Summary
يوصف سلسلة البلمرة تحسين طريقة طول تفاعل تقييد جزء تعدد الأشكال عن التنميط الجيني الأنواع ينفوخية من السائل اللوني / الكتلة الطيفي. ويعمل عكس المرحلة العمود السيليكا متراصة لفصل amplicons هضمها. هذه الطريقة أن توضح للجماهير monoisotopic من أليغنوكليوتيد]، وهو أمر مفيد لتحديد تكوين قاعدة.
Abstract
يوصف نسخة محسنة من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) -restriction جزء طول تعدد الأشكال (RFLP) طريقة لالتنميط الجيني الأنواع ينفوخية السامة عن طريق السائل اللوني / Electrospray التأين الطيف الكتلي (LC / ESI-MS). ويتم استخراج الحمض النووي من استخدام عدة استخراج الحمض النووي استنادا غشاء السيليكا. بعد التضخيم PCR باستخدام عازلة PCR خالية من المنظفات، تضاف الانزيمات التقييد إلى حل من دون تنقية محلول التفاعل. عكس المرحلة العمود السيليكا متراصة وتحويل فورييه يعملون عالية الدقة مطياف الكتلة وجود تعديل ملكوت فخ محلل للانفصال وكشف، على التوالي. الطور المتحرك، ويتألف من 400 ملي 1،1،1،3،3،3-hexafluoro-2-بروبانول، 15 ملي ثلاثي الإيثيلامين (الرقم الهيدروجيني 7.9)، والميثانول، ويتم تسليم بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة. دورة الزمن لتحليل LC / ESI-MS هو 8 دقيقة بما في ذلك موازنة العمود. برنامج Deconvolution وجود النظائر نموذج التوزيع سو قليل النوكليوتيد يستخدم لحساب كتلة monoisotopic المقابلة من الطيف الشامل. لتحليل أليغنوكليوتيد] (المدى 26-79 النيوكليوتيدات)، وكانت دقة الجماعية 0.62 ± 0.74 جزء في المليون (ن = 280) وما استمر دقة ممتازة والدقة لمدة 180 ساعة دون استخدام معيار كتلة القفل.
Introduction
مطياف الكتلة (MS) هو عبارة عن تقنية مقبولة لتحديد سريع وموثوق بها من الأحماض النووية، مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين (MALDI) وتأين بالإرذاذ الإلكتروني (ESI) تستخدم للتأين 1،2. يتم الجمع بين تقنية MALDI عادة مع الوقت من الطيران (TOF) محلل. ومع ذلك، يقتصر تطبيق MALDI-TOF MS إلى أليغنوكليوتيد قصيرة (~ 25 النيوكليوتيدات (الإقليم الشمالي)) نظرا لتجزئة لاحق، وتشكيل ناتج إضافة وانخفاض التأين كفاءة 1،2. في المقابل، ESI ينطبق على أليغنوكليوتيد أطول (> 100 الإقليم الشمالي)، ولكن العديد من الدول المسؤولة عن مضاعفات اتهم الأيونات ([M-نيو هامبشاير] ن-) يتم إنتاجها في وقت واحد من الجزيئات الكبيرة الحيوية، وبالتالي كتلة تحليلها يمكن أن يتجاوز العلوي حدود النطاق م / ض لطيف. وهذا يتطلب تفسير أطياف معقد، أي التحول من سلسلة ولاية تهمة في الكتلة المقابلةعبر deconvolution.
في حالة قياس كتلة جزيء صغير، ذروة كتلة monoisotopic، أي كتلة جزيء يحتوي فقط النظير الأكثر شهرة من كل عنصر هو الأكثر وفرة ومراعاتها بشكل طبيعي 3. كما يزيد الوزن الجزيئي، والتحولات توزيع النظائر إلى أعلى م / ض وذروة monoisotopic يصبح تحجب الضوضاء الأساسي 3-5. مرة واحدة في ذروة monoisotopic لم يعد للكشف عن الجماهير أكبر من 10 كيلو دالتون 3، يتم استخدام متوسط الكتلة الجزيئية لقياس بدلا من الكتلة monoisotopic 5. في مثل هذه الحالات، وتوزيع النظائر التي يتم فصل كل القمم الفردية بنسبة 1 دا لا يمكن إلا أن تراعى عند محلل كتلة عالية الدقة مثل TOF، وتحويل فورييه تعديل ملكوت فخ محلل 6، أو تحويل فورييه الأيوني سيكلوترون صدى يستخدم محلل للتحليل. ومع ذلك، في ذروة الأكثر وفرة هي الصورةometimes لا تتفق مع متوسط الكتلة الجزيئية 5. هذه المشاكل يمكن أن يؤدي إلى صعوبة تحديد بدقة التحاليل.
ونظرا للتباين في وفرة طبيعية من النظائر المستقرة والصعوبات في تحديد متوسط الكتلة الجزيئية، وقياس كتلة monoisotopic مثالية لتوصيف الشامل من الجزيئات الحيوية 3،4. في الواقع، إذا كان ذروة monoisotopic يمكن ملاحظتها أو لا، فإن كتلة monoisotopic يمكن تقدير بمقارنة نمط توزيع النظائر لاحظت أن واحدة نظريا محسوب من تحليلها نموذج 4،7-10. أدرج الخوارزمية المناسب 8 الآن في البرمجيات الاحتكارية.
في سياق ESI-MS، يطلب من التفكك من الوجهين الحمض النووي وتنقية وتحلية للقياس المباشر لتجنب فشل التأين بسبب قمع أيون وناتج إضافة تشكيل 2،10-14. وهذه الإجراءات هي troublesome، ومع ذلك، فقد تم تطوير أنظمة التحليلية مؤتمتة بالكامل تجاريا تنطوي على تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، وإعداد العينات وESI-MS للكشف عن مسببات الأمراض 15-20. وثمة نهج آخر هو إدخال اللوني السائل (LC) للانفصال. يوفر LC على فصل على الانترنت من التحاليل من المواد التعايش ولا يتطلب إعداد عينة شاقة قبل التأين 21،22. ومع ذلك، والفصل بين الأحماض النووية باستخدام الطور المتحرك MS-متوافقة هو أكثر صعوبة من لمعظم مركبات أخرى مثل المخدرات، والببتيدات والبروتينات نظرا لطبيعة polyanionic من النيوكليوتيدات. وتشمل الأمثلة الأكثر نجاحا في LC / ESI-MS استخدام ايون الزوج عكس المرحلة LC. مرحلة الجوالة من 1،1،1،3،3،3-hexafluoro-2-بروبانول وقد اقترحت (HFIP) -triethylamine (TEA) -methanol في البداية من قبل Apffel وآخرون لفصل وكشف أليغنوكليوتيد قصيرة 23. تطبيق LC / ESI-MS التنميط الجيني لالتمايزوقد أبلغ ن الأنواع الممرض، الأشكال-النوكليوتيدات واحدة ويكرر قصيرة جنبا إلى جنب باستخدام الشعرية عمود البوليمر متراصة التي يمكن فصل أليغنوكليوتيد أطول 1،21،24-33.
