Introduction
その小さいながらも複雑な神経系との線虫は行動を含む神経生物学の多くの側面を理解するための強力なツールを証明しています。この研究の多くは、異なる挙動の富が正常解剖と分析されたモデル生物線虫（Caenorhabditis elegans）に焦点を当てています。これらは3、走化性4、thermotactic 5,6と走磁性7は 10と給電行動11の学習、8,9を交配影響を与える機械刺激が含まれます。しかしながら、他のより遠縁の線虫種はrhabditid C.において観察されていない行動を表示しますエレガンスまたは代替的には、彼らの進化と規制に関する適切な質問を提起複雑さの追加レベルを示しています。このような1つのインスタンスは、はるかに複雑給電することが表示され遠縁diplogastrid線虫Pristionchus pacificus、で観察することができますC.で観察されるよりもhaviorsとリズム両種は、相同な咽頭ニューロン12を共有するにもかかわらず、 エレガンス1。です。これらの追加の摂食行動、P.と一致彼らはまた、他の線虫の幼虫に供給することにより、それらの細菌の食事を補うことのできる熱心な捕食者であるとしてpacificusはまた、拡大食事の範囲を表示します。幸いなことに、P。 pacificusは、比較と統合進化生物学のモデルとして開発されているので、多くの分子および遺伝学的ツールが利用可能になりました。これらは、その新たに発見された姉妹種を含む25以上の近縁種と導入遺伝子14およびCRISPR / Cas9 15,16だけでなく、詳細かつ十分に注釈を付け系統発生17を含む分子や遺伝子ツールを完全に配列決定し、注釈付きのゲノム13が含まれます。また、多数のPristionchus種の生態は、Pを含みますpacificusは、私たちです多くの種で定義されたllが今スカラベカブトムシとnecromenic協会、彼らは頻繁に他の線虫種18と共有するホストを共有して説明した。P. pacificusは、したがって、小説行動の進化とその生態学的意義を分析する優れたモデル系を提供します。
このようなP.などの線虫種における捕食摂食行動を分析するために、 pacificusは、我々は簡単に観察し、捕食行動の定量化のためのいくつかの新規な行動アッセイを開発しました。 P.としてpacificusは強く正しい形態型の識別が不可欠1,2である、捕食行動に影響を与える二形口の構造が表示されます。狭い口のstenostomatousモーフは、単一の鈍背側の歯が含まれており、任意の捕食送りに従事していません。また、広口eurystomatousモーフは、はるかに大きな爪状の背側の歯と反対側の追加を含み一緒に効率的に獲物のキューティクルを開くように動作するサブ腹歯、。非捕食stenostomatous形に捕食eurystomatousの比率は、P内でもPristionchus種間で異なり、 pacificus、しかし、eurystomatous口の割合はP.にモーフィング90％2 - pacificus野生型株（PS312）は、通常70です。また、口の形比は（飢餓といくつかの小さな分子のシグナル伝達だけでなく、未知の要因を含む両方が知られている、）環境の影響の違いに応じて変動することができ、このように捕食eurystomatous口の形の正確な同定および単離は、成功した捕食性アッセイのために不可欠です。
捕食口の形の記述と並んで、私たちは、直接観察や、かむ殺害し、イベントを供給するなどの捕食行動の定量化のための「一口アッセイ」を開発しました。ここで獲物の線虫は、フィルタを介して分離されています新たに飢えた文化のると捕食成人Pにさらさ短い時間スパンで一緒に観察されるpacificus、。また、我々はまた、捕食イベントの間接的な観察によって捕食行動の迅速なスクリーニングを容易にするためのハイスループット「死体アッセイ」を開発しました。これは、捕食のためにスクリーニングするためのツールとして、幼虫の死体の存在を利用しています。両アッセイは、P.などの線虫種で略奪行為を観察し、測定するための簡単かつ再現性の高い方法を提供しますpacificus。
Protocol
1.口の形の表現型
- アガロースパッド上の口フォーム識別
注：、線虫の口のモーフを視覚化アガロースパッド上に軽度の麻酔薬治療とワームを固定化し、次のように観察するために。- 成長し、このようなP.などの線虫の文化を維持E.の細菌の芝生の上に6センチメートル上pacificus標準線虫の増殖培地（NGM）プレートとフィード大腸菌 OP50 19。
- 最初の3ミリリットルの2％アガロース溶液を作るために15ミリリットルチューブに3ミリリットルのH 2 Oに0.06グラムアガロースを追加することにより、アガロースのパッドを作ります。これは、4℃で一年まで保存することができます
