Developmental Biology

从斑马鱼胚胎内源性受体亲和标记检测

Published: August 31, 2016 doi: 10.3791/54405

Tonatiuh Molina-Villa¹, Valentín Mendoza¹, Fernando López-Casillas¹

¹Cell and Developmental Biology, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

Protocol

在动物身上进行的所有实验均委员会实验室动物护理和墨西哥自治国立大学（UNAM）使用批准的，由CICUAL协议号：FLC40-14。（CICUAL：“科米特Institucional第下午CuidadoŸUSO德洛斯阿尼马莱斯德的Laboratorio德尔研究所德FisiologìaCelular，大学墨西哥国立自治”）。

1.胚胎蛋白提取物的制备

收集100 - 200的胚胎为每个条件在所希望的阶段比较（morphants与野生型），例如72小时后受精（HPF）。
在含鱼水之培养皿的地方胚胎（ 见表1）和手动dechorionate用细尖镊子胚胎。避免在这一步骤（或整个协议的任何其他蛋白酶），链霉蛋白酶，因为它可能消化针对性的受体。
胚胎放置在1.5 ml离心管，洗胚胎TW用1×磷酸盐缓冲液（PBS）的冰（ 见表1）。
加入500微升deyolk缓冲液（ 见表1）。
（ - 40倍30）在溶液中的胚胎轻轻吹打向上和向下释放最蛋黄。 72高倍视野48 HPF胚胎使用蓝色和黄色的枪头，分别为。黄色提示可能需要稍微切割，以避免破坏胚胎。成功蛋黄释放可以通过显微镜下观察胚胎进行检查。
离心600 XG 15秒收集胚胎。
用吸管小心弃上清。
洗涤胚胎两次用500μl洗涤缓冲液通过以最低速度轻轻涡旋（ 见表1）。
离心600 XG 15秒收集胚胎。
从这里出发，继续在4℃的过程。
用吸管小心弃上清。
重悬的胚胎在350微升裂解缓冲液（见表1），并使用塑料杵均化。
孵育裂解胚胎搅拌30分钟上的试管摇杆在4℃。
离心机以除去不溶的碎片裂解胚胎在11000×g离心15分钟。
转印用吸管至新管清除上清液。
确定由Bradford蛋白测定^4，或其它合适的过程总蛋白。如果使用Bradford测定法，在洗涤剂礼物的当量浓度的裂解缓冲液的存在下进行校准曲线，因为它们会导致标准⁴的蛋白的低估。

2.内源受体蛋白质的检测

亲和标记和免疫（所有这些步骤在^4℃）
1. 放置400 - 500微克总胚胎蛋白质在1.5ml微量离心管中并稀释至1微克/微升用缓冲液1（ 见表1）。
  注意：为了获得500微克总胚胎蛋白，大约100 - 200胚胎必须首先处理。 72 HPF胚胎常规收率总胚胎蛋白质，这是足够的β聚糖检测的〜5微克。
2. 加标记的TGF-β2的库存的足够体积，以达到150微米的最终浓度，并于4℃在试管摇杆2小时在搅拌孵育。 TGF-β2必须AFLIP开始前由氯胺T方法如通过Cheifetz 等人 ⁵所述进行标记，用¹²⁵ I。
  注意：使用屏蔽，同时处理¹²⁵ I标记配体以尽量减少暴露。
3. 添加针对感兴趣的受体未稀释的抗体的足够体积，以达到1：100稀释并在4℃下继续温育另外2小时（温育可以是O / N）。这是抗血清＃31中的最佳稀释度，在此研究中使用的和其他地方描述的^3，但根据不同的一个的质量tibody，更大或更小的稀释可能是最佳的。
4. 加入50μl的合适的免疫球蛋白结合珠（例如，G蛋白 - 琼脂糖，这是以前在TNTE平衡并重新悬浮1:5在TNTE其原始体积的），并在4℃孵育50分钟以上的试管摇杆搅动C。
5. 恢复由微量离心珠粒在11000×g离心20秒。
6. 在适当的放射性垃圾容器弃上清。
7. 用1ml的IP洗涤缓冲液（ 见表1）的，通过涡旋和微量离心洗IP的珠粒三次在11000×g离心，每次20秒。
8. 悬浮IP-珠250微升IP洗涤缓冲。
9. 添加1.5微升二琥珀酰亚胺辛二酸酯的（DSS，溶解在DMSO中，在10毫克/毫升）。只是在这一步使用前准备DSS解决方案。
10. 在4℃搅拌下孵育15分钟。
11. 为了解渴交联反应，加入500μlØ˚FIP洗涤缓冲液，辅以足三Cl pH为7.4的股票达到25毫米的Tris-CL。 TRIS中游离氨基捕捉未反应的决策支持系统。
12. 离心机在11000×g离心20秒收集IP的珠并丢弃上清液。
13. 悬浮IP-珠在减少Laemmli缓冲液的30微升。
14. 煮沸样品在94℃5分钟。
15. 任选地，分析使用制造商的方案在γ计数器中的样品。
样品分析
1. 受试者样品变性SDS-PAGE。在对受体的质量的适当百分比使用聚丙烯酰胺和下标准程序运行凝胶。
2. 浸泡在固定液凝胶（ 见表1）在RT下30分钟。
3. 用蒸馏水冲洗凝胶15分钟。
4. 将凝胶在以前水合过滤纸和保鲜膜薄膜覆盖。
5. 在80℃进行1小时干凝胶。
6. 暴露在白色磷光SCRE凝胶恩在室温O / N。
7. 使用扫描使用制造商的协议的磷光暴露屏幕。

