Introduction
Los nematodos con sus pequeños pero complejos sistemas nerviosos han demostrado ser herramientas poderosas para la comprensión de muchos aspectos de la neurobiología incluyendo el comportamiento. Gran parte de esta investigación se ha centrado en el organismo modelo Caenorhabditis elegans en el que una gran cantidad de diferentes comportamientos han sido diseccionados y analizados con éxito. Estos incluyen mecanosensorial 3, 4 quimiotáctica, thermotactic 5,6 y 7 magnetotáctica influir en el apareamiento 8,9, el aprendizaje 10 y comportamientos de alimentación 11. Sin embargo, otras especies de nematodos más alejadas exhiben conductas que no se observan en el rhabditid C. elegans o, alternativamente, muestran niveles adicionales de complejidad, lo que plantea preguntas pertinentes respecto a su evolución y regulación. Un tal ejemplo de esto se puede observar en el nematodo diplogastrid alejadas Pristionchus pacificus, que muestra mucho más compleja de alimentación seráconductas y ritmos que los observados en C. elegans 1. Esto es a pesar de las dos especies comparten las neuronas faríngeas homólogos 12. Coincidiendo con estos comportamientos de alimentación adicionales, P. pacificus también muestra una variedad en la dieta expandido, ya que son depredadores ávidos, capaces de complementar su dieta bacteriana por también se alimentan de las larvas de otros nematodos. Afortunadamente, P. pacificus se ha desarrollado como un modelo para la biología evolutiva comparativo e integrador y por lo tanto muchas herramientas moleculares y genéticos están ahora disponibles. Estos incluyen un genoma secuenciado en su totalidad y anotado 13, las herramientas moleculares y genéticos, incluyendo los transgenes 14 y CRISPR / Cas9 15,16, así como una filogenia detallada y bien anotado 17 con más de 25 especies estrechamente relacionadas, incluyendo su especie hermana recién descubiertos. Además, la ecología de numerosas especies Pristionchus incluyendo P. pacificus es quell definido con muchas especies ahora Habiéndose descrito compartiendo una asociación necromenic con escarabajos, una serie que comparten con frecuencia con otras especies de nematodos 18. P. por lo tanto pacificus proporciona un excelente sistema modelo con el que para diseccionar la evolución de comportamientos novedosos y su importancia ecológica.
Con el fin de analizar los comportamientos de alimentación en especies de nematodos depredadores tales como P. pacificus hemos desarrollado varios ensayos de comportamiento novedosas para facilitar la observación y cuantificación de las acciones depredadoras. Como P. pacificus muestra una estructura de boca dimórfico, que influye fuertemente en el comportamiento depredador, la identificación del morfotipo correcta es esencial 1,2. La estrecha morfo stenostomatous boca contiene un solo diente dorsal roma y no participa en ninguna alimentación de depredadores. Por otra parte, la gran metamorfosis eurystomatous boca incluye una mucho más grande en forma de garra del diente dorsal y una contrapuestadiente sub-ventral, que en conjunto operan de manera eficiente para abrir la cutícula de sus presas. La relación de la eurystomatous depredador a la forma stenostomatous no depredadores varía entre las especies Pristionchus y también dentro de P. pacificus, sin embargo, el porcentaje de la boca eurystomatous morph en el P. pacificus cepa de tipo salvaje (PS312) es por lo general 70 - 90% 2. Además, las relaciones de forma boca pueden fluctuar dependiendo de las diferentes influencias del medio ambiente (ambos conocidos, incluyendo la inanición y algunos pequeños de señalización, así como factores desconocidos molécula), la identificación de este modo correcto y el aislamiento de la forma de la boca eurystomatous depredador es esencial para los ensayos de depredadores exitosos.
Junto a la descripción de la forma de la boca depredador hemos desarrollado un "ensayo de mordida" para la observación directa y la cuantificación de los comportamientos depredadores, incluyendo morder, de matar y alimentándose eventos. Aquí nematodos presa son aislados a través del filtroción de las culturas recién desnutridos y adultos expuestos a depredadores P. pacificus, que se observan en conjunto en un lapso de tiempo corto. Además, también hemos desarrollado un alto rendimiento "ensayo de cadáver" para facilitar la detección rápida de comportamiento depredador través de la observación indirecta de eventos predatorios. Esto se aprovecha de la presencia de cadáveres de larvas como una herramienta para la detección de la depredación. Ambos ensayos proporcionan métodos fáciles y altamente repetible para observar y medir el comportamiento depredador de las especies de nematodos como P. pacificus.
