Protocol
FLC40-14：動物で行わ全ての実験はCICUAL-プロトコル番号の下、メキシコ自治大学（UNAM）の実験動物管理使用委員会によって承認されました。 （CICUAL：「ComitéInstitucionalパラエルCuidado yの嘘・デ・ロス・Animales・デ・ラボラトリ・デル・研究所・デ・FisiologìaCELULAR、ナショナル大学自治・デ・メキシコ」）。
胚のタンパク質抽出物の調製
- 各条件は、例えば72時間後に受精（HPF）のために、所望の段階で（モルファント対野生型）を比較するための200の胚 - 100を収集します。
- 先の細いピンセットを使用して場所の魚の水を含むペトリ皿中の胚（ 表1参照）、手動dechorionate胚。それは、標的受容体を消化することができるように、この段階（またはプロトコルを通じて、他のプロテアーゼ）中にプロナーゼを使用しないでください。
- 1.5mlマイクロチューブに入れ胚と胚TWを洗います1×リン酸緩衝溶液（PBS）と氷（ 表1参照）。
- （ 表1を参照）deyolk用緩衝液500μlを追加します。
- （ - 40倍、約30）溶液中で胚を優しく上下にピペッティングにより卵黄のほとんどをリリース。 72 HPFと48 HPFの胚については、それぞれ、青と黄色のピペットチップを使用します。黄色のヒントが少し胚を壊さないようにカットする必要があるかもしれません。成功した卵黄の放出は、顕微鏡下で胚を観察することによって確認することができます。
- 15秒間600×gで遠心分離することによって胚を収集します。
- ピペットを使用して、慎重に上清を捨てます。
- 洗浄胚は二回500μlの洗浄バッファーで穏やかに最低速でボルテックスすることによって（ 表1参照します）。
- 15秒間600×gで遠心分離することによって胚を収集します。
- ここから出発し、4°Cで手順を続行します。
- ピペットを使用して、慎重に上清を捨てます。
- 溶解バッファー350μlの再懸濁胚（表1を参照）、プラスチック製乳棒を用いて均質化します。
- 4°Cで試験管ロッカーに溶解させた胚を攪拌しながら30分間インキュベート。
- 遠心分離機は、不溶性の破片を除去するために15分間、11,000×gで胚を溶解しました。
- 転送が新しいチューブにピペットを用いて上清をクリア。
- Bradfordタンパク質アッセイ4、または他の適切な手順により総タンパク質を決定します。 Bradfordアッセイを使用している場合、彼らは4標準タンパク質の過小評価を引き起こすように、溶解緩衝液中の界面活性剤の提示の等価な濃度の存在下で較正曲線を実行します。
2.検出内因性受容体タンパク質の
- 親和性標識および免疫沈降（すべての手順4 O Cで）
- 1.5mlマイクロチューブに総胚タンパク質の500μgのバッファ1（ 表1を参照）を1μg/μlに希釈する- 400を置きます。
注：総胚タンパク質500μgのを得るためには、約100から200胚が最初に処理されなければなりません。 72 HPFの胚は、日常的にβグリカンの検出のために十分である総胚タンパク質、の〜5μgのをもたらします。 - 試験管ロッカーに150 PMの最終濃度に達すると攪拌しながらインキュベートし、4℃で2時間標識TGF-β2株式の十分なボリュームを追加します。 AFLIPが開始される前にCheifetz ら 5によって説明したように、TGF-β2は、クロラミンT法によって125 Iで標識されなければなりません。
注意：使用して私は、リガンドを標識した125の処理中に露出を最小限にするためにシールド。 - 100希釈および（インキュベーションは、O / Nであってもよい）4℃でさらに2時間インキュベーションを継続：1に到達するために、目的の受容体に対する希釈していない抗体の十分なボリュームを追加します。これは、この研究で使用され、他の場所3を説明するが、ANの品質に応じて、抗血清＃31の最適希釈でありますtibody、より大きいまたはより小さい希釈が最適であってもよいです。
- 適切な免疫グロブリン結合ビーズの50μlを添加（例えば、以前にTNTEで平衡化し、1再懸濁させたGタンパク質セファロース、：TNTEで元の体積の5）と4℃で試験管ロッカー上で撹拌しながら50分間インキュベートしますC.
- 20秒間11,000×gで微量遠心によってビーズを回復。
- 適切な放射性ゴミ容器に上清を捨てます。
- 20秒間11,000×gで毎回ボルテックスし、微量遠心することにより、（ 表1を参照）IP洗浄緩衝液1mlでIP-ビーズを3回洗浄します。
- IP洗浄緩衝液250μlの中に再懸濁したIP-ビーズ。
- （10 mg / mlとでDMSOに溶解したDSS、）ジスクシンイミジルスベレートの1.5μlを添加します。ちょうどこの段階でその使用前にDSS溶液を調製します。
- 攪拌しながら4℃で15分間インキュベートします。
- 架橋反応をクエンチするために、500μlのOを加えます十分トリス-Cl pH7.4の在庫を補充したF IP洗浄緩衝液は、25mMのトリス-Clに到達します。トリス中の遊離アミノ基が未反応のDSSをキャプチャします。
- 20秒IP-ビーズを収集し、上清を廃棄するための11,000×gで遠心分離します。
- 再懸濁IP-ビーズLaemmliバッファーを減らす30μlのインチ
- 沸騰サンプル94℃で5分間。
- 必要に応じて、製造業者のプロトコルを使用して、ガンマカウンターでサンプルを分析します。
- 1.5mlマイクロチューブに総胚タンパク質の500μgのバッファ1（ 表1を参照）を1μg/μlに希釈する- 400を置きます。
- 試料分析
- 変性SDS-PAGEの対象サンプル。受容体の質量のための適切な割合でポリアクリルアミドを使用し、標準的な手順の下でゲルを実行します。
- 固定液中でゲルを浸し、室温で30分間（ 表1参照）。
- 15分間蒸留水でゲルを洗浄してください。
- 以前に水和ろ紙にゲルを置き、サランラップフィルムでカバーしています。
- 1時間80℃で乾燥ゲル。
- 白ホスホイメージャSCREにゲルを公開RT O / Nでアン。
- 製造業者のプロトコルを使用して、ホスホイメージャを用いて露光画面をスキャンします。
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Representative Results
図1は AFLIPで得られた代表的な結果を示しています。 125 I-リガンドから来レーン1の信号は、共有ゼブラフィッシュβグリカンコアタンパク質（BGコア、150 kDaのマーカー以下）またはグリコサミノグリカンのアタッチメント（GAG、スミアによってそのプロテオグリカンの形に加工されたBGコアのいずれかにリンクされています）170キロダルトンからゲルの上部に及びます。移行のこのパターン、シャープなコアタンパク質プラス（GAG鎖の長さが原因で不均質に）塗抹プロテオグリカンは、TGFBR3 2の特徴です。 DSSは共有結合で形成された一つ一つのリガンド-受容体複合体をリンクしていないので、ゲル（125 I-TGF-β2）の移行前面に現れる自由125 I-リガンドがあります。この無料のリガンドは、受容体に結合し、免疫沈降時にバインドされたままであったが、それは共有結合していないため、SDS-PAGEの手順の間に切り離さ。いいえnethelessは、その信号の強度が依然として標識受容体によって与えられたものに相関します。ゼブラフィッシュ胚の強度に対応するGAGとBGコアで微弱な信号で見ることができる72 HPF胚3、よりBGの低い量を示すHPFこれは、48で、レーン2および3を比較することによって理解することができますゲルの前に現れる遊離リガンドによって与えられる信号（レーン2）。ラットBG 6に対する抗体は、ZF BGと交差反応しないことを考えると、AFLIPで使用される抗体は、陰性対照（レーン3）として、したがって、何のシグナルを与えませんでした。同様の負の結果は、抗ZF BG抗体3の免疫前血清で得られました。
図2は、AFLIPが原因でモルホリノに、この場合には、実験操作に供胚におけるβグリカンの減少を与えられた受容体の発現のレベルを測定するために使用することができる方法を示してジェクション3。レーン2は、ZF BG一次転写物のエキソン2、イントロン2の境界に向けモルホリノの7 ngのを投与する効果を示しているレーン1は、72 HPF野生型胚におけるTGFBR3のレベルを示しています。このモルホリノで得られたBGダウンレギュレーションは、そのミスマッチコントロール（レーン3）によって再現されていないことに注意してください。これらの結果は、3の前に説明したように、このモルホリノを用いて得られた表現型はTGFBR3のノックダウンのための具体的なことを確認しました。
ゼブラフィッシュ胚におけるBGの 図1. AFLIP検出 。72時間後に受精（HPF）での胚からの総タンパク質抽出物（レーン1および3）および48 HPF（レーン2）は、その後125 I-TGF-β2親和性標識を施しましたBG（レーン3、RBGウサギ抗ゼブラフィッシュBG（レーン1および2、ZBG）またはウサギ抗ラットとIPにより）対照として。オートラジオグラフィーではBGは、GAG（BGコア）せずに、またはグリコサミノグリカンで修飾されたBG（GAG）として検出することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. BGモルホリノノックダウン。AFLIPによって検出された特定の BGモルホリノ（レーン2）またはミスマッチ対照（レーン3）をマイクロインジェクションし、未処理のWT胚（レーン1）、からのBGの125 I-TGF-β2の親和性標識。免疫沈降および架橋工程の後に回収万人当たりのカウント（CPM）が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| バッファ | 組成 |
| バッファ1 | pH7.5の50mMのトリス-HCl、150mMのNaCl、0.1％トリトンX-100 |
| Deyolkバッファ | 55のNaCl、1.8mMのKClを、1.25 mMの炭酸水素ナトリウム |
| 魚の水 | 材料表を参照してください。 |
| 固定液 | 50％CH 3 OH、12％CH 3 COOH、0.185％のHCHO |
| IP洗浄緩衝液 | 10mMのNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4、137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、0.1％トリトンX-100、0.02％SDS、pH7.4の |
| レムリバッファ | 2％SDS、10％グリセロール、100mMのDTT、60 mMトリス（pHは6.8）、0.001％のブロモフェノールブルー。 |
| 溶解バッファー | 50mMトリス - 塩酸pH7.4の、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのPMSF、0.5％トリトンX-100、0.1％SDS、0.5％ナトリウムDeoxychオラート |
| PBS | 137 mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10mMののNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4、pH7.4の |
| TNTE | 50mMトリス - 塩酸pH7.4の、150mMのNaCl、1mMのEDTA、0.1％トリトンX-100 |
| 洗浄緩衝液 | 110 mMの塩化ナトリウム、3.5mMの塩化カリウム、2.7ミリモルのCaCl 2、10mMのトリス塩酸pH8.5の |
表1：バッファ組成物