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Representative Results

图1示出了具有AFLIP获得的代表性结果。在泳道1信号来自于¹²⁵ I配体共价连接到或斑马鱼β聚糖核心蛋白（BG核心，150 kDa的标记下面）或已经由糖胺聚糖的附件（GAG，涂抹处理，以它的蛋白聚糖的形式对BG芯范围从170 kDa的凝胶的顶部）。迁移的这个模式中，锋利的核心蛋白加上涂蛋白聚糖（由于GAG链的长度异质），是TGFBR3 ²的特征。由于DSS不共价连接形成每一个配体-受体复合物，有免费的¹²⁵出现在迁移前凝胶^（125 I-TGF-β2）的I-配体。此游离配体与受体结合，和免疫沉淀期间仍然约束，但由于它不是共价连接，所述的SDS-PAGE过程期间分离。没有netheless，其信号的强度仍然关联到由标记的受体给出的。这可以通过比较泳道2和3.在48高倍视野的斑马鱼的胚胎可以理解表现出较低量的BG的超过72 HPF胚胎^3，这可通过在GAG和BG芯的微弱信号，即对应的强度可以看出由出现在凝胶前端的游离配位体给定信号（泳道2）。鉴于抗大鼠抗体BG ⁶做的ZF BG交叉反应，抗体在AFLIP使用时没有给出信号，因此，作为阴性对照（泳道3）。类似的负面结果与反ZF BG抗体³的免疫前血清获得。

图2示出AFLIP如何可以用来衡量特定受体的表达水平在经受实验操作的胚胎，在这种情况下，β聚糖减少由于在吗啉jection ^3。泳道1显示TGFBR3的在72 HPF野生型胚胎的水平，而泳道2示出了施用7纳克定向到ZF BG初级转录物的外显子2-内含子边界吗啉代的的效果。注意，与此吗啉得到的BG下调不受其误匹配的对照（泳道3）再现。这些结果证实，如³之前描述的本啉得到的表型是特异于TGFBR3的击倒。

在斑马鱼胚胎的BG的 图1 AFLIP检测 。从胚胎在72小时后的受精（HPF）总蛋白提取物（泳道1和3）和48 HPF（泳道2）进行¹²⁵ I TGF-β2亲和标记，随后用IP用兔抗斑马鱼BG（泳道1和2，ZBG）或兔抗大鼠BG（泳道3，RBG）作为对照。在放射自显影BG可以不GAG（BG芯）被检测或作为糖胺聚糖改性BG（GAG）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2. BG吗啉击倒由AFLIP检测。来自未处理的WT胚胎（lane1），具有特定的BG吗啉（泳道2）或错配对照（泳道3）显微注射的BG的¹²⁵ I TGF-β2亲和标记。每百万（CPM）计数恢复免疫沉淀和交联步骤指示后，请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲	组成
缓冲区1	的50mM的Tris-HCl pH为7.5，150 mM氯化钠，0.1％的Triton X-100
Deyolk缓冲	55 mM氯化钠，1.8毫摩尔的KCl，1.25毫_碳酸氢钠
鱼水	见材料表
固定液	50％CH ₃ OH，12％CH ₃ COOH，0.185％甲醛
IP洗涤缓冲液	的10mM _的 Na ₂ HPO _4，2mM的KH ₂ PO _4，137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，0.1％的Triton X-100，0.02％SDS，pH 7.4的
Laemmli缓冲液	2％SDS，10％甘油，100毫摩尔DTT，60毫摩尔Tris（pH值6.8），0.001％溴酚蓝。
裂解缓冲液	的50mM的Tris-HCl pH7.4的，150毫摩尔NaCl，1mM EDTA中，1毫PMSF，0.5％的Triton X-100，0.1％SDS，0.5％Deoxych钠酚盐
PBS	137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，10毫_的 Na ₂ HPO _4，2mM的KH ₂ PO _4，pH7.4的
TNTE	的50mM的Tris-HCl pH7.4的，150毫摩尔NaCl，1mM EDTA中，0.1％的Triton X-100
洗涤缓冲液	110 mM氯化钠，3.5毫摩尔的KCl，2.7毫摩尔_氯化钙，10mM的Tris-盐酸pH 8.5的