Protocol
1. Boca forma Fenotipificación
- Forma de identificación boca en agarosa de ratones
Nota: Con el fin de visualizar los morfos boca de nematodos, inmovilizar los gusanos con un tratamiento anestésico suave en los cojines de agarosa y observar como sigue.- Crecer y mantener los cultivos de nematodos como P. pacificus en 6 cm de medios de cultivo estándar de nematodos (NGM) placas y se alimentan de un césped de bacterias de E. coli OP50 19.
- Haga cojines de agarosa mediante la adición de 0,06 g primero de agarosa para 3 ml H 2 O en un tubo de 15 ml para hacer la solución de agarosa al 3 ml 2%. Esto se puede almacenar durante un máximo de un año a 4 ° C.
- Mezclar y fundir la agarosa a fondo en un horno de microondas o alternativamente usar un bloque de calor ajustado a> 88 ° C.
- Una vez totalmente derretida, añadir 10 l de una solución de azida de sodio al 10% a la agarosa y mezclar bien. PRECAUCIÓN: La azida de sodio seco es reactiva y todas las formas son tóxicos.
- El uso de un 1 mlmicropipeta, coloque una gota de no menos de 300 l de la mezcla de azida de agarosa líquido en el medio de un portaobjetos de vidrio estándar.
- Antes de que el agar se enfría, coloque rápidamente un segundo portaobjetos de microscopio en la parte superior de la gota con el fin de aplanar la agarosa que forma una almohadilla al enfriar. Repita para tantas pastillas como se requiere.
- Justo antes de su uso, Despegue las portaobjetos de vidrio deslizándolos fuera el uno al otro. Nota: Si las almohadillas de agarosa se preparan con mucha antelación pueden ser excesivamente seco y pueden dañar los nematodos.
- Para transferir los gusanos a las almohadillas de agarosa anestésicos, colocar una gota de tampón M9 (2 - 3 l) en el centro de la almohadilla. Escoja 2 - 3 P. joven adultos pacificus en la gota de M9 antes de colocar un cubreobjetos con cuidado sobre la almohadilla. El P. nematodos pacificus serán inmovilizados en la agarosa y listo para visualizar.
- Transferir el portaobjetos de microscopio que contiene el gusano anestesiado a un microscopio una adecuadand observar bajo la óptica Nomarski 63X. Categorizar las identidades de morphing en base a las siguientes características: la presencia de un diente adicional sub-ventral, diente dorsal ampliada y la apertura de boca ancha es indicativo de un animal de la boca de metamorfosis eurystomatous, mientras que la presencia de un solo diente dorsal y apertura de la boca más estrecha indica una stenostomatous animales (Figura 1).
Nota: Con el fin de mantener la salud del animal, gusanos deben mantenerse en la plataforma de agar por no más de 5 minutos. - Después de la identificación de metamorfosis boca, recuperar los nematodos ya sea eurystomatous o stenostomatous como lo requiere la eliminación de la hoja de la cubierta deslizando suavemente fuera de la almohadilla de agarosa. Elegir cuidadosamente los animales seleccionados de la almohadilla de agarosa (E. coli OP50 se puede utilizar en la selección para ayudar a que sea más pegajoso) en placas NGM frescas. Permitir la recuperación de la anestesia hasta el comportamiento de la movilidad se ha normalizado en la que los animales están listos para más ensayos depredadores.
<li> Rápido Boca Fenotipificación - Coloque los nematodos en las placas de NGM estándar con un césped de bacterias de E. OP50 coli en el área de visión del microscopio.
- Detectar diferencias en el tamaño de la boca y la anchura. Nota: Con este aumento sin dientes como las estructuras son observables por lo tanto, la identificación de metamorfosis boca se basa únicamente en bocas anchas frente a las bocas estrechas.
Nota: Como alternativa, con más experiencia, la boca tipo de formulario se puede analizar sin necesidad de ningún tratamiento anestésico a través de un microscopio estereoscópico con gran aumento (150X).
2. Ensayo de la mordedura
Nota: Los ensayos que muerden permiten un análisis del comportamiento predatorio detallada.
- Crecer y mantener cultivos de nematodos en las placas de NGM estándar (6 cm) y se alimentan en un césped bacteriano de E. coli OP50 19.
- Hacer placas de ensayo por el crecimiento de una gran cantidad de larvas de nematodos presa seleccionada, tal como C. elegans o alternatively una presa adecuada ecológicamente pertinentes. Nota: Adulto C. elegans son demasiado grandes para ser presa adecuada por lo que es importante utilizar la etapa larval.