في اليابان والولايات المتحدة، حدث تسمم غذائي خطير بسبب عدم التعرف وإعداد غير المناسب للينفوخية، وهذا على الرغم من حقيقة أن توزيع وإعداد ينفوخية يتم التحكم بدقة عن طريق التشريع سلامة الأغذية 34،35. وعلاوة على ذلك، وهو القتل العمد باستخدام مستخلص ينفوخية لم يحدث في اليابان 36. لذلك، لا بد من التفريق بين الأنواع ينفوخية من الصحة العامة وجهات النظر التحقيق والطب الشرعي. بالإضافة إلى ذلك، لأن rubripes سمك القراض أبعد ما تكون أكثر تكلفة من أنواع أخرى من ينفوخية، وهناك حاجة أيضا القدرة على التمايز في سياق تحقيقات الاحتيال الغذاء.
هنا، وهي طريقة مفصلة لتحديد موصفت كتلة onoisotopic منتج PCR بواسطة LC / ESI-MS باستخدام عكس المرحلة العمود السيليكا متراصة ومطياف الكتلة عالية الدقة. على وجه التحديد، وقد تم تطوير هذا النهج للسماح التفريق بين الأنواع السامة ينفوخية على أساس استخدام PCR طول تقييد جزء تعدد الأشكال (RFLP) طريقة 37، وهو أول مثال للتمايز الأنواع من الحيوانات باستخدام MS.
Protocol
1. استخراج الحمض النووي
ملاحظة: استخدام غرفة منفصلة لاستخراج الحمض النووي وبعد PCR الامتحانات مثل الكهربائي للهلام وLC / ESI-MS. إضافة الإيثانول لغسل العازلة 1 (التي تحتوي على جوانيداين هيدروكلوريد) وغسل العازلة 2 (لا تحتوي على جوانيداين هيدروكلوريد) وفقا لبروتوكول الحمض النووي عدة الاستخراج. وقد تم الحصول على عينات من الأسماك من تجار الجملة الأسماك وأسواق التجزئة في اليابان.
- ضع 30-50 ملغ من أنسجة الأسماك في أنبوب 0.5 مل أو microcentrifuge 1.5 مل. الاسكواش الأنسجة باستخدام ملعقة صغيرة (باستثناء فنلندا والجلد).
ملاحظة: في حالة زعنفة، استخدام أنبوب 0.5 مل لمدة النقع. - إضافة 180 ميكرولتر من العازلة تحلل و 40 ميكرولتر من بروتين كاف ودوامة لفترة وجيزة. احتضان عند 56 درجة مئوية على سخان كتلة لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها. مزيج لفترة وجيزة قبل vortexing كل 15 دقيقة أثناء الحضانة.
ملاحظة: تحلل الكامل ليست ضرورية. - أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 13000 ز س. بعد الطرد المركزي، وإذا كان عمو صغيرالاتحاد الوطني للعمال النفط موجود على السطح في حالة وجود عينة الدهنية مثل الكبد وتخلص منه. نقل طاف لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل جديد.
- إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت chaotropic تحتوي على جوانيداين هيدروكلوريد ومزيج من قبل vortexing. إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول (99.5٪) وخليط قبل vortexing مرة أخرى.
- نقل الخليط في عمود الدوران وضعت في أنبوب جمع 2 مل. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 13000 ز س. تجاهل التدفق من خلال.
تحذير: لا تقم بإضافة مواد التبييض للنفايات بسبب غوانيدين يمكن أن تشكل مركبات شديدة التفاعل مع التبييض. - إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة 1 (التي تحتوي على جوانيداين هيدروكلوريد) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 13000 ز س. تجاهل التدفق من خلال وأنبوب جمع.
- ضع عمود الدوران في أنبوب جمع 2 مل الجديدة المقدمة مع عدة. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة 2 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 20000 ز س. تجاهل التدفق من خلال أنبوب جمع. نقل عمود الدوران الى مستوى جديد1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
- الماصة 200 ميكرولتر من شطف العازلة إلى مركز للغشاء عمود الدوران. بعد 1 دقيقة، الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 6000 ز س.
- الماصة 50 ميكرولتر من شطافة إلى كفيت الأشعة فوق البنفسجية يمكن التخلص منها وقياس طيف الأشعة فوق البنفسجية من شطافة في 220-300 نانومتر، والامتصاصية في 260 نانومتر باستخدام مطياف.
- تحقق من طيف الأشعة فوق البنفسجية من الحمض النووي مع ذروة في 260 نانومتر. حساب تركيز الحمض النووي تقريبي باستخدام المعادلة بسيطة "تركيز الحمض النووي (نانوغرام / ميكرولتر) = الامتصاصية في 260 نانومتر × 50".
ملاحظة: تركيز الحمض النووي المستخرج من نموذجي زعانف ينفوخية هي 63 ± 30 نانوغرام / ميكرولتر (ن = 20). - إذا كان تركيز الحمض النووي هو أعلى من 10 نانوغرام / ميكرولتر، يخفف من عينات من الحمض النووي مع تريس، EDTA (TE) العازلة (درجة الحموضة 8) إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر.
- تخزين العينة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو الشروع في PCR التضخيم (القسم 2).
2. PCR
- إعداد 25 ميكرولتر PCR لكل EXTRتصرف عينة من الحمض النووي، ومراقبة إيجابية (0.2 ميكرومتر توليفها النوكليوتيد وجود تسلسل الهدف في TE العازلة درجة الحموضة 8.0) والسيطرة السلبية (المياه ultrapurified بدلا من عينة DNA) على الجليد كما في الجدولين 1 و 2 على مقعد نظيفة لتجنب التلوث.
ملاحظة: للحصول على عملية سهلة، وجعل كمية كافية من كوكتيل يحتوي على جميع الكواشف دون قالب الحمض النووي والاستغناء عن ذلك. استخدام الحمض النووي بوليميريز وجود نشاط التدقيق لتجنب إضافة 3 "ويتدلى على المنتج PCR. - تنفيذ PCR التضخيم على cycler الحرارية باستخدام برنامج دورة هو مبين في الجدول 3.