- 混合し、電子レンジで徹底的にアガロースを溶融または代わりに> 88℃に設定したヒートブロックを使用
- 完全に溶けたら、アガロースに10％のアジ化ナトリウム溶液10μlを加え、よく混ぜます。注意：ドライアジ化ナトリウムは、反応性であり、すべてのフォームは有毒です。
- 1ミリリットルを使用しましたマイクロピペットは、標準的な顕微鏡用スライドガラスの中央に液体アガロースアジドミックスの無未満300μlと低下を置きます。
- 寒天が冷える前に、素早く冷却時にパッドを形成し、アガロースを平坦化するためのドロップの上に第二の顕微鏡スライドを配置します。必要とされるなど、多くのパッドに対して繰り返します。
- 互いにそれらをスライドさせることにより、ピール離れてガラス顕微鏡スライドを使用する直前。注：アガロースパッドが事前にすぎ用意されている場合、それらは過度に乾燥することができ、線虫を破損する恐れがあります。
- パッドの中心に - （3μL2）麻酔アガロースパッドにワームを転送するには、M9バッファのドロップを置きます。ピック2から3若いP.パッド上で慎重にカバースリップを配置する前にM9の低下に大人をpacificus。 P. pacificus線虫は、アガロースに固定化し、可視化できるようになります。
- 適切な顕微鏡aに麻酔をかけたワームを含む顕微鏡スライドを転送ND 63Xノマルスキー光学系の下で観察します。以下のような特徴に基づいて、モーフのアイデンティティを分類：単一の背側の歯と狭い口の開口部の存在はstenostomatousを示しながら、追加のサブ腹歯の存在は、拡大された背側の歯と広口開口部は、eurystomatous口モーフ動物の指標であります動物（ 図1）。
注：動物の健康を維持するために、ワームはわずか5分間寒天パッドの上に維持されるべきです。 - 口のモーフ識別した後、静かにアガロースパッドを、それをオフにスライドさせることにより、カバースリップを除去することにより、必要に応じてeurystomatousまたはstenostomatousいずれかの線虫を回復。慎重アガロースパッドから選択した動物を選ぶ新鮮なNGMプレート上に（ 大腸菌 OP50は、それが粘着性作るためにピックで使用することができます）。通常の運動性の行動は動物がさらなる略奪的アッセイのために準備ができているその上に再開されるまで、麻酔からの回復を可能にします。
<LI> ラピッド口表現型 - E.の細菌叢と標準NGMプレート上で線虫を置き顕微鏡の視野領域上に大腸菌 OP50。
- 口の大きさと幅の差を検出します。注：構造体のような全く歯がしたがって、口のモーフ識別は単に狭い口対広い口に基づいて観察することがない。この倍率では。
注：別の方法として、より多くの経験と、口のフォームタイプは、高倍率（150X）と実体顕微鏡を介して任意の麻酔薬治療を必要とせずにアッセイすることができます。
2.咬合アッセイ
注：噛みアッセイは、詳細な捕食行動分析を可能にします。
- 成長し、標準的なNGMプレート（6 cm）の上の線虫の文化を維持し、 大腸菌の細菌叢を餌大腸菌 OP50 19。
- Cなどの選択獲物線虫の幼虫を大量に増殖させることによって、アッセイプレートを作りますエレガンスまたはアルternatively適切な生態学的関連獲物。注：アダルトC.エレガンスは 、幼虫期を使用することが重要ですので、適切な獲物であるには余りにも大きいです。
- C.を維持エレガンスまたはEの細菌の芝生の上の標準的なNGMプレートとフィード上の他の潜在的な餌生物人口まで大腸菌 OP50を新たに若いL1幼虫の豊富さで、その結果、飢餓状態にされています。
注：飢餓のための時間は、培養を開始するために使用される線虫の数、 大腸菌の量を含む多数の環境と実験の要因に依存します大腸菌 OP50を加え、周囲温度。
- C.を維持エレガンスまたはEの細菌の芝生の上の標準的なNGMプレートとフィード上の他の潜在的な餌生物人口まで大腸菌 OP50を新たに若いL1幼虫の豊富さで、その結果、飢餓状態にされています。
- M9で4以上の新たに飢えた獲物プレートを洗浄し、15mlチューブに収集する前に、すべての大型動物と残りの卵を除去するために、2つの20ミクロンフィルターを通してワームソリューションを渡します。唯一の小さな幼虫は、溶液中に残っている必要があります。
- 幼虫のペレットを形成するためには、1分間377×gでフィルタリング獲物を遠心分離します。
- 必要な口のモーフ（プロトコル1）用の画面捕食線虫。