- Mantener C. elegans u otras especies de presas potenciales en las placas estándar NGM y alimentación en un césped de bacterias de E. coli OP50 hasta que la población está recién hambre, lo que resulta en una abundancia de larvas L1 joven.
Nota: La hora de la inanición depende de numerosos factores ambientales y experimentales, incluyendo el número de nematodos utilizadas para iniciar el cultivo, la cantidad de E. coli OP50 añadió, y la temperatura ambiente.
- Mantener C. elegans u otras especies de presas potenciales en las placas estándar NGM y alimentación en un césped de bacterias de E. coli OP50 hasta que la población está recién hambre, lo que resulta en una abundancia de larvas L1 joven.
- Lavar cuatro o más placas de presa recién muertos de hambre con la M9 y pasar la solución de tornillo sin fin a través de dos filtros de 20 micras para eliminar todos los animales grandes y los huevos restantes antes de la recogida en un tubo de 15 ml. Sólo un pequeño larvas debe permanecer en la solución.
- Para formar un sedimento de larvas centrifugar la presa filtrada a 377 xg durante 1 min.
- Nemátodos depredadores de pantalla para la metamorfosis boca requerida (protocolo 1).
- Utilizando técnicas de gusano recoger estándar y un microscopio estereoscópico de luz 19, transferir depredadores clasificados correctamente a la placa de ensayo. Tener cuidado de transferir como bacterias poco OP50 como sea posible a la placa de ensayo al transferir depredadores con el fin de minimizar la contaminación bacteriana. Espere 15 minutos para permitir que el tornillo sin fin de recuperarse de la tensión de ser transferido y comprobar si de tipo salvaje comportamiento de la movilidad para asegurar gusanos no han sido dañados por la transferencia.
Nota: No hay necesidad de pasar hambre P. pacificus, ya que son depredadores altamente eficientes de otras larvas de nematodos, incluso aunque bien alimentado de bacterias. - Después de la recuperación, observe el depredador utilizando un microscopio estereoscópico luz durante 10 minutos. Con este equipo, observar y caracterizar los distintos eventos de alimentación tales como morder, caracterizada por el depredador restringiendo el movimiento de la presa; matar, donde por una abertura de la cutícula se detecta una presa; y la alimentación, clasificados por un consumo observable de las entrañas de la presa (Figura 2 A, B y Película 1).
- Repetir el ensayo mediante el cribado y la observación de un mínimo de 10 nemátodos depredadores individuales para asegurar la exactitud.
Nota: 3 l de sedimento gusano puro en las placas de ensayo estándar contienen> 3,000 larvas presa. Esto es suficiente para generar un contacto frecuente entre depredadores y presas.
3. Ensayo de cadáver
Nota: Los ensayos Corpse facilitar una más rápida cuantificación del comportamiento depredador.
- Crecer y mantener los cultivos de nematodos en las placas de NGM estándar y se alimentan de una l bacterianaarista de E. coli OP50 19. Generar triplicados de las placas de ensayo mencionados anteriormente (protocolo de 02/01 a 02/05).
- Nemátodos depredadores de pantalla para la metamorfosis boca requerida como se describe en el protocolo 1. El uso de técnicas de gusano recoger estándar y una transferencia microscopio estereoscópico luz 5 nemátodos depredadores con la metamorfosis boca requerida para cada placa de ensayo. Deje los depredadores, junto con la presa durante 2 horas.
- Después de 2 horas de pantalla de la placa de ensayo para determinar la presencia de cadáveres vaciados (Figura 2 B y C). Identificar cadáveres por la ausencia de la motilidad junto con defectos morfológicos evidentes incluyendo fugas entrañas o faltan fragmentos de gusano.
4. Análisis de faríngea y movimiento de los dientes
- Crecer y mantener los cultivos de nematodos en las placas de NGM estándar y se alimentan de un césped de bacterias de E. coli OP50 19. Generar placas de ensayo como se ha mencionado anteriormente (protocolo de 2/1 a 2/5). Si estándar de 6 cmNGM placas no encajan entre el objetivo y la platina del microscopio, utilice la tapa de pequeñas placas de Petri de 35 mm que contienen 2 ml NGM como una alternativa adecuada.
- Nemátodos depredadores de pantalla para la metamorfosis boca requerida como se describe en el protocolo 1. Utilizando técnicas estándar de gusano de picking y un microscopio estereoscópico luz, la transferencia de un solo depredador clasificado correctamente a la placa de ensayo. Espere 15 minutos para permitir que el tornillo sin fin de recuperarse de la tensión de ser transferido.