表1：缓冲组合物

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Discussion

Western印迹用针对感兴趣的蛋白质的特异性抗体的使用是一种有价值的工具胚胎发育过程中以研究其表达^7。然而，高度糖基化的蛋白质的免疫印迹尚未十分成功，由于其低效率的转让和弱结合到硝酸纤维素或PVDF膜^8,9。

蛋白多糖是因为他们的带负电荷的，并且不很好地结合要么聚苯乙烯表面或疏水印迹膜共价结合的糖胺聚糖链（GAG）的这个缺点的一个很好的例子。此外，GAG链的大小异质性“传播”的蛋白质在凝胶的部门，每印迹的面积有效地减少其数量。此外，如果所关注的蛋白质具有表达水平较低，其检测由正规蛋白质印迹是一个困难的任务。 β受体（TGFBR3）或β聚糖III型转化生长因子（BG），与在斑马鱼³哺乳动物¹两GAG的依恋网站和一个膜受体，具有所有这些属性。虽然，为了克服这些障碍的协议已经设计，如检测通过抗生物素蛋白-生物素复合物（ABC）的系统^10,11或带正电荷的膜¹²蛋白聚糖的免疫印迹，它们不能解决在相同的协议这两个问题。趁着BG的高亲和性的其天然配体TGFβ2和特异性抗体的可用性，AFLIP，结合亲和标记和免疫沉淀的优点的技术中，上述讨论的蛋白印迹分析检测的限制可能被克服。

与他们的放射性标记的配体与膜结合的受体的亲合标记是一个很好的利用工具，已经工具为几个重要的生长的鉴定和表征中培养细胞^13-16因子受体。而在以往的亲和标记细胞单层进行共价在组织培养皿的配体标记，然后裂解，在AFLIP首先形成在胚胎裂解物，然后通过免疫沉淀纯化，最后，共价交联的配体 - 受体复合物。因为它的使用放射性标记的配体的，AFLIP是非常敏感的，在原则上可以适于其他生长因子或细胞因子受体的量的标记的配体和良好的抗体是可用的。 AFLIP的这种潜在的，将有助于这些低丰富，但生理有关的分子检测。

因为在亲和标记的交联工序中的固有变异性，AFLIP不能用来定量确定所测量的受体的水平。但是，如果有足够的并行控制进行的，它可以提供它们的表达的相对水平的相当准确的计量。作为AFLIP使用总蛋白提取物，它不restri反恐执行局到受体中的一个特定的细胞的位置，它揭示了在整个个人或器官中的表达，如果施加到解剖成人标本。最后，如果需要的话AFLIP可能与其它生物化学协议，如碳水化合物酶消化，进一步表征感兴趣的受体。

类似于常规亲和标记，强烈建议新鲜¹²⁵ I标记的配体。定的¹²⁵ I的半衰期短，该配体必须在最初2周内用新鲜的同位素标记后使用。虽然大多数协议的警告已在相应的步骤中提到的，特别提及应当给予仔细去除蛋黄的，它必须为完全和均匀越好。留下不均量蛋黄会导致在裂解物善意胚胎蛋白质的不正确定量。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na₂HPO₄	J.T. Baker	3828
K₂HPO₄	J.T. Baker	3246
CH₃OH	J.T. Baker	9070
CH₃COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO₃	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix