy for å endre kanal farger som nødvendig (for eksempel, satt DAPI kanalen til blå, Alexa Fluor 594 kanal til rød).
- til posisjon 3D volumet i bildevinduet, bruker datamaskinen musen til å klikke og dra volumet etter behov.
- Bruk "Snapshot" verktøy på verktøylinjen for å generere skjermbilder av 3D-bildet.
- Bruk "Animation" -verktøyet i verktøylinjen for å generere filmer av 3D prøve rotasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Full tykkelse rygg hud biopsier av voksne villtype mus ble avklart, farget med et antistoff bindende basal keratinocyte markør Keratin14 (K14), og kjerner ble kontra med DAPI flekker løsning (figur 2 og Movie 1).
DAPI-positive kjerner var synlige gjennom prøven (figur 2A, C), og K14 flekker var synlig utelukkende i en celle tykt basal laget av interfollicular epidermis, og skisserte talgkjertler (svarte asterisker), de ytre rot sheaths hårsekkene, og i de sekundære hår bakterier (figur 2B, C), som tidligere publisert ni. K14 fargeintensitet var høy i interfollicular epidermis, den fjerne hårsekken og de sekundære hår bakterier (hvite asterisker), og det var relativt lav i bule området av hårsekken (Bu i figur 2C). Dermal papiller var også tydelig visible gjennom DAPI merking (pil i figur 2C).
For å visualisere prolifererende celler, full tykkelse dorsal hud biopsier i telogen av voksen villtype-mus ble klaret og farget med et anti-Ki67-antistoff, og kjerner ble motfarget med DAPI-løsning (figur 3, og filmen 2).
Prolifererende keratinocytter ble påvist i basal interfollicular epidermis (IFE i figur 3C), og i eidet (Er i figur 3C) av hårsekkene, men ikke i den bule region (Bu i Figur 3C).
For å visualisere talgkjertlene, full tykkelse rygg hud biopsier i anagen av voksne villtype mus ble avklart og farget med Nile Red at etiketter fettinnholdet i sebocyttene, og kjerner ble kontra med DAPI flekker løsning (figur 4 og Movie 3). Nile Red-positive sebaceous kjertlene ble observert i eidet regionen i hårsekkene (SB i figur 4C), som viser at CUBIC protokollen ikke påvirke morfologi av disse fettholdige strukturer. Uventet, hår sjakter ble også merket med Nile Red (HS i Figur 4C).
For å visualisere de morfologiske endringer i overhuden av YAP2-5SA-A C transgene mus som uttrykker en hyperaktiv YAP mutant protein i basale keratinocytter 8, var fulle tykkelse rygg hud biopsier av voksen villtype og YAP2-5SA-A C transgene kull mus avklart og farget med anti-K14 antistoff, og kjerner ble kontra med DAPI løsning (Figur 5, og Movie 4 (villtype) og Movie 5 (YAP2-5SA-A C)).
I YAP2-5SA-A C transgene hud, den hyperplasi av interfollicular epidermis (topp doble piler i Figur 4F figur 5F), som representerer de forstørrede stamcellepopulasjoner, som tidligere beskrevet åtte.
Figur 1: Klargjøring av Imaging Chamber. A: forbruksvarer som kreves for fremstilling av den bildekammeret er blå halser, spille deig eller lignende, og 2 Dekkglass (24 x 50 mm) B:. Fremstille to tynne strimler av blå stift (diameter ca. 2 mm x 2 cm), og to dekk~~POS=TRUNC C:. Plasser blå tack strimler på en dekkglass, slik at nok plass for huden biopsi. Plasser huden biopsi i en dråpe CUBIC2 oppløsning i mellom de to strimler D:. Plasser andre dekkglass på blå tack strimler for å dekke huden biopsi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: K14 / DAPI Etikett ing av Dorsal Skin i telogen av Adult villtype mus 3D volum rekonstruksjon av en rygg hudbiopsi i telogen av en voksen villtype mus merket med en K14 antistoff (Red i B, C), og DAPI atom counterstain. (blå i A, C). K14 farging er sterk i interfollicular epidermis (IFE), eidet og talgkjertler (svarte asterisker), og de sekundære hår bakterier (hvit stjerne), og relativt lav i bule området (Bu). Scale barer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Ki67 Merking av Dorsal Skin i telogen av Adult villtype mus 3D volum rekonstruksjoner av en rygg hud biopsi av en voksen villtype mus merket med Ki67 antistoff (Red i B, C), og DAPI atom counterstain (blå i A, C). Prolifererende Ki67-positive keratinocytter er tydelig i de basale interfollicular epidermis (IFE), og i eidet regionen (IS), men ikke i den bule (Bu) av telogen hårsekken. Scale barer 50 mikrometer.rFå = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Nile Red Farging av Dorsal Skin i Anagen av Adult villtype mus 3D volum rekonstruksjon av en rygg hudbiopsi i anagen av en voksen villtype mus merket med Nile Red (rød i B, C), og DAPI atom counterstain (blå i. A, C). Nile Red farging er synlig i sebocytter (SB) og i håret (HS). Scale barer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur5: morfologiske abnormaliteter i YAP2-5SA-A C Epidermis 3D volum rekonstruksjoner av rygg hud biopsier av voksen villtype (A - C) og YAP2-5SA-A C transgene kull mus (D - F) merket med en K14 antistoff (rødt i. B, C, E, F), og DAPI atom counterstain (blå i A, C, D, F). Epidermal hyperplasi av YAP2-5SA-A C epidermis er tydelig i de interfollicular epidermis (topp doble pilene i F) og i hårsekkene, som viser de karakteristiske stilk / stamcelle massene proksimalt (lavere doble pilene i F) 8. Scale barer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Movie 1. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Movie 2. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Movie 3. Klikk her for å laste ned denne filmen.