- Observar a los animales depredadores en un microscopio a 40 - 63X Normaski, con una cámara de alta velocidad (Películas 2 y 3). Record faríngea de bombeo y movimiento de los dientes durante 15 s, a 50 Hz en al menos 20 animales para asegurar la cuantificación exacta. Replay registra películas a la velocidad deseada con el fin de contar con bombas individuales y eventos de dientes.
Nota: El bombeo se observa en el corpus, situado en el medio de la faringe, mientras que el movimiento del diente es detectable en la abertura de la boca y sólo es observido desde el diente dorsal.
Representative Results
Después de la identificación con éxito de la metamorfosis boca apropiada en P. pacificus, claras diferencias entre los animales eurystomatous y stenostomatous se puede detectar (Figura 3) con sólo los animales eurystomatous que participan en matar comportamiento. En los animales stenostomatous este comportamiento parece ser suprimida por completo. Además, las diferencias en la actividad de los dientes y faríngea de bombeo de los animales eurystomatous en bacterias y presa (Figura 4 y Películas 2 y 3) también son evidentes. Mientras que la alimentación depredador, la velocidad de bombeo se reduce por debajo de la observada durante la alimentación de bacterias y movimiento de los dientes se detecta en una relación uno a uno con el bombeo de la faringe. Este es un indicador potencial de los mecanismos reguladores clave que modulan la respuesta conductual a diferentes dieta.
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Figura 1. P. pacificus tiene un dimorfismo Boca que influye Conducta Alimentaria. (A) La forma de la boca eurystomatous es capaz de depredación y tiene una abertura de boca ancha con una gran forma de garra del diente dorsal (de color rojo falsa) y (B) un gancho opuesto grande en forma de diente sub-ventral (falsa de color azul). (C) La forma de la boca stenostomatous sólo es capaz de alimentarse de bacterias y tiene una abertura de boca estrecha con una forma de pedernal diente dorsal (de color rojo falsa) y (D) sin el diente de sub-ventral (*). Normaski imágenes son 63X y barra de escala representa 10 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Resultados de la mordedura y el cadáver Ensayos sobre C. elegans presa. (A) comportamiento de picadura sólo es evidente en forma eurystomatous boca con este comportamiento no se muestra en los animales stenostomatous. Barra de error representa la desviación estándar de 10 repeticiones. (B) que coincide con ningún comportamiento de morder evidente a partir de animales stenostomatous, los ensayos de cadáveres también revelan canales solamente en placas de ensayo de animales eurystomatous. Barra de error representa la desviación estándar de 5 repeticiones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Eurystomatous bombeo tarifas y Diente Movimiento durante la alimentación predatorios. Diente movimiento sólo se observa mientras que los animales eurystomatous se dedican a la alimentación de los depredadores. Esto también coincide con una reducción en el bombeo de la faringe. barra de error representa la desviación estándar de 10 repeticiones. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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3. Película zoom de la cámara de alta velocidad de movimiento de los dientes durante la depredación. (Haga clic derecho para descargar).
Discussion
Los nematodos proporcionan un sistema de gran alcance para la comprensión de la neurobiología y comportamiento con C. elegans siendo hasta el momento la principal herramienta. Sin embargo, numerosas especies de nematodos incluyendo P. visualización comportamientos pacificus, que están ausentes o varían en complejidad desde el organismo modelo C. elegans y por lo tanto plantean cuestiones fascinantes sobre la evolución y la regulación de estos comportamientos. Un tal comportamiento adicional se encuentra en muchas otras especies de nematodos incluyendo P. pacificus es la capacidad para complementar su dieta bacteriana mediante la participación de la alimentación de los depredadores 1, 20. Por tanto, hemos desarrollado y descrito un protocolo detallado para la caracterización fácil y rápida de estos comportamientos predatorios no analizadas previamente en los nematodos.
En primer lugar, hemos proporcionado métodos para la detección de variaciones en el aparato de alimentación dentro de la boca de los nematodos. La identificación del tipo correcto boca es un primer s esencialTEP para los ensayos de depredación de éxito como, al menos dentro del género Pristionchus únicos animales eurystomatous son capaces de alimentación de depredadores. Es mejor para identificar boca se transforma con el protocolo "rápida boca fenotipificación" se describe en el protocolo de 1,2 ya que este método es que es mucho menos invasiva y por lo tanto es menos probable que los comportamientos depredadores pueden ser perturbados. Sin embargo, se recomienda para convertirse primero familiarizado con las diferentes estructuras de la boca por la identificación con animales anestesiados en las almohadillas de agar (protocolo 1.1).