- アッセイプレート上に正しく分類された捕食者を転送し、標準的なワームピッキング技術と光実体顕微鏡19を使用しました 。細菌汚染を最小限にするために、捕食者を転送するときにアッセイプレートにできるだけOP50細菌を転送するように注意してください。ワームはワームは、転送から損傷していないかを確認するために転送されるのストレスから回復し、野生型の運動性挙動を確認できるようにするために15分を待ちます。
注：Pを餓死する必要はありませんPAC彼らはよく細菌時に供給しながらも、他の線虫の幼虫の非常に効率的な捕食者であるとして、ificus。 - 回復後、10分間の光実体顕微鏡を用いて、捕食者を観察します。この装置では、観察し、そのような獲物の動きを制限する捕食することを特徴と、 噛むなどの個別の給電イベント特徴付ける;ここで、検出された獲物のキューティクルの開放によって、 殺害を 。 給電 、獲物の内臓（ 図2A、B ムービー1）の観察可能な消費によって分類。
- スクリーニングおよび正確さを保証するために、10個々の捕食線虫の最小値を観察することによって、アッセイを繰り返します。
注：標準のアッセイプレート上の純粋なワームペレットの3μlのは> 3000獲物の幼虫が含まれています。これは、捕食者と獲物の間の頻繁な接触を生成するのに十分です。
3.死体アッセイ
注：死体アッセイは略奪行為のより迅速な定量化を促進します。
- 成長し、標準的なNGMプレート上の線虫の文化を維持し、細菌リットルを餌E.のAWN 大腸菌 OP50 19。前述のアッセイプレートの三連（ - 2.5プロトコル2.1）を生成します。
- 技術をピッキング標準ワームや光実体顕微鏡転送各アッセイプレートに必要な口のモーフと5捕食線虫を用いたプロトコル1で説明したように、必要な口のモーフ用の画面捕食線虫。 2時間獲物と一緒に捕食者を残します。
- 2時間の画面の後に空になった死体（ 図2BおよびC）の存在についてアッセイプレート。内臓漏れやワームフラグメントを欠落しているなど、明らかな形態学的欠陥と一緒に運動性の欠如によって死体を識別します。
咽頭と歯の移動の4分析
- 成長し、標準的なNGMプレート上の線虫の文化を維持し、 大腸菌の細菌叢を餌大腸菌 OP50 19。前述したようにアッセイプレートを生成します（プロトコル2.1から2.5）。もし標準の6センチメートルNGMプレートは、適切な代替として2ミリリットルNGMを含む小さな35ミリメートルペトリ皿の蓋を使用して、客観的かつ顕微鏡ステージの間に収まりません。
- 必要な口のモーフ用の画面捕食線虫技術を選んで、標準的なワームや光実体顕微鏡を使用したプロトコル1に記載したように、アッセイプレートへのシングル正しく分類さ捕食者を転送します。ワームが転送されるのストレスから回復できるようにするために15分を待ちます。
- 高速度カメラ（ 作品2および3）で、63X Normaski - 40の顕微鏡に捕食動物を観察します。正確な定量を確保するために、少なくとも20匹中50 Hzで15秒以上のレコード咽頭ポンピングと歯の移動、。リプレイは、個々のポンプや歯のイベントをカウントするために、所望の速度で動画を記録しました。
注：歯の移動は、口の開口部において検出可能であり、唯一のOBである一方でポンピングが、咽頭の中央に位置コーパス、で観察されます背側歯から提供。
Representative Results
P.で適切な口のモーフの成功同定後行動を殺すに従事するのみeurystomatous動物とpacificus、eurystomatousとstenostomatous動物との間に明確な違いを検出することができる（ 図3）。 stenostomatous動物ではこの動作は完全に抑制されているようです。さらに、細菌や獲物にeurystomatous動物の歯の活動や咽頭ポンピングの違い（ 図4と作品2および3）にも明らかです。捕食送りながら、ポンピング速度は、細菌供給および歯の移動は、咽頭ポンピングと1の比率に1で検出された時に観察されるものより小さくなります。これは、異なる食事に対する行動応答を調節する重要な調節メカニズムの潜在的指標です。
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図1. P. pacificusは 摂食行動の影響口二形を持っています。 （A）eurystomatous口の形を捕食することが可能であり、大きな爪状の背側の歯（偽色の赤）と（B）大反対側のフック状のサブ腹歯（偽色の青）との広口開口部を有しています。 （C）stenostomatous口の形は、細菌のみを餌にすることができ、フリント状の背側の歯（偽色の赤）と（D）なしサブ腹歯（*）の付いた狭い口の開口部を有しています。 Normaski画像は63Xであり、スケールバーは10μmで表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 Cにかまと死体アッセイの 3. 結果エレガンス獲物。 （A）噛み現象が明らかですこの動作とeurystomatous口の形でstenostomatous動物では表示されません。エラーバーは10回の標準偏差を表している。（B）stenostomatous動物から明らかなし痛烈な行動と一致、死体のアッセイはまた、唯一のeurystomatous動物のアッセイプレート上の死骸が明らかにしました。エラーバーは、5反復の標準偏差を表している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
