Summary
Este relatório descreve um protocolo cúbicos para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteínas, células em proliferação e sebócitos com a resolução única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados.
Abstract
A pele é essencial para a nossa sobrevivência. A camada epidérmica exterior consiste da epiderme interfolicular, que é um epitélio escamoso estratificado que cobrem a maior parte do nosso corpo, e apêndices epidérmicos, como os folículos pilosos e glândulas sudoríparas. A epiderme é submetido a regeneração e ao longo da vida em resposta a lesão. Isso é ativado por K14-expressando populações / células progenitoras-tronco epidérmicas basais que são fortemente regulados por múltiplos mecanismos reguladores ativos dentro da epiderme e entre epiderme e derme. Este artigo descreve um método simples para esclarecer rato espessura biópsias de pele cheios, e visualizar os padrões de expressão de proteína K14, Ki67 rotulados células em proliferação, Nile Red marcado sebócitos e rotulagem nuclear DAPI em resolução de uma única célula em 3D. Este método permite uma avaliação precisa e quantificação da anatomia da pele e patologia, e de fenótipos epidérmicas anormais nas linhas de rato geneticamente modificados. O protocolo cúbica é the melhor método disponível no momento para investigar as interações moleculares e celulares em biópsias de pele de espessura total com resolução de uma única célula.
Introduction
A pele é essencial para a nossa sobrevivência. É composto por três camadas principais, a epiderme exterior, a derme e hipoderme. A epiderme é um tecido altamente regenerativa. É um epitélio escamoso estratificado, que consiste principalmente de queratinócitos. Queratinócitos nascem na camada basal, e mover-se para cima através das camadas suprabasais diferenciando, e, eventualmente, eles são eliminados na camada córnea exterior cerca de um mês após o seu nascimento. A epiderme se desenvolve uma série de apêndices, incluindo os folículos pilosos e glândulas sebáceas. Os folículos pilosos também regenerar de forma cíclica ao longo da vida 1. A capacidade de regeneração da epiderme é activado pela presença de células estaminais e progenitoras que estão localizados na camada basal da epiderme e folículo capilar interfoliculares 2.
Muitas das vias de sinalização têm sido implicados no desenvolvimento e regeneração epidérmica. Alguns destes ocorrem dentroapenas a epiderme, tais como a via hedgehog. Outros eventos de sinalização ocorrem entre derme e epiderme 3. Por exemplo, os sinais de Wnt da derme são considerados como sendo importantes para o desenvolvimento do folículo de cabelo, e que são segregadas por a papila dérmica no início da fase anágena para activar a proliferação de células estaminais / progenitoras do folículo de cabelo e crescimento protuberância folículo piloso 4. É importante compreender os mecanismos celulares e moleculares que controlam o desenvolvimento epidérmica e regeneração para entender melhor como eles podem ser perturbado na doença de pele regenerativa, como câncer de pele.
Este artigo descreve um lear C, U nobstructed B chuva Eu cocktails maging e C análise omputational protocolo de 5-7 (cúbico) para esclarecer preparações para a pele de montagem integrais, e visualizar os padrões de expressão de proteína em 3 dimensões com resolução de uma única célula por microscopia confocal. O método envolve a imersão de CUBIC peletecido em dois cocktails químicos à base de aminoálcool. Estas soluções ajustar os índices de refracção da amostra da pele, deixando o tecido transparente e as proteínas intactas, permitindo a imunodetecção de resolução de célula única.
Usando este protocolo cúbicos, a proliferação basal e populações de queratinócitos na epiderme interfoliculares e no folículo de cabelo foram fotografadas em biópsias de pele de espessura total de ratinhos de tipo selvagem utilizando anticorpos anti-Keratin14 (K14) e anticorpos anti-Ki67. As glândulas sebáceas em biópsias de pele de tipo selvagem também foram visualizados usando Nile Red coloração. Por último, as populações de queratinócitos basais em tipo selvagem e biópsias de pele YAP2-5SA-Sc hiperplásicos foram comparados 8.
Este protocolo permite CUBIC avaliação visual da expressão da proteína em biópsias de pele de espessura total com resolução de uma única célula, e é uma ferramenta importante para apreciar a anatomia da epiderme e defeitos morfológicos na pele de organismos geneticamente modificadosratos, e investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento da epiderme e regeneração.
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Protocol
Declaração de Ética: Todos os procedimentos envolvendo indivíduos animais siga as orientações do Comitê de Cuidados com Animais e Ética (ACEC) em UNSW Austrália sob protocolo aprovado ACEC 13 / 64B.