01movie4.jpg "/>
Movie 4. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De regulatoriske mekanismer som styrer hud utvikling og homeostase er mest studert i 2D ved hjelp av vev seksjonering og histologisk farging eller merking med antistoffer, som gjør at bare en begrenset forståelse av hud morfologi, cellepopulasjoner eller protein uttrykk. Et antall fremgangsmåter er blitt utviklet for å forbedre synliggjøring av den romlige organisering av celler og proteiner ved enkelt celle oppløsning i 3 dimensjoner i epidermale hele monteringer 10-13. Noen av disse er imidlertid involverer separasjon av epidermis fra dermis, som er teknisk utfordrende spesielt ved hjelp hårete hud, og ofte resulterer i vevskade og brudd av hårsekkene. Også separasjon av epidermis og dermis svekker studere cellulære og molekylære interaksjoner som oppstår mellom dem under embryonal utvikling og vev homeostase.
The 'flat mount tilnærming' er en annen metode der full tykkelse musHuden blir dissekert og immunostained, og deretter avklares ved hjelp benzylbenzoat og benzylalkohol (BBBA) samtidig bevare Immunofluorescent signaler 14. Denne metoden krever ikke den teknisk utfordrende separasjon av epidermis fra dermis. Imidlertid er BBBA svært giftig, det denatures noen fluorescerende proteiner, og det forurenser mikroskop mål, ikke åpner for høyoppløselig avbildning av prøvene som kreves for å undersøke cellulære og molekylære interaksjoner i vevet.
Denne rapporten beskriver en CUBIC protokoll 5-7 for å klargjøre fulle tykkelse mus hud biopsier fra enhver ønsket anatomisk region og alder ved hjelp av relativt trygge og billige reagenser. Dette er teknisk enkel protokoll tillater visualisering av protein uttrykk og spredningsmønster ved immunfluorescens i full tykkelse hud biopsier kontra med DAPI i tre dimensjoner ved enkelt celle oppløsning, slik at enestående og svært nøyaktig kvaitative vurdering og kvantifisering av protein uttrykk, spredning, vev morfologi og hårsekken dimensjoner. Denne fremgangsmåte er også egnet for visualisering av sebocytter ved hjelp Nile Red-farging til tross for fjerning av vev lipider under klargjøring prosedyren. En viktig begrensning ved denne metoden er tilgjengeligheten av antistoffer effektivt bindende og tillater visualisering av de respektive target-proteiner ved hjelp av denne hud klargjøring prosessen. I tillegg genererte bilde og filmer filer er store, og gode IT-ressurser som datamaskiner med kraftige prosessorer og rikelig med data lagringsplass er avgjørende.
Et kritisk trinn i prosedyren er utarbeidelsen av huden biopsier. For å visualisere intakt hårsekken anatomi bør orienteringen av huden biopsi tatt i betraktning, og lengden av biopsier skal skjæres parallelt med retningen av lengden av hårsekkene. I tillegg er liten og meget tynne skin biopsier er vanskelig å montere riktig for mikroskopi. Større biopsier vil kreve mer tid å fjerne, og kan medføre antistoff penetrasjon problemer som resulterer i antigen gjenkjenning gjenstander. Det er derfor lurt å kutte, tydelig og beis flere biopsier per eksperiment.
Det er også viktig å tett tette rørene mens fremstilling av den kubiske løsninger for å hindre fordampning av innholdet under oppvarmingsprosessen, noe som resulterer i forandringer i reagens- konsentrasjoner og kan føre til nedsatt vev clearing. Det neste viktige skritt er at vevet vil bli avklart ved 37 ° C for å akselerere clearing prosessen. Etter 7 dager, vil CUBIC1 løsningen må være forberedt frisk for å erstatte den gamle.
I fremtiden vil flere antistoffer identifiseres som er kompatible med CUBIC hud avklaring prosedyre, og analyser kan utvides til å visualisere og kvantifisering av epidermal og melanocytter (stilk) cellemarkørs og dermal proteiner. Denne teknikken vil også spille en avgjørende rolle i 3D studier av hud patologi og anatomi, og bistand i klarlegging av cellulære og molekylære mekanismer bak unormal og normal epidermal biologi i huden av mutante mus og transgene reporter musemodeller, inkludert signale interaksjoner mellom dermis og epidermis.
Den CUBIC protokollen 5-7 er sannsynlig å være gjeldende for hud av andre virveldyr dyremodeller, og til menneskelig hud punsj biopsier. Lys ark mikros vil gjøre det mulig visualisering av epidermal anatomi, protein uttrykk mønstre, og progresjon av hårsekken sykle etapper i større hudprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Australian Bio-Resources (Garvan Institute, Australia), den biologiske ressurser Centre (UNSW Australia) og Animal Care & etiske komité for støtte med dyreforsøk. Dette arbeidet ble støttet av National Health and Medical Research Council of Australia (Prosjekt Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales er mottakere av en CONICYT-Becas Chile stipend (# 72101076). Mr. Bassem Akladios er en mottaker av University International Graduate Award ved UNSW Australia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