eurystomatous動物を捕食送りに従事している間に、図4 捕食摂食時のレートと歯の移動をポンピングEurystomatous。歯の移動のみが観察されます。これはまた、咽頭ポンピングの減少と一致します。エラーバーは、10反復の標準偏差を表します。 href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ムービー ライト実体顕微鏡を使用してかまアッセイのための行動を殺すの 1 観測。（右クリックしてダウンロード）。
P.の映画2.高速カメラムービーC.を殺すpacificus エレガンス幼虫。（右クリックしてダウンロード）。
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映画3.捕食中に歯の移動の高速カメラのズームイン。（右クリックしてダウンロード）。
Discussion
線虫は、Cで神経生物学や行動を理解するための強力なシステムを提供しますエレガンスは、これまでの主要なツールです。 P.含めしかし、多数の線虫種存在しないか、モデル生物C.から複雑で変化pacificus表示行動、 エレガンス 、したがって、これらの行動の進化と規制に関する魅力的な疑問を提起。 P.を含む他の多くの線虫種に見られるそのような追加的行動pacificusは捕食送り1、20に係合することによって、それらの細菌の食事を補うための能力である。そこで我々は線虫で、これらの以前に未分析の捕食行動の簡単かつ迅速な特性評価のための詳細なプロトコルを開発し、説明してきました。
まず、我々は線虫の口の中に装置を供給するのばらつきをスクリーニングするための方法を提供してきました。正しい口のタイプの識別は必須の最初のです成功捕食アッセイのためのTEP少なくともPristionchus属内のみeurystomatous動物が捕食給餌することが可能である、として。それは、この方法のようなプロトコル1.2に記載された「迅速な口の表現型」プロトコルでモーフはるかに低侵襲性であり、したがって、捕食行動が摂動することができることにくい、口を識別するのが最善です。しかし、最初に寒天パッド（プロトコル1.1）で麻酔した動物との識別によって異なる口の構造に慣れることをお勧めします。
希望の口のモーフを同定した後、我々は捕食送を定量化するための2つのアッセイを記載しています。これらは、迅速な高スループット「死体アッセイ」（プロトコル3）であり、より多くの時間は「一口アッセイ」（プロトコル2）を介して、詳細な行動分析を消費するが、より。これらのプロトコルは両方ともexperimenによってアッセイを最適化するためにいくつかの変更を可能にする非常に柔軟ですタル要件。 P.を用いて咬合アッセイのためC.上のpacificusの捕食者エレガンスの餌は、10分の時間ウィンドウの捕食行動の相互作用の観察は、他の摂食イベントと共に咬傷のかなりの量を定量化するのに十分でした。もう一度Pを利用した「死体アッセイ」とは、 C.上のpacificusの捕食者エレガンスの獲物は、2時間5捕食者は、迅速な行動解析を可能にし、容易に定量化し、一貫性のある死体の数を生産しました。しかし、それは異なる速度で捕食線虫の動きの異なる種を注意すべきである、異なる速度で食べて、一般的に他の行動1に大きな多様性を実証します。さらに、異なる餌の種も同様の理由のために異なる速度で食べてもよいです。したがって、捕食者と獲物として、また、環境条件の違いのために、両方の試験された線虫種に基づいたアッセイを最適化することをお勧めします。 「かま」と「軍団の両方の間ストレスやけがの捕食者が効率的に殺すことはありませんように獲物と捕食者の両方が、健康であることが重要である。また、新鮮なアッセイプレートは古いプレートとして必要不可欠であるe」のアッセイは悪影響誤っにつながる線虫の健康に影響を及ぼしているかを乾燥させてしまうことができますアッセイ。Cで観察された多くの行動を調査するためになされたものであり、これらの捕食アッセイの将来の反復は、分析の多くを自動化するために、技術の最近の進歩を活用できるようになることも期待されている21、22 エレガンス 。現在、問題は、彼らが捕食摂食を阻害する可能性が高いマイクロ流体室に分離し、固定化を行うこと、連絡することをはるかに敏感現れるなどのP. pacificusとして線虫において発生する可能性がある。これを克服困難な証明するかもしれないが、微妙な捕食のためにスクリーニングするために、個々の線虫を容易にするであろう行動。