1. Preparação da Transparente tecido da pele do rato
Nota: Todos os ratos utilizados neste estudo eram de um C57BL / 6 fundo genético
- Coleção de tecido da pele do rato.
- Humanamente eutanásia os ratos por deslocamento cervical.
- Remova cuidadosamente os pêlos da área relevante pele com um cuidar trimmer não ferir a pele.
- Lavar a pele para descontaminar com etanol 70% em tampão fosfato salino (PBS).
- Levante a pele do pescoço dorsal com uma pinça e fazer a incisão com uma tesoura.
- Dissecar uma grande área de pele do rato dorsal (aproximadamente 1,5 x 4 cm).
- Achatar pele derme-lado para baixo em um papel de filtro, e anote a orientação anterior-posterior da amostra.
- tripapel m de filtro em torno da pele dissecada, e coloque em um tubo de 15 ml cheio com recém-preparados paraformaldeído a 4% solução (PFA) em PBS.
- Fix durante 1 h à temperatura ambiente, ou durante a noite no frigorífico a 4 ° C.
- Lavar a pele 2 x 5 min em PBS em um tubo de 15 ml.
Nota: O seguinte (1.1.10 - 1.1.12) são passos opcionais para armazenamento a longo prazo do tecido. - Desidratar pele dissecados em PBS com o aumento da concentração de etanol (25%, 50%, 70%) num tubo de 15 ml durante os passos de lavagem de 1-hora à temperatura ambiente.
- Armazenar pele desidratadas em etanol a 70% em PBS num tubo de 15 ml a 4 ° C até uso posterior.
- 4 horas antes da limpeza, re-hidratar o tecido da pele em PBS com a diminuição da concentração de etanol (70%, 50%, 25%, 0%) num tubo de 15 ml durante os passos de lavagem de 1-hora à temperatura ambiente.
- Limpando as biópsias da pele do rato
- Preparar a solução de compensação CUBIC1 por dissolução de 3,85 g de ureia e 3,85 g de N, N, N ', N'tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina em 5,38 ml de água destilada em um aquecedor definido para 60 - 70 ° C. Use um agitador quente.
- Adicionar 2,31 g de polietileno-glicol mono-p-isooctylphenyl éter / Triton X-100 à solução, uma vez que é clara e foi arrefecida até à temperatura ambiente.
- Cortar a pele do rato com uma lâmina afiada em biópsias de dimensões aproximadas de 0,2 x 0,5 cm, e submergir em 5 ml de solução CUBIC1 clareira em um tubo de 15 ml. Para optimizar a visualização de folículos de cabelo, assegurar que o lado mais longo da biópsia é cortada ao longo da direcção ântero-posterior da amostra.
- Colocar numa plataforma rotativa num forno de hibridação a 37 ° C.
- Mudar a solução de compensação após 7 dias. Preparar solução fresca CUBIC1 antes da utilização.
- Verifique a transparência do tecido após 7 dias. Se necessário, deixe biópsias em solução compensação CUBIC1 até que o tecido é completamente transparente.
- Uma vez que a biópsia da pele é transparente,remover a solução CUBIC1, e adicionar 4 ml de 1 x PBS para lavar o tecido 4 vezes durante 6 h a 37 ° C.
- Lavar o tecido da pele em 20% w / v de sacarose em PBS num tubo de 15 ml durante 4 h a 37 ° C.
- Congelar o tecido em forma de montagem Composto temperatura óptima de corte (OCT) num tubo de 15 ml durante a noite num congelador a -80 ° C.
Nota: Este passo irá aumentar a permeabilidade da biópsia para a penetração do anticorpo em passos subsequentes.
2. Imunofluorescência Coloração
- Descongelar o tecido de 1.2.9) à temperatura ambiente durante 2-3 h.
- tecido de lavagem no tubo de 15 ml com 5 ml de PBS durante 8 horas à temperatura ambiente para remover outubro Composto.
- Transferência de biópsias para um tubo de 2 ml, e incuba-se o tecido em 1 ml de coelho anti-Keratin14 ou anticorpo anti-Ki67 de coelho, ambos diluídos 1: 100 em PBST (PBS + 0,1% de Triton-X100) durante 3 dias num agitador numa 37 multidão.
- biópsias transferência para um tubo de 15 ml, umaND lavar o tecido 4 vezes durante 6 horas em 5 mL de PBST num agitador num forno de 37 ° C.
- Transferência de biópsias para um tubo de 2 mL, mais 1 ml de coelho anti-Alexa594 anticorpo secundário diluído 1: 100 em PBST e incubar 3 dias num agitador numa estufa de 37 ° C.
- Transferência de biópsias para um tubo de 15 mL e lavar tecidos 4 vezes durante 6 horas em 5 mL de PBST num agitador num forno de 37 ° C.
- Transferência de biópsias para um tubo de 2 mL, adicionar 1 ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) solução contracoloração nuclear (1: 1000) em PBST e incubar durante a noite num agitador num forno de 37 ° C.
- Remover solução contracoloração DAPI, e adicionar 1 ml de PBST para o tubo de 2 mL para lavar o tecido 4 vezes durante 6 horas num agitador num forno de 37 ° C.
Nota: Passo opcional: Biopsias pode ser armazenada no escuro em 1x PBS com 0,02% de azida de sódio durante pelo menos 3 semanas.
3. Coloração Vermelho do Nilo
- Dissolve-se pó de Vermelho do Nilo em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 1 mg / ml
- Adicionar uma solução de Vermelho do Nilo ul de 1 ml de PBS a uma concentração final de 1 ug / ml.
- Descongelar o tecido a partir de 1.2.9) à temperatura ambiente durante 2-3 h, e lavar com 5 ml de PBS durante 8 horas à temperatura ambiente.
- Transferir biópsias para um tubo de 2 mL, e submergir o tecido em 1 ml de solução corante Vermelho do Nilo durante 2,5 horas à temperatura ambiente.
- Lavam-se as biópsias de pele em tubo 2 ml com 1 ml de PBST 4 vezes durante 30 min à temperatura ambiente.
- Remoção da solução de PBST a partir do tubo de 2 mL, mais 1 ml de solução DAPI contracoloração nuclear (1: 1000) em PBST e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
- Remover solução contracoloração DAPI, e adicionar 1 ml de PBST no tubo de 2 mL para lavar o tecido da pele 4 vezes durante 6 horas à temperatura ambiente.
Nota: Passo opcional: Biopsias pode ser armazenada no escuro em 1x PBS com 0,02% de azida de sódio durante pelo menos 3 semanas.
4. Criação de Imagens
- Preparar a solução CUBIC2 compensação, que contém 50% De sacarose, 25% (w / v) de ureia, 10% (v / w) (w / v) de 2,2 ', 2' '- nitrilotriethanol, e 0,1% (v / v) de Triton X-100.
- Incubar o tecido da pele em 1 ml de solução CUBIC2 num tubo de 2 mL num agitador durante 24 horas num forno a 37 ° C. Este passo irá igualar o índice de refracção do tecido.
- Verifique a clareza do tecido. Uma vez que é claro, posicionar toda a biópsia de pele (0,2 x 0,5 cm) no seu lado mais longo para uma lamela de vidro, de tal modo que a direcção do comprimento dos folículos pilosos é paralelo à superfície da lamela (# 1 24 x 60 mm)
Nota: Passo opcional: biópsias Anticorpo-coradas podem ser guardadas em solução CUBIC2 durante cerca de 7 dias. biópsias Vermelho do Nilo-coradas só podem ser armazenados em solução CUBIC2 para até 1 dia, e deve ser trabalhada o mais rapidamente possível. - Prepare câmara de imagem (Figura 1)
Nota: consumíveis necessários para a preparação da câmara de imagem são: azul aderência, massa de modelar ou similar, e 2 lamelas (24 x 50 mm) (Figura 1A).- Prepare duas tiras finas de aderência azul (diâmetro cerca de 1 mm x 2 cm), e duas lamelas (Figura 1B).
- Coloque aderência tiras azuis em um deslizamento de cobertura, permitindo espaço suficiente para biópsia da pele (Figura 1C). 4.4.3)
- Coloque biópsia da pele em tiras entre a lamela em uma gota de solução CUBIC2 (Figura 1C).
- Cubra biópsia da pele com a segunda lamela (Figura 1D).
- Coloque a câmara de imagem com a biópsia da pele montada na plataforma de um microscópio confocal e mover o tecido para a via de luz.
- Digitalizar a amostra usando uma fonte de luz de mercúrio ou de halogéneo e filtros de epifluorescência padrão (por exemplo, DAPI / GFP / CY3 / Cy5) para identificar regiões fluorescente manchadas de interesse.
- Regiões imagem de interesse usando uma objetiva de 10X e 20X (NA 0,75) e técnicas padrão de imagem confocal de fluorescência (ex., Com DAPI manchado amostras iluminar com um laser de 405 nm e recolher sinal de fluorescência entre 425-475 nm, e com Alexa Fluor 594 ou amostras Nile manchado de vermelho iluminar com um laser de 561 nm e recolher sinal de fluorescência entre 570-620 nm).
- Gerar imagem Z-pilhas de cada região de interesse usando microscópio Z-stack software de aquisição de imagem (por exemplo., Utilizando elementos NIS imaging software 4,13, conforme descrito abaixo).
- Garantir potência do laser ideal e PMT HV / Offset configurações foram selecionadas para recolher fluorescência da amostra.
- Abra a barra de ferramentas "ND Aquisição" de "Controles de Aquisição".
- Selecione a aba "Configuração série Z" (garantir que todas as outras abas são desmarcados).
- Durante a digitalização ao vivo, o foco para o topo da amostra e pressione o botão "Top".
- Concentre-se para a parte inferior da amostra e pressione o botão "Bottom".
- Input tamanho necessário passo (ou pressione otimizado botão de tamanho do passo).
- Préss "Executar agora".
- Salve Z-stacks resultante como pilhas de imagens TIFF individuais (1 fluorocromo por imagem Z-stack).
- Use imagem Z-pilhas para reconstruir as regiões volume 3D de interesse usando o software de análise 3D (por exemplo., Usando Imaris x64 7.2.3 conforme descrito abaixo).
- Inicie o software de análise.
- Escolha o botão "Ultrapasse" na barra de ferramentas para a geração de volume 3D.
- Abrir primeira imagem colorida Z-stack (por exemplo., DAPI).
- Use o "adicionar canal 'ferramenta para adicionar canais de cores adicionais, um canal por fluorocromo. Assim, uma amostra contendo tanto DAPI e fluorocromos Alexa Fluor 594 irá requerer dois canais.
- Use o "Propriedades da imagem" ferramenta para definir as dimensões de pixel correta (voxel) (XYZ), conforme determinado no ponto 4.7 acima.
- Use a ferramenta de "Display de ajuste" para alterar as cores de canal, conforme necessário (por exemplo, ajustar o canal DAPI para azul, Alexa Fluor 594 canal a vermelho).
- para posição do volume 3D na janela de imagem, use o mouse para clicar e arrastar o volume conforme necessário.
- Use a ferramenta "Snapshot" na barra de ferramentas para gerar capturas de ecrã da imagem em 3D.
- Use a ferramenta "Animação" na barra de ferramentas para gerar filmes de rotação da amostra 3D.
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Representative Results
Espessura dorsal biopsias completas de pele de ratinhos de tipo selvagem adultos foram esclarecidas, coradas com uma ligação de queratinócitos basais marcador Keratin14 (K14) de anticorpo, e os núcleos foram contrastadas com solução de coloração de DAPI (Figura 2 e um filme).
Núcleos DAPI-positivos eram visíveis em toda a amostra (Figura 2A, C), e K14 coloração era visível exclusivamente na camada basal de espessura de uma célula da epiderme interfoliculares, e definindo as glândulas sebáceas (asteriscos pretos), as bainhas externa da raiz de folículos de cabelo, e os germes de cabelo secundários (Figura 2B, C), como anteriormente publicado 9. K14 intensidade da coloração foi alta na epiderme interfolicular, o folículo piloso distal e os germes de cabelo secundárias (asteriscos brancos), e foi relativamente baixa na área do bojo do folículo piloso (Bu na Figura 2C). As papilas dérmicas foram também claramente visible através da rotulagem DAPI (seta na Figura 2C).
Para visualizar as células em proliferação espessura total biópsias de pele dorsal, em ratinhos de tipo selvagem de eflúvio adultos foram clarificadas e coradas com um anticorpo anti-Ki67, e os núcleos foram contrastadas com DAPI solução (Figura 3, e Filme 2).
Queratinócitos em proliferação foram detectados na epiderme basais interfoliculares (IFE na Figura 3C), e no istmo (Is na Figura 3C) dos folículos de cabelo, mas não na região do bojo (Bu na Figura 3C).
Para visualizar glândulas sebáceas, espessura total biópsias de pele dorsal em anágena de ratinhos de tipo selvagem adultos foram clarificadas e coradas com Vermelho do Nilo que rotula o teor de gordura sebócitos, e os núcleos foram contrastadas com solução de coloração DAPI (Figura 4 e Filme 3). sebaceou Vermelho do Nilo-positivas glândulas foram observadas na região do istmo do folículo piloso (SB na Figura 4C), mostrando que o protocolo CUBIC não afecta significativamente a morfologia destas estruturas contendo gordura. Inesperadamente, também fios de cabelo foram marcadas com Vermelho do Nilo (SH na Figura 4C).
Para visualizar as alterações morfológicas na epiderme de camundongos transgênicos YAP2-5SA-Sc que expressam uma proteína mutante YAP hiperativo em queratinócitos basais 8, espessura total biópsias de pele dorsal de tipo selvagem adulto e ratinhos da mesma ninhada transgênica YAP2-5SA-Sc foram clarificadas e coradas com o anticorpo anti-K14, e os núcleos foram contrastadas com DAPI solução (Figura 5, e do filme 4 (do tipo selvagem) e do filme 5 (YAP2-5SA-ôc)).
Na pele transgénica YAP2-5SA-Sc, a hiperplasia da epiderme interfolicular (top setas duplas na Figura 4F Figura 5F), representando as populações de células estaminais ampliadas, como descrito anteriormente 8.
Figura 1: Preparação de a câmara de imagem. A: consumíveis necessários para a preparação da câmara de imagem são azuis aderência, massa de modelar ou similar, e 2 lamelas (24 x 50 mm) B:. Preparar duas tiras finas de aderência azul (diâmetro de cerca de 2 mm x 2 cm), e duas lamelas C:. Coloque tiras azuis aderência sobre uma lamela, permitindo espaço suficiente para a biópsia da pele. Coloque a biópsia da pele em uma gota de solução CUBIC2, entre as duas tiras de D:. Ponto segunda lamela em aderência tiras azuis para cobrir a biópsia da pele. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: K14 / DAPI Etiqueta ing da Dorsal pele em eflúvio de camundongos adultos de tipo selvagem reconstrução volume 3D de uma biópsia da pele dorsal em telógena de um rato adulto tipo selvagem marcado com um anticorpo K14 (vermelho no B, C), e de contraste nuclear DAPI. (azul na a, C). K14 coloração é forte na epiderme interfolicular (IFE), o istmo e as glândulas sebáceas (asteriscos preto), e os germes de cabelo secundárias (asterisco branco), e relativamente baixo no bojo área (Bu). Escala de barras 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Ki67 Rotulagem de Dorsal pele em eflúvio do Adulto tipo selvagem ratos reconstruções de volume 3D de uma biópsia da pele dorsal de um rato adulto tipo selvagem marcado com um anticorpo Ki67 (vermelho no B, C), e de contraste nuclear DAPI (azul no A, C). A proliferação de queratinócitos Ki67-positivas são evidentes na epiderme basal interfoliculares (IFE), e na região do istmo (IS), mas não no bojo (Bu) do folículo de cabelo telogénico. Escala das barras 50 uM.rget = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Nile coloração vermelha da Dorsal pele em Anagen de camundongos adultos de tipo selvagem reconstrução volume 3D de uma biópsia da pele dorsal em anágena de um rato adulto tipo selvagem marcado com Nile Red (vermelho no B, C), e de contraste nuclear DAPI (azul. A, C). Vermelho do Nilo coloração é visível nas sebócitos (SB) e no eixo do cabelo (HS). Escala de barras 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura5: morfológica Anormalidades na YAP2-5SA-Sc Epidermis reconstruções de volume 3D de biópsias de pele dorsal de tipo selvagem adulto (A - C) e YAP2-5SA-Sc ratinhos da mesma ninhada transgénico (D - F) marcada com um anticorpo K14 (vermelho. B, C, e, F), e de contraste nuclear DAPI (azul em a, C, D, F). A hiperplasia epidérmica da epiderme YAP2-5SA-Sc é aparente na epiderme interfolicular (top setas duplas na F) e nos folículos pilosos, que exibem as massas de células tronco / progenitoras característicos proximal (inferior setas duplas na F) 8. Escala de barras 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os mecanismos reguladores que controlam o desenvolvimento de pele e homeostase são mais comumente estudada em 2D usando o seccionamento de tecidos e coloração histológica ou rotulagem com anticorpos, que permite apenas uma apreciação restrito da morfologia da pele, populações de células ou a expressão da proteína. Um número de métodos foram desenvolvidos para melhorar a visualização da organização espacial das células e proteínas com uma resolução de uma única célula em 3 dimensões em peças inteiras epidérmicas 10-13. Alguns destes envolvem contudo a separação da epiderme da derme, o que é tecnicamente desafiante utilizando especialmente pele peluda, e muitas vezes resulta em danos nos tecidos e ruptura dos folículos pilosos. Além disso, a separação da epiderme e da derme prejudica estudo das interacções celulares e moleculares que ocorrem entre eles durante o desenvolvimento embrionário e a homeostase do tecido.