3. الأنزيمية الهضم
- إضافة 2 ميكرولتر من محلول يحتوي على 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، و 100 ملي MgCl 2 و 10 ملي dithiothreitol و 500 ملي مول كلوريد الصوديوم إلى حل PCR.
- إضافة 1 ميكرولتر من كل تقييد انزيم (ذراع الأول وMSP الأول) وتخلط بلطف. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بتاريخermal cycler على.
- احتضان لمدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية إلى تفعيل البلمرة DNA المتبقية، والتي تملأ نهاية لزجة الناتجة عن حركة مجتمع السلم أولا
- اختياري: تحليل كل منها 2.5 ميكرولتر من محلول التفاعل من قبل إس دي إس بايج باستخدام معدل عبر وصلة (٪ C، نسبة bisacrylamide) 3.33 (٪ بالوزن) وتركيز جل بولي أكريلاميد (٪ T) 15 (٪ ث / ت) 38. وصمة عار الجل باستخدام وصمة عار الحمض النووي الفلورسنت ومراقبة الحمض النووي المزدوج حبلا على نقل transilluminator الضوء الأزرق باستخدام شاشة العنبر.
- تصفية محلول التفاعل مع 0.2-0.5 ميكرون فلتر الطرد المركزي جهاز لمنع انسداد، الذي من شأنه أن يؤدي إلى تلف العمود التحليلي.
- نقل الترشيح إلى قارورة البولي بروبلين مدبب ومخزن في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
4. LC / ESI-MS تحليل
- تزن 67.2 غرام (حوالي 42 مل) من HFIP و1.52 غرام (حوالي 2.0 مل) من الشاي في زجاجة 1 لتر. إضافة 955 مل من الماء ultrapurified (LC / MS جرادي) ويقلب يستخدم محرك مغناطيسي حتى يتم حل الكواشف تماما. يأخذ قسامة من الحل والتحقق من الرقم الهيدروجيني (بين 7.85 و 7.95، من الناحية المثالية الرقم الهيدروجيني = 7.9) باستخدام مقياس درجة الحموضة.
ملاحظة: لا عودة قسامة إلى زجاجة لتجنب التلوث ايونات المعادن. إذا كان الرقم الهيدروجيني ليست 7.9، إضافة كمية صغيرة من أي HFIP أو الشاي لضبط درجة الحموضة وقياس درجة الحموضة مرة أخرى. - ربط الزجاجة على خط ألف من الكروماتوجرافي السائل مع تبريد زجاجة باستخدام ثلاجة محمولة التبريد المباشر (للاستخدام المنزلي) لمنع التبخر. اتصال آخر زجاجة مليئة الميثانول إلى خط B.
- ربط العمود الحرس والعمود التحليلي (2.0 × 50 مم، mesopore حجم = 30 نانومتر) إلى الكروماتوجرافي السائل. بدء تدفق المرحلة الأولى النقالة (95٪ A و 5٪ B) لكي تتوازن الأعمدة.
- إعداد 0.5 ملغ / مل الصوديوم trifluoroacetate (درجة الحموضة 3.5) باعتباره calibrant 39.
- تزن 50 ملغ (حوالي 34 ميكرولتر) من ميلان trifluoroaceticمعرف في كوب.
- إضافة 30 مل من الماء ultrapurified ويعاير إلى الرقم الهيدروجيني 3.5 وهيدروكسيد الصوديوم 10 ملم مع المعونة من متر الرقم الهيدروجيني.
- ملء تصل إلى 50 مل بالماء ultrapurified. إضافة 50 مل من الأسيتونتريل (LC / MS الصف) وتخلط.
- أخذ جزء من الحل العاملة وتخزينه في درجة حرارة الغرفة. تخزين ما تبقى من الحل في 4 درجات مئوية.
- خفض ضغط النيتروجين من C-فخ النحو التالي.
ملاحظة: الزوار تحويل فورييه الطيف الجماعية، والتي هي مناسبة لتحليل البروتين سليمة، لديك برنامج مراقبة للسيطرة على ضغط.- إزالة الغطاء العلوي الأيسر من مطياف الكتلة. صمام C-فخ في الزاوية من الصدارة نقاط.
- تحقق قيمة ارتفاع ضغط فراغ في إطار الحالة أداة من برامج التحكم.
ملاحظة: القيمة هي عادة، 3 × 10 -8 بار. - سحب مقبض لفتح وتحويل عكس اتجاه عقارب الساعة مقبض الباب ببطء شديد للحد من الصحافة فراغ عاليةلدى عودتهم إلى 1/3 (عادة، 1 × 10 -8 بار). ويجب أن يتغير الضغط أشار تدريجيا بطريقة تأخير. تجاهل رسالة تحذير حول الضغط المنخفض. دفع مقبض الباب لقفل.
- استعادة الغطاء العلوي للسلامة.
- معايرة مطياف الكتلة باستخدام trifluoroacetate الصوديوم 39.
ملاحظة: يمكن استبدال معايرة الكتلة اليومية من هذا البروتوكول، ومع ذلك، يجب أن يكون تم الانتهاء من معايرة أوصى المقترح من قبل المصنع قبل هذه المعايرة.- تعيين المعلمات المسح الضوئي وساخنة المعلمات مصدر ESI في السيطرة على المربع أداة للضبط برامج النحو التالي: نوع مسح كامل MS. مسح مجموعة م / ض 500-4،000. تجزئة (في المصدر التصادم الناجم عن تفكك (CID) الجهد 60 فولت، القطبية السلبية؛ السيارات السيطرة (AGC) تستهدف 1 × 10 6، الحد الأقصى للوقت حقن 50 ميللي ثانية، غمد معدل تدفق الغاز 5؛ اوكس معدل تدفق الغاز 0؛ الغاز الاجتياح معدل التدفق 0؛ رش الجهد 3 كيلوفولت؛ درجة حرارة الشعرية 320 ° C. S-عدسة الترددات الراديوية (RF) مستوى 100. درجة حرارة سخان 30 درجة مئوية.
- إدخال قائمة من الأيونات السالبة التي يتعين رصدها كما م / ض 792.85908، +1064.80870، +1336.75832، +1608.70794، +1880.65755، +2152.60717، +2424.55679، +2696.50640، +2968.45602، +3376.38045.
- نقل ESI التحقيق ساخنة أقرب إلى واجهة مطياف الكتلة (موقف B). ربط التحقيق والمحاقن مع أنبوب.
- لبث calibrant باستمرار بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مضخة الحقن المضمنة. تحقق فقط أيونات 6 أقل الجماعية (م / ض 792،85908-2٬152،60717) في الجدول المعايرة حسب الطلب.