Después de la identificación de la metamorfosis boca deseada, hemos descrito dos ensayos para cuantificar la alimentación depredadora. Estos son una, de alto rendimiento "ensayo de cadáver" rápida (protocolo 3) y una más tiempo, pero el análisis del comportamiento en mayor profundidad a través del "ensayo de mordida" (protocolo 2). Ambos de estos protocolos son altamente flexible que permite varias modificaciones con el fin de optimizar los ensayos de función de las experimenrequisitos Tal. Para los ensayos de mordedura utilizando P. depredadores pacificus en C. elegans presa, observaciones de las interacciones de comportamiento depredadores para una ventana de tiempo de 10 min era suficiente para cuantificar una cantidad significativa de picaduras junto con otros eventos de alimentación. Para los ensayos de "cadáver" de nuevo utilizando P. depredadores pacificus en C. elegans presa, 5 depredadores durante 2 horas produjo números cadáver fácilmente cuantificables y coherentes que permitan un rápido análisis de comportamiento. Sin embargo, debe tenerse en cuenta diferentes especies de depredadores movimiento nematodo a diferentes velocidades, comer a diferentes velocidades y generalmente demuestran una gran diversidad de otros comportamientos 1. Además, diferentes especies de presa también se pueden comer a tasas diferentes por razones similares. Por ello se recomienda para optimizar los ensayos basados en las especies de nematodos ensayados tanto como depredadores y presas, y también la existencia de diferencias en las condiciones ambientales. Durante los dos "mordida" y "cuerpose "ensayos es fundamental que tanto la presa y los depredadores son saludables, como estrés o depredadores lesionados no van a matar de manera eficiente. Además, las placas de ensayo frescos son esenciales como placas de mayor edad pueden llegar a ser seca que afecta negativamente a la salud de los nematodos que conduce a errónea ensayos. también se espera que las futuras versiones de estos ensayos depredadores serán capaces de tomar ventaja de los recientes avances en la tecnología con el fin de automatizar gran parte del análisis que se ha logrado para la investigación de muchos de los comportamientos observados en C. elegans 21, 22. en la actualidad problemas es probable que surjan en los nematodos tales como P. pacificus como aparecen mucho más sensible al contacto, por lo que el aislamiento e inmovilización en cámaras de microfluidos probables abrogar la alimentación depredador. la superación de este puede ser un reto, pero facilitaría nematodos individuales a ser examinados en búsqueda sutil depredadora comportamientos.
Por último, también hemos proporcionado métodos FOr examinar el aparato de alimentación de los nematodos en sí facilitar las comparaciones entre los modos de alimentación depredadores y bacterianas mediante la cuantificación de la cinética de los dientes y de bombeo faríngeo usando una cámara de alta velocidad (protocolo 4). La cuantificación de las tasas de bombeo de la faringe en C. elegans se ha utilizado para controlar la alimentación durante muchos años 23, sin embargo, C. elegans carece de cualquier forma de denticle boca y también carece de comportamientos abusivos. A través de la combinación de la cuantificación de la faringe de bombeo con el de la actividad de los dientes, se puede también observar cualquier inervación de los dientes específicos a la depredación. Debido a la ampliación necesaria para observar el movimiento de los dientes de los animales a menudo se mueven fuera del plano focal, por lo que es por lo general sólo es posible observar el diente por ventanas de tiempo cortos. Además, a diferencia de C. elegans, la faringe de P. pacificus no bombea de forma continua, sino que se dedica a los hechizos de bombeo y la alimentación. Por lo tanto, para la exacta pum faríngealas tasas de ping mientras que la alimentación que se determinen, es importante registrar 15 segundos de alimentación continua.
Estos métodos presentados aquí, por lo tanto proporcionan el primer marco para la investigación de comportamientos depredadores en los sistemas de nematodos. Por otra parte, también pueden ser adaptables para su uso en la investigación de otras interacciones dentro del ecosistema nematodo incluyendo la influencia de organismos además ecológicamente relevantes en la depredación incluyendo microorganismos, hongos y ácaros . Por tanto, proporcionan un medio para diseccionar cómo se regulan estos comportamientos predatorios, la forma en que pueden haber evolucionado y también su importancia ecológica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nylon net filters (20 µm) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
| PP Funnel for filter (54 mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
| Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
| Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
| Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
| Glass Slides | Roth | H869 | |
| Cover Slips | Roth | 657 | |
| Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
| Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5X to 2.4X | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
| Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
| Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
| Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
| Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
| Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
| 6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
| 3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
| M9 ingredients: | |||
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
| Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
| Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
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