A "abordagem plana montagem" é outro método onde rato espessura totalpele é dissecado e imunocoradas, e depois clarificada utilizando benzoato de benzilo e álcool benzílico (BBBA) preservando ao mesmo tempo os sinais imunofluorescentes 14. Este método não requer a separação de um desafio técnico a epiderme da derme. No entanto, BBBA é altamente tóxico, que desnatura algumas proteínas fluorescentes, e contamina objectivos microscópio, não permitindo o processamento de imagem de alta resolução de amostras necessárias para investigar interacções celulares e moleculares no tecido.
Este relatório descreve um protocolo CUBIC 5-7 para esclarecer biópsias da pele do rato espessura total de qualquer região anatómica desejada e idade, utilizando reagentes relativamente seguros e baratos. Este protocolo tecnicamente simples permite a visualização de padrões de expressão e proliferação de proteínas por imunofluorescência em biópsias de pele de espessura total contra-coradas com DAPI em três dimensões com resolução de uma única célula, permitindo inédita e altamente preciso quaitative avaliação e a quantificação da expressão da proteína, a proliferação, a morfologia do tecido e às dimensões do folículo piloso. Este método também é adequado para a visualização de sebócitos usando coloração com Vermelho do Nilo, apesar da remoção dos lípidos dos tecidos durante o processo de clarificação. Uma limitação importante deste método é a disponibilidade de anticorpos de ligação de forma eficiente e permitindo a visualização das suas respectivas proteínas alvo usando este processo de clarificação da pele. Além disso, os arquivos de imagem e filmes gerados são grandes, e bons recursos de TI, como computadores com processadores poderosos e amplo espaço de armazenamento de dados são essenciais.
Um passo essencial no processo é a preparação das biópsias da pele. Para visualizar intacta anatomia do folículo piloso, a orientação da biópsia da pele deve ser tida em conta, e o comprimento das biópsias devem ser cortadas paralelamente à direcção do comprimento dos folículos pilosos. Além disso, pequenas e muito fina de esquiN biópsias são difíceis de montar correctamente para microscopia. biópsias maiores exigirá mais tempo para limpar, e podem ter problemas de penetração de anticorpos, resultando em artefactos de detecção de antígeno. Por isso, é aconselhável cortar, limpar e mancha múltiplas biópsias por experimento.
É também importante para selar firmemente os tubos durante a preparação das soluções cúbico para evitar a evaporação do conteúdo durante o processo de aquecimento, o que resulta em alterações nas concentrações de reagentes e pode causar compensação tecido danificado. O próximo passo é importante que o tecido vai ser esclarecida a 37 ° C para acelerar o processo de compensação. Após 7 dias, a solução CUBIC1 terá de ser preparado para substituir o antigo.
No futuro, serão identificados mais anticorpos que são compatíveis com o processo de clarificação da pele cúbico e análises pode ser estendido para a visualização e quantificação de epidérmica e melanócitos (haste) marcador de célulass e dérmicos proteínas. Esta técnica também vai desempenhar um papel fundamental em estudos de 3D de patologia da pele e anatomia, e ajuda na elucidação dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes biologia epidérmica anormal e normal em pele de camundongos mutantes e modelos de camundongos transgênicos repórter, incluindo interacções sinalização entre a derme e a epiderme.
O protocolo CUBIC 5-7 é susceptível de ser aplicável à pele de outros modelos animais vertebrados, e de biópsias de punção da pele humanos. microscopia folha de luz vai permitir a visualização da anatomia da epiderme, os padrões de expressão de proteína, e a progressão das fases do ciclo do cabelo folicular em amostras de pele maiores.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Australian Bio-Resources (Instituto Garvan, Austrália), o Centro de Recursos Biológicos (UNSW Austrália) e Animal Care & Comissão de Ética para o apoio à experimentação animal. Este trabalho foi financiado pelo Health and Medical Research Council Nacional da Austrália (Project Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales é beneficiários de uma bolsa de estudos CONICYT-Becas Chile (# 72.101.076). Mr. Bassem Akladios é um receptor da Universidade Prêmio Internacional de Pós-Graduação por UNSW Austrália.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 - Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
References
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