- المضي قدما في المعايرة بعد استقرار شدة الإشارات. بعد المعايرة، تحقق سوى ستة أيونات الجماعية أعلى (م / ض 1٬880،65755 حتي 3٬376،38045) والمضي قدما في المعايرة. تجنب معايرة باستخدام جميع الأيونات في وقت واحد لتجنب الفشل.
- تعيين المعلمات المسح الضوئي وساخنة المعلمات مصدر ESI في السيطرة على المربع أداة للضبط برامج النحو التالي: نوع مسح كامل MS. مسح مجموعة م / ض 500-4،000. تجزئة (في المصدر التصادم الناجم عن تفكك (CID) الجهد 60 فولت، القطبية السلبية؛ السيارات السيطرة (AGC) تستهدف 1 × 10 6، الحد الأقصى للوقت حقن 50 ميللي ثانية، غمد معدل تدفق الغاز 5؛ اوكس معدل تدفق الغاز 0؛ الغاز الاجتياح معدل التدفق 0؛ رش الجهد 3 كيلوفولت؛ درجة حرارة الشعرية 320 ° C. S-عدسة الترددات الراديوية (RF) مستوى 100. درجة حرارة سخان 30 درجة مئوية.
- نقل التحقيق إلى appropriaموقف الشركة المصرية للاتصالات لمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة (موقف D) والاتصال إلى الكروماتوجرافي السائل مع أنبوب معدني خامل.
- تعيين المعلمات مصدر ESI ساخنة في السيطرة على المربع أداة للضبط برامج النحو التالي: غمد الغاز معدل تدفق 50؛ AUX معدل تدفق الغاز 15؛ اكتساح الغاز معدل التدفق 1؛ رذاذ الجهد 2.5 كيلو فولت. درجة الحرارة الشعرية 350 درجة مئوية. S-عدسة RF مستوى 100. درجة حرارة سخان 350 درجة مئوية.
- تعيين المعلمات الاستحواذ على مطياف الكتلة في إطار الإعداد فعال على النحو التالي: طريقة مدة 8 دقائق. تحويل صمام، 3،5-6 دقيقة لمطياف الكتلة، 0-3،5 و6-8 دقيقة إلى النفايات. وقت 3،5-6 دقيقة. قطبية سلبية. في مصدر CID الجهد 15.0 فولت. microscans 3؛ قرار السلطة الاسمية (في م / ض 200) 140000. AGC هدف 1 × 10 6؛ الحد الأقصى للوقت أيون 50 ميللي ثانية. عدد المسحات 1؛ مسح مجموعة م / ض 700-3،500. الطيف الشخصي نوع البيانات.
- تعيين المعلمات من الكروماتوجرافي السائل على النحو التالي: عمود درجة حرارة الفرن 20 درجة مئوية. sampl الدراسيه درجة حرارة علبة 10 درجة مئوية. برنامج التدرج 0-0،5 دقيقة 5٪ B، 0.5-1 دقيقة 5-30٪ B، 1-3،5 دقيقة 30-40٪ B، 3،5-5 دقيقة 40-98٪ B، 5-6 دقيقة 98٪ B، 6- 6.05 دقيقة 98-5٪ B، 6،05 حتي 8 دقيقة 5٪ B. معدل التدفق 0.4 مل / دقيقة.
- تطهير فقاعات من خلال الاستفادة من قيعان من قوارير. تعيين قارورة العينة على الرف العينة وحقن 1.0 ميكرولتر من عينة باستخدام الاوتوماتيكى لبدء تحليل.
- فتح ملفات البيانات الخام مع برنامج المتصفح والتأكد من أن جميع عمليات الاستحواذ الانتهاء بنجاح، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية.
ملاحظة: عادة، سوف يلاحظ اثنين أو ثلاث قمم في مجموع اللوني ايون الحالي في وقت الاحتفاظ 4-5،5 دقيقة عندما يتم تضخيمه بنجاح الحمض النووي ينفوخية وهضمها.
5. Deconvolution والتفسير
- بدء تشغيل البرنامج deconvolution. حدد نوع التجربة "استخراج السيارات (حل نظائريا)".
- تعديل أسلوب باستخدام المعلمات التالية: خرج M كتلة. S / N thresholد 3، عتبة الوفرة النسبية 0؛ شحنة سالبة نعم. حساب استخراج ايون اللوني الحالي (XIC) نعم؛ م / ض نطاق 700-3،500. تهمة الناقل H +. الحد الأدنى من تهمة الكشف عن 3؛ النظير نسبة النوكليوتيدات. لائقا عامل 80٪. عتبة تبقى 0٪. النظر في التداخل نعم. تهمة نطاق 3-50. الحد الأدنى من شدة 1؛ خطأ شدة المتوقع 3.
- حفظ كأسلوب جديد وتحديده.
- حدد الدليل حيث توجد ملفات البيانات الخام. حدد ملفات البيانات الخام ليتم تحليلها وانقر فوق "إضافة إلى قائمة الانتظار 'زر.
- انقر على زر "تشغيل" في علامة التبويب "تشغيل قائمة انتظار" لبدء deconvolution.
- بعد اكتمال قائمة الانتظار، تحديد صف وانقر على 'مفتوحة النتيجة "في التسمية التوضيحية العليا للحصول على نتائج deconvolution.
- تفسير النتائج من الجماهير monoisotopic المستمدة من قمم في وقت الاحتفاظ 4-5،5 دقيقة باستخدام الجدول 4.
Representative Results
تم تقييم ثلاثة أعمدة المتاحة تجاريا لفصل أليغنوكليوتيد] طويلة في معدلات تدفق من 100-400 ميكرولتر / دقيقة. A-مسام واسعة octadecyl سلسلة الكربون (C 18) عمود الجسيمات -bonded السيليكا (أ)، بولي المتاحة تجاريا (الستايرين divinylbenzene) (PS-DVB) عمود متراصة (ب) والسيليكا -bonded العمود متراصة C 18 ( ج) تمت مقارنة (الشكل 1). ثلاثة أزواج من الدوبلكس الحمض النووي (26 و 37 و 53 سنة مضت) تم فصل باستخدام كافة الأعمدة، وكانت تستخدم C 18 السيليكا -bonded العمود متراصة في دراسات لاحقة.