最後に、我々はまた、foの方法を提供してきましたR高速カメラ（プロトコル4）を使用して歯と咽頭ポンピング速度を定量することによって捕食および細菌給電モードとの間の比較を容易にする線虫供給装置自体を調べます。 C.中咽頭ポンピング速度の定量化エレガンスは、C、しかし、長年23給監視するために利用されていますエレガンスは、口の歯状突起の任意のフォームを欠いており、また、捕食行動を欠いています。歯活性のものと咽頭ポンピングの定量を組み合わせることを通じて、捕食に特定の歯の任意の神経支配も観察することができます。動物はしばしば、焦点面の外に移動し歯の移動を観察するために必要な倍率に、したがって、短い時間窓のための歯を観察する通常のみ可能です。また、C.とは異なり、 エレガンス 、Pの咽頭pacificusは、継続的にむしろそれがポンピング及び給餌の呪文に従事し、ポンプはありません。そのため、正確な咽頭PUM用ピング速度決定する供給しながら、連続供給の15秒を記録することが重要です。
したがって、ここで紹介するこれらの方法は、線虫のシステムで捕食行動を調査するための第1のフレームワークを提供します。また、彼らはまた、微生物、真菌およびダニなどの捕食に加えて、生態学的に関連する生物の影響を含む、線虫の生態系内の他の相互作用を調査する際に使用するために適応することができます。したがって、彼らはまた、彼らの生態学的意義を、これらの捕食行動は、規制されているそれらがどのように進化してきたことがどのように分析する手段を提供します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nylon net filters (20 µm) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
| PP Funnel for filter (54 mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
| Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
| Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
| Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
| Glass Slides | Roth | H869 | |
| Cover Slips | Roth | 657 | |
| Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
| Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5X to 2.4X | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
| Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
| Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
| Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
| Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
| Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
| 6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
| 3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
| M9 ingredients: | |||
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
| Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
| Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
References
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