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Discussion
目的のタンパク質に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロットの使用は、胚発生時にその発現7を研究するための貴重なツールです。しかし、高度にグリコシル化されたタンパク質のイムノブロットは、その非効率的な転送およびニトロセルロースまたはPVDF膜8,9に弱い結合に非常に成功していません。
プロテオグリカンは理由負に帯電しているとポリスチレン表面または疎水性のブロッティング膜のいずれにも結合しない彼らの共有結合したグリコサミノグリカン鎖（GAG）の、この欠点の良い例です。また、GAG鎖の大きさの不均一性が効果的にブロットの面積当たりの量を減少させる、ゲルのセクター上でタンパク質を「広がります」。目的のタンパク質が発現の低いレベルを有する場合に加えて、定期的なウェスタンブロットにより、その検出が困難なタスクです。受容体（TGFBR3）またはβグリカンβIII型トランスフォーミング増殖因子（BG）、哺乳類1とゼブラフィッシュ3の1に2つのGAGの結合部位を有する膜受容体は、これらの特性のすべてを持っています。これらのハードルを克服するためのプロトコルが考案されてきた、が、アビジン-ビオチン複合体（ABC）システム10,11または正に帯電膜12上のプロテオグリカンの免疫ブロットによる検出のように、彼らは同じプロトコルで両方の問題を解決することはできません。その天然のリガンドのためのBGの高親和性TGFβ2および特異的抗体、AFLIP、親和性標識および免疫沈降法の利点を組み合わせた技術の利用可能性を利用して、ウェスタンブロット検出の上述の制限を克服することができます。
その放射性標識されたリガンドと膜結合型受容体の親和性標識は、培養細胞中でいくつかの重要な成長因子受容体の同定および特徴付けのために13-16尽力してきただけでなく使用するツールです。細胞の単層を標識する従来の親和性で、組織培養皿上のリガンドの標識を共有結合に供した後、溶解されているが、AFLIP、リガンド - 受容体複合体は、第一の胚溶解物は、免疫沈降によって精製し、最終的に、共有結合的に架橋が形成されています。なぜなら、放射性標識リガンドの使用により、AFLIPは非常に敏感であり、原理的に標識されたリガンドとの良好な抗体が利用可能な他の成長因子またはサイトカイン受容体に適合させることができます。 AFLIPのこの電位は、これらの低豊富な生理関連分子の検出に役立つだろう。
なぜなら親和性標識の架橋工程において固有の変動の、AFLIPを定量的に測定された受容体のレベルを決定するために使用することができません。しかし、十分なパラレルコントロールで実行した場合、それはその発現の相対的レベルの非常に正確な計測を提供することができます。 AFLIPは全タンパク質抽出物を使用するように、restriありません解剖大人の標本に適用される場合、受容体の一つの特定の細胞位置にCTED、それは、全体の個人または器官におけるその発現を明らかにする。最後に、必要に応じてAFLIPは、さらに目的の受容体を特徴づけるために、炭水化物の酵素消化のように、他の生化学的なプロトコルにリンクすることができました。
従来の親和性標識と同様に、新たに125 I標識リガンドを強くお勧めします。 125 Iの短い半減期を考えると、リガンドは、新鮮な同位体で標識した後最初の2週間以内に使用しなければなりません。プロトコルの注意事項のほとんどが対応するステップで言及されているが、1特別な言及は、可能な限り完全かつ均一でなければならない卵黄を注意深く除去に与えられなければなりません。卵黄の不均一な量のままにしておくと、溶解物中の善意の胚タンパク質の不正確な定量化をもたらすであろう。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disuccinimidyl suberate (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Gel Dryer Model 583 | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-78 | |
| Cobra II Auto gamma counter | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Crystal Sea Marine Mix | Marine Enterprises International | http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
References
- López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
- Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cheifetz, S., et al. Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms. J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).
- López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor. Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Maccari, F., Volpi, N. Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).
- Volpi, N., Maccari, F. Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).
- Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).
- Bratthauer, G. L. The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).
- Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66. Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).
- Das, M., et al. Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor. PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).
- Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling. J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).
- Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries. PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).
- Hoosein, N. M., Gurd, R. S. Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain. PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).