ممثل النتائج لتحليل عينة الحمض النووي المستخرج من عضلة T. ويرد rubripes في الشكل 2. قمم حل نظائريا، كما هو مبين في الشكل 2A، مطلوبة من أجل حساب كتلة monoisotopic بنجاح. النظرية والاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافمحكم monoisotopic كتلة T. وتظهر rubripes في الشكل 2B. لأنه يتم تنفيذ عملية الهضم مع نوكلياز داخلي بعد PCR التضخيم بغير طهور، شغل في نهاية 3'لزجة الناتجة عن نوكلياز داخلية MSP أنا مع بوليميريز الحمض النووي المتبقية. وفقا لتحليل amplicons مشتقة من قوالب الحمض النووي الاصطناعية، وتراوحت دقة الجماعية من -2.48 إلى 2.40 جزء في المليون (0.62 ± 0.74 جزء في المليون في المتوسط، ن = 280). وهكذا، تم استخدام التسامح الشامل من 3 جزء في المليون للتمييز بين الأنواع (الجدول 4). باستخدام الجدول، والتمييز بين كل من العينات ينفوخية تم الحصول عليها من الأسواق والمحلات التجارية على نحو سليم وأنواع محددة 37.
وفقا لتحليل دوري للعينة التي تم الحصول عليها من القالب الحمض النووي الاصطناعي من T. ذهبية العيون، تم تحديد جميع الجماهير monoisotopic من التحاليل بنجاح داخل ± 3 جزء في المليون لفي لوأست 180 ساعة دون أي معايرة الجماعية (الشكل 3). وهذا يعني أن معايرة الجماعية سيكون مطلوبا على أساس أسبوعي.
الشكل 1: مجموع الاستشرابية أيون الحالية للمنتج PCR-RFLP المستمدة من القالب الحمض النووي توليفها من T. pardalis باستخدام عمود C 18 -bonded جسيمات السيليكا (أ، 3 × 250 ملم، وحجم الجسيمات 3 ميكرون)، بولي (الستايرين divinylbenzene) (PS-DVB) عمود متراصة (ب، 1.0 × 250 مم) وC 18 -bonded العمود متراصة السيليكا (ج، الطريقة الحالية) شروط (أ): معدل تدفق 0.2 مل / دقيقة. نسبة الميثانول، 0-2 دقيقة 5٪، 2-5 دقيقة 5٪ -25٪، 5-20 دقيقة 25٪ -40٪، 20-35 دقيقة 40٪ -98٪، 35-50 دقيقة 98٪، 50- 51 دقيقة 98٪ -5٪، 51-65 دقيقة 5٪. شروط (ب):معدل التدفق 0.1 مل / دقيقة. نسبة الميثانول، 0-2 دقيقة 5٪، 2-5 دقيقة 5٪ -25٪، 5-35 دقيقة 25٪ -40٪، 35-40 دقيقة 40٪ -98٪، 40-55 دقيقة 98٪، 55- 56 دقيقة 98٪ -5٪، 56-70 دقيقة 5٪. كانت درجة الحرارة لكلا العمودين 20 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ممثل النتائج لتحليل العضلات الخام من T. rubripes (أ) النموذجية الاستشرابية الحالية الكلي أيون والطيف الكتلي. (ب) النظرية وقياس الجماهير monoisotopic من المنتجات PCR-RFLP المستمدة من القالب الحمض النووي توليفها من T. rubripes. الرجاء انقر هنا لعرض كبيرة نسخة ص من هذا الرقم.
الرقم 3: اختبار الاستقرار إستفتاء amplicons المستمدة من الحمض النووي الاصطناعي من T. وقد تم تحليل ذهبية العيون كل 10 ساعة. لم يتم تنفيذ معايرة الجماعية أثناء الاختبار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | تسلسل |
| lago86F | 5'-CCATGTGGAATGAAAACACC-3' |
| taki114F | 5'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA-3' |
| fugu86-114R | 5'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3' |
ether.within الصفحات = "1"> الجدول 1: PCR الاشعال.
| PCR الكاشف | حجم استخدامها | التركيز النهائي |
| المياه Ultrapurified | 15.75 ميكرولتر | |
| خالية من المنظفات 5X العازلة | 5.0 ميكرولتر | 1X |
| مزيج dNTP (10 ملم لكل منهما) | 0.5 ميكرولتر | 0.2 ملم |
| مزيج التمهيدي (10 ميكرومتر كل من lago86F، taki114F وfugu86-114R في TE العازلة درجة الحموضة 8.0) | 1.0 ميكرولتر | 0.4 ميكرومتر كل |
| الحمض النووي بوليميريز (2.5 وحدة / ميكرولتر) | 0.25 ميكرولتر | 0.1 وحدة / ميكرولتر |
| قالب الحمض النووي في TE العازلة درجة الحموضة 8.0 (5،0 حتي 10 نانوغرام / ميكرولتر لعينة المستخرجة، 0.2 ميكرومتر لالحمض النووي الاصطناعي كما تحكم إيجابية) | 2.5 ميكرولتر | 0.5-1.0 نز / ميكرولتر الحمض النووي المستخرج و 20 نانومتر لالحمض النووي الاصطناعي |
| مجموع: 25 ميكرولتر |
الجدول 2: مكونات نطاق 25 ميكرولتر PCR.
| دورة | شرط | وظيفة |
| 1 | 2 دقيقة في 95 ° C | تمسخ الأولي |
| 2 | 30 ثانية في 95 درجة مئوية | تمسخ |
| 3 | 30 ثانية في 56 درجة مئوية | الصلب |
| 4 | 30 ثانية في 72 درجة مئوية | استطالة |
| 5 | كرر 2-4 (تماما 30 دورات) | |
| 6 | 7 دقيقة في 72 ° C | الاستطالة النهائية |
| 7 | عقد في 12 درجة مئوية حتى إزالة عينة |
الجدول 3: برنامج PCR.
| عدد الذروة في وقت الاحتفاظ 4،0-5،5 دقيقة | كتلة Monoisotopic الذروة الثالثة في مجموعة (دا) | كتلة Monoisotopic من الذروة الثانية في مجموعة (دا) | الأنواع ينفوخية | ||
| حبلا أصغر | حبلا أكبر | حبلا أصغر | حبلا أكبر | ||
| 2 | → | → | 15890،707 حتي 15890،803 | 16177،531 حتي 16177،629 | L. العزلاء |
| 15921،702 حتي 15921،797 | 16146،537 حتي 16146،634 | L. gloveri | |||
| 15930،713 حتي 15930،809 | 16137،525 حتي 16137،622 | lunaris L. | |||
| 15937،697 حتي 15937،792 | 16131،537 حتي 16131،634 | L. wheeleri | |||
| 24173،034 حتي 24173،179 | 24566،905 حتي 24567،053 | ذهبية العيون T. | |||
| 3 | 16295،706 حتي 16295،804 | 16467،610 حتي 16467،709 | 11341،851 حتي 11341،919 | 11466،875 حتي 11466،944 | T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus |
| 11654،908 حتي 11654،978 | 11770،920 حتي 11770،991 | niphobles T. | |||
| 16296،701 حتي 16296،799 | 16468،605 حتي 16468،704 | → | → | rubripes T. | |
| 16311،701 حتي 16311،799 | 16452،610 حتي 16452،709 | → | → | T. poecilonotus T. exascurus | |
| 16320،713 حتي 16320،811 | 16443،599 حتي 16443،697 | → | → | T. porphyreus T. obscurus | |
| 16599،751 حتي 16599،851 | 16780،667 حتي 16780،767 | → | → | T. الدويدية | |
الجدول 4: تمايز ينفوخية من الجماهير monoisotopic المستمدة من LC / ESI-MS.
الجدول 5: تضخيم تسلسل الحمض النووي (أ) تسلسل مطابق ل.أن الأنواع ينفوخية أخرى كما هو موضح في الجدول رقم (4). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
Discussion
لاستخراج الحمض النووي، ويتم استخدام عدة التجارية لاستخراج الحمض النووي من الدم والأنسجة وفقا للبروتوكول من الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة (كمية بروتين كاف والطرد المركزي من حل تحلل). ومع ذلك، أي عدة استخراج يمكن استخدامها طالما يمكن استخراج الحمض النووي الخلوي مع الانتعاش والنقاء المناسب لPCR. وقد تم اختبار هذه الطريقة باستخدام العضلات، وفنلندا، والكبد، والمبيض، والجلد 37. الزعنفة هو مناسبة خاصة بسبب مساحة كبيرة، والتي تمكن تحلل السريع مع بروتين K. الطازجة أو المجمدة أو المجففة، والمغلي وتم اختبار عينات ينفوخية خبز بنجاح 37.
تم تصميم التمهيدي مجموعة PCR (الجدول 1) لينفوخية وتضخيم 16S الميتوكوندريا الريباسي الجينات الحمض النووي الريبي ينفوخية. الحمض النووي الهدف لتضخيم هو 114-115 سنة مضت (جنس سمك القراض) و 86 سنة مضت (جنس Lagocephalus) (جدول رقم 5). لتسهيل طريقة الإنمائية لل الإقليم الشمالي، واستخدمت أليغنوكليوتيد] توليفها وجود تسلسل الهدف للإشارة بدلا من جمع العينات ينفوخية الأصيلة. يمكن استبدال مجموعة التمهيدي التي كتبها التمهيدي مجموعة أخرى استجابة لهذا الغرض، ومع ذلك، يجب أن يكون طول الحمض النووي النهائي بعد الهضم الأنزيمي أقل من 100 الإقليم الشمالي من حيث الحفاظ على جودة الطيف الكتلي اللازمة لdeconvolution ناجحة. بالإضافة إلى ذلك، ضغط النيتروجين في C-فخ ينبغي خفض عندما النوكليوتيد الهدف هو أطول من حوالي 75 الإقليم الشمالي ونوعية الطيف الكتلي ليست كافية لdeconvolution ناجحة. يمكن السيطرة على هذه القيود من خلال التطورات الأخيرة في مجال البرمجيات الصك، وإلا فإن صمام لC-فخ داخل الهيكل يجب ضبطها كما هو موضح في قسم البروتوكول. أما بالنسبة لإعداد العينات، واستخدام الكواشف خالية من المنظفات أمر بالغ الأهمية لLC لاحق من حيث ذروة الشكل المناسب، ذروة كثافة كافية ومستقرة الوقت الاحتفاظ 31.
معشوقة = "jove_content"> وPS-DVB الشعرية متراصة العمود 21،24-33، وهي C 18 العكسية المرحلة جسيمات السيليكا العمود 23،40،41 واللوني التفاعل مسعور (HILIC) وقد استخدمت العمود 42 لLC / تحليل ESI-MS من أليغنوكليوتيد]. من بينها، والعمود الشعري متراصة متفوقة على غيرها من حيث القدرة الانفصال، ومع ذلك، تم اتخاذ العمود الشعري متراصة المستخدمة في الدراسات السابقة في البيت وتعمل في معدل تدفق منخفض (2 ميكرولتر / دقيقة)، الأمر الذي يتطلب الأجهزة مخصص لLC الجزئي. لتسهيل عملية سهلة، وجرى تقييم الأعمدة المتاحة تجاريا لفصل أليغنوكليوتيد] طويلة في ارتفاع معدلات تدفق (100-400 ميكرولتر / دقيقة). تم فصل ثلاثة أزواج من الدوبلكس الحمض النووي (26 و 37 و 53 سنة مضت) باستخدام الأعمدة المذكورة أعلاه، ومع ذلك، كانت دورة مرات من -bonded العمود C 18 جسيمات السيليكا والعمود PS-DVB متراصة 65 و 70 دقيقة على التوالي ، في حين أن من C
يستخدم ايون الزوج اللوني عادة لفصل MS-متوافق من أليغنوكليوتيد]. ومع ذلك، كاشف ايون الزوج يتدخل بشكل عام مع عملية ESI ويقلل حساسية ESI-MS. لذلك، كثيرا ما يستخدم HFIP للمرحلة الجوالة لتحسين حساسية النوكليوتيد. ومع ذلك، HFIP (نقطة الغليان 59 ° C) يبخر بسرعة في واجهة من قبل (نقطة الغليان 65 درجة مئوية) الميثانول، وبالتالي، هذه الخسارة من المذيبات يزيد درجة الحموضة وتشجع الانفصال كاشف ايون الزوج (أي الشاي)من النوكليوتيد. لأن الطريقة الحالية توظف ESI التحقيق ساخنة، التي nebulizes شطافة مع غاز النيتروجين الساخن في 350 درجة مئوية، قد يكون وأكد الإفراط في هذا الشأن. بدلا من العازلة HFIP-TEA، أوصى إرب وOberacher خلات cyclohexyldimethylammonium (CycHDMAA، ودرجة الحموضة 8.4) للتحليل التنميط الجيني بسبب انخفاض في تشكيل ناتج إضافة مع أيونات المعادن النزرة 33. الكتاب استنتجوا أن CycHDMAA نفسها قمع تشكيل ناتج إضافة المعادن. وعلى الرغم من الأدب، لم يحترم تشكيل ناتج إضافة هامة في هذا الأسلوب. بالإضافة إلى ذلك، فإن الفائدة التي شهدها نظام HFIP-TEA-الميثانول هو أن ذروة المنطقة التي تم الحصول عليها مع نظام HFIP-TEA-الميثانول وكان 17 مرات أكبر من تلك التي تم الحصول عليها من نظام CycHDMAA-الأسيتونتريل عند تحليل وamplicon 86 سنة مضت من T. poecilonotus (لا تظهر البيانات). عيب واحد من نظام HFIP-TEA-الميثانول، ومع ذلك، هو زيادة تكلفة بالنسبة للنظام CycHDMAA الأسيتونتريل.
حساب كتلة monoisotopic يتطلب الفصل بين قمم النظائر من الأيونات تتضاعف. لذلك، القرار هو أمر حاسم لهذا التحليل. وعلى الرغم من قوة قرار المطلوبة تعتمد على طول الزوج قاعدة تحليلها، تحليل TOF التقليدية، التي لديها قوة قرار من عدة عشرات من الآلاف، قد تكون محدودة لتحليل أليغنوكليوتيد قصيرة.
حسبت الجماهير monoisotopic النظرية هو مبين في الجدول رقم 4 من المؤلفات قاعدة المقابلة من التحاليل. بدلا من ذلك، Muddiman آخرون بتطوير تطبيق برنامج لحساب تكوين قاعدة من كتلة دقيقة 43. تم دمج برنامج مماثل في الآلي النظام ESI-MS 16-18. استخدام هذه الخوارزميات قد يحسن متانة الأسلوب الحالي لكتلة monoisotopic قياس لا تتطابق دائما إلى قاعدة فريدة من نوعها تكوين سالجناح إلى التسامح الشامل من 3 جزء في المليون الناجمة عن خطأ في القياس لا مفر منه. لسوء الحظ، لم نتمكن من الحصول على هذه البرمجيات لهذه الدراسة.
وmonoisotopic تحديد الأنواع الحالي القائم على كتلة قد تكون مناسبة ليس فقط لتمايز ينفوخية ولكن أيضا للكشف عن الأشكال الأخرى الحمض النووي لأنه يعتمد الأسلوب الحالي على تحليل تكوين قاعدة، وليس فيها إجراء صممت خصيصا لينفوخية. أما بالنسبة للكشف عن تعدد الأشكال الحمض النووي، ونظام ESI-MS مخصص هو مؤتمتة بالكامل وسهلة التشغيل، والتي قد تكون مناسبة للاستخدام التشخيص مثل الكشف عن مسببات الأمراض 15،17،18،20،30. على العكس من ذلك، هذا الأسلوب هو ممكن مع الأدوات المشتركة الأبحاث وأجهزة، وبالتالي، ومناسبة لاستخدامات البحوث. وقد تم بالفعل تطبيق ESI-MS إلى تعدد الأشكال الحمض النووي البشري مثل واحد 13،28،32 النوكليوتيدات تعدد الأشكال، قصيرة جنبا إلى جنب تكرار 26والحمض النووي analsis 16،19. تم تحليل الحمض النووي الريبي الصغيرة أيضا عن طريق الشعيرات الدموية LC / ESI-MS 44. ويمكن أيضا أن تتحقق هذه التطبيقات التي نشرتها الأسلوب الحالي. وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون هذه الطريقة مناسبة لرصد التفاعل بين النوكليوتيد ومنخفضة الوزن الجزيئي المركبات، مثل تفاعل المضادات الحيوية والحمض النووي الريبي الريباسي 45 بسبب فصل درجات الحرارة المنخفضة. في مثل هذه الحالات، أليغنوكليوتيد والمركبات منخفضة الوزن الجزيئي يجب أن يتم الكشف في وقت واحد، والذي هو ميزة استخدام LC / ESI-MS.
هناك قيد أن الأجهزة غير مناسب لإجراء تحليل الموازي كما في التقنيات التقليدية مثل سانجر تسلسل وفي الوقت الحقيقي PCR. بالإضافة إلى ذلك، يحدد المنهج الحالي تكوين قاعدة الوحيد وأي استبدال قاعدة داخل نفس الجزيء لا يمكن تمييزها. ومع ذلك، فإن تحليل الحمض النووي يستند إلى MS-الموصوفة هنا قد لا تزال لديها الجدارة في المدىالصورة الدقة في المقارنة مع الحمض النووي ملزمة التقنيات المعتمدة صبغ مثل الكهربائي للهلام وفي الوقت الحقيقي PCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
| TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
| PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
| Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
| Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
| Detergent Free 5x Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
| Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
| dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
| 10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
| Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
| Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
| Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
| Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
| Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
| UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
| Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
| Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
| 300 μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
| Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
| Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
| Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
| Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
| ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
| Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
| Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
| Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
| Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
| Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |
References
- Oberacher, H. On the use of different mass spectrometric techniques for characterization of sequence variability in genomic DNA. Anal. Bioanal. Chem. 391, 135-149 (2008).
- Banoub, J. H., Miller-Banoub, J., Jahouh, F., Joly, N., Martin, P. Chapter 1, Overview of recent developments in the mass spectrometry of nucleic acid and constituents. Mass spectrometry of nucleosides and nucleic acids. Banoub, J. H., Limbach, P. A. 1, CRC Press. 1-90 (2010).
- Yergey, J., Heller, D., Hansen, G., Cotter, R. J., Fenselau, C. Isotopic distributions in mass spectra of large molecules. Anal. Chem. 55, 353-356 (1983).
- Zubarev, R. A., Demirev, P. A. Isotope depletion of large biomolecules: Implications for molecular mass measurements. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 149-156 (1998).
- Null, A. P., Muddiman, D. C. Determination of a correction to improve mass measurement accuracy of isotopically unresolved polymerase chain reaction amplicons by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 1714-1722 (2003).
- Hu, Q., Noll, R. J., Li, H., Makarov, A., Hardman, M., Cooks, R. G. The Orbitrap: a new mass spectrometer. J Mass Spectrom. 40, 430-443 (2005).
- Senko, M. W., Beu, S. C., McLaffertycor, F. W. Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6, 229-233 (1995).
- Horn, D. M., Zubarev, R. A., McLafferty, F. W. Automated reduction and interpretation of high resolution electrospray mass spectra of large molecules. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, 320-332 (2000).
- Frahm, J. L., Mason, C. J., Muddiman, D. C. Utility of accurate monoisotopic mass measurements to confidently identify lambda exonuclease generated single-stranded amplicons containing 7-deaza analogs by electrospray ionization FT-ICR mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 234, 79-87 (2004).
- Frahm, J. L., Muddiman, D. C. Nucleic Acid analysis by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry at the beginning of the twenty-first century. Curr. Pharm. Des. 11, 2593-2613 (2005).
- Null, A. P., George, L. T., Muddiman, D. C. Evaluation of sample preparation techniques for mass measurements of PCR products using ESI-FT-ICR mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 338-344 (2002).
- Null, A. P., Benson, L. M., Muddiman, D. C. Enzymatic strategies for the characterization of nucleic acids by electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 2699-2706 (2003).
- Manduzio, H., Ezan, E., Fenaille, F. Evaluation of the LTQ-Orbitrap mass spectrometer for the analysis of polymerase chain reaction products. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 3501-3509 (2010).
- Manduzio, H., Martelet, A., Ezan, E., Fenaille, F. Comparison of approaches for purifying and desalting polymerase chain reaction products prior to electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Biochem. 398, 272-274 (2010).
- Hofstadler, S. A., et al. TIGER: the universal biosensor. Int. J. Mass Spectrom. 242, 23-41 (2005).
- Eduardoff, M., et al. Mass spectrometric base composition profiling: Implications for forensic mtDNA databasing. Forensic Sci. Int. Genet. 7, 587-592 (2013).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J. Clin. Microbiol. 51, 40-45 (2013).
- Legoff, J., et al. Broad-range PCR-electrospray ionization mass spectrometry for detection and typing of adenovirus and other opportunistic viruses in stem cell transplant patients. J. Clin. Microbiol. 51, 4186-4192 (2013).
- Kiesler, K. M., Coble, M. D., Hall, T. A., Vallone, P. M. Comparison of base composition analysis and Sanger sequencing of mitochondrial DNA for four U.S. population groups. Forensic Sci. Int. Genet. 8, 226-232 (2014).
- Bacconi, A., et al. Improved sensitivity for molecular detection of bacterial and Candida infections in blood. J. Clin. Microbiol. 52, 3164-3174 (2014).
- Huber, C. G., Oberacher, H. Analysis of nucleic acids by on-line liquid chromatography-mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 20, 310-343 (2001).
- Pourshahian, S., McCarthy, S. M. Chapter 4, Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography and mass spectrometry. Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products. Bonilla, J. V., Srivatsa, G. S. , CRC Press, Chapter. 137-166 (2011).
- Apffel, A., Chakel, J. A., Fischer, S., Lichtenwalter, K., Hancock, W. S. Analysis of Oligonucleotides by HPLC-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 69, 1320-1325 (1997).
- Premstaller, A., Oberacher, H., Huber, C. G. High-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry of single- and double-stranded nucleic acids using monolithic capillary columns. Anal. Chem. 72, 4386-4393 (2000).
- Oberacher, H., Oefner, P. J., Parson, W., Huber, C. G. On-Line Liquid Chromatography Mass Spectrometry: A Useful Tool for the Detection of DNA Sequence Variation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 3828-3830 (2001).
- Oberacher, H., Parson, W., Muhlmann, R., Huber, C. G. Analysis of polymerase chain reaction products by on-line liquid chromatography-mass spectrometry for genotyping of polymorphic short tandem repeat loci. Anal. Chem. 73, 5109-5115 (2001).
- Oberacher, H., Huber, C. G. Capillary monoliths for the analysis of nucleic acids by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Trends Anal. Chem. 21, 166-174 (2002).
- Oberacher, H., et al. Re-sequencing of multiple single nucleotide polymorphisms by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 30, e67 (2002).
- Oberacher, H., Parson, W., Holzl, G., Oefner, P. J., Huber, C. G. Optimized suppression of adducts in polymerase chain reaction products for semi-quantitative SNP genotyping by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 1897-1906 (2004).
- Mayr, B. M., et al. Identification of bacteria by polymerase chain reaction followed by liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 4563-4570 (2005).
- Oberacher, H., Niederstatter, H., Casetta, B., Parson, W. Some guidelines for the analysis of genomic DNA by PCR-LC-ESI-MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 124-129 (2006).
- Beer, B., et al. CYP2D6 genotyping by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 400, 2361-2370 (2011).
- Erb, R., Oberacher, H. Comparison of mobile-phase systems commonly applied in liquid chromatography-mass spectrometry of nucleic acids. Electrophoresis. 35, 1226-1235 (2014).
- Cohen, N. J., et al. Public health response to puffer fish (Tetrodotoxin) poisoning from mislabeled product. J. Food Prot. 72, 810-817 (2009).
- Cole, J. B., et al. Tetrodotoxin poisoning outbreak from imported dried puffer fish--Minneapolis, Minnesota 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 63, 1222-1225 (2015).
- Ohno, Y., et al. The influence of tetrodotoxin on the toxic effects of aconitine in vivo. Tohoku J. Exp. Med. 167, 155-158 (1992).
- Miyaguchi, H., Yamamuro, T., Ohta, H., Nakahara, H., Suzuki, S. Genotyping of Toxic Pufferfish Based on Specific PCR-RFLP Products As Determined by Liquid Chromatography/Quadrupole-Orbitrap Hybrid Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem. 63, 9363-9371 (2015).
- Sambrook, J. F., Russell, D. W. Neutral polyacrylamide gel electrophoresis. in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 40-46 (2001).
- Moini, M., Jones, B. L., Rogers, R. M., Jiang, L. Sodium trifluoroacetate as a tune/calibration compound for positive- and negative-ion electrospray ionization mass spectrometry in the mass range of 100-4000 Da. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 977-980 (1998).
- Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 646-653 (2003).
- Chen, B., Bartlett, M. G. Evaluation of mobile phase composition for enhancing sensitivity of targeted quantification of oligonucleotides using ultra-high performance liquid chromatography and mass spectrometry: application to phosphorothioate deoxyribonucleic acid. J. Chromatogr. A. 1288, 73-81 (2013).
- Gong, L., McCullagh, J. S. Analysis of oligonucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to negative ion electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1218, 5480-5486 (2011).
- Muddiman, D. C., Anderson, G. A., Hofstadler, S. A., Smith, R. D. Length and base composition of PCR-amplified nucleic acids using mass measurements from electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 69, 1543-1549 (1997).
- Kullolli, M., Knorf, E., Arampatzidou, M., Tewari, M., Pitteri, S. J. Intact MicroRNA analysis using high resolution mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 80-87 (2013).
- Cummins, L. L., Chen, S., Blyn, L. B., Sannes-Lowery, K. A., Drader, J. J., Griffey, R. H., Hofstadler, S. A. Multitarget affinity/specificity screening of natural products: finding and characterizing high-affinity ligands from complex mixtures by using high-performance mass spectrometry. J. Nat. Prod. 66, 1186-1190 (2003).
