Protocol
Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê de Laboratório Animal Care e Use da Universidade Nacional Autônoma do México (UNAM), sob o número CICUAL-Protocol: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").
1. Preparação do extracto do embrião Proteína
- Colete 100 - 200 embriões para cada condição para comparar (morphants vs. tipo selvagem) no estágio desejado, por exemplo 72 horas após a fertilização (hpf).
- Embriões lugar em placas de Petri contendo água de peixe (ver Tabela 1) e dechorionate manualmente embriões usando uma pinça de ponta fina. Evitar o uso de pronase durante este passo (ou qualquer outra protease ao longo do protocolo), uma vez que podem digerir o receptor alvo.
- embriões lugar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e lavar embriões twgelo com uma solução de tampão de fosfato de 1x (PBS) (ver Tabela 1).
- Adicionar 500 ul de tampão deyolk (ver Tabela 1).
- Liberar mais de gema de cuidado pipetando para cima e para baixo (cerca de 30 - 40 vezes) os embriões na solução. Para 72 hpf e 48 embriões HPF usar azul e amarelo pontas de pipeta, respectivamente. pontas amarelas pode precisar de ser ligeiramente cortada para evitar a destruição de embriões. O lançamento gema de sucesso pode ser verificado observando-se os embriões sob o microscópio.
- Recolhe embriões por centrifugação a 600 xg durante 15 seg.
- Elimine o sobrenadante cuidadosamente, usando uma pipeta.
- Embriões lavar duas vezes com 500 ul de tampão de lavagem (ver Tabela 1) por vortex suavemente na velocidade mais baixa.
- Recolhe embriões por centrifugação a 600 xg durante 15 seg.
- A partir daqui, o processo continua a 4 ° C.
- Elimine o sobrenadante cuidadosamente, usando uma pipeta.
- Ressuspender embriões em 350 ul de tampão de lise (ver Tabela 1) e homogeneizar utilizando um pilão de plástico.
- Incubar embriões lisadas 30 min, com agitação num agitador tubo de ensaio a 4 ° C.
- Centrifugar embriões lisadas a 11000 xg durante 15 minutos a fim de remover os detritos insolúveis.
- Transferência afastada sobrenadante utilizando uma pipeta para um tubo fresco.
- Determinar a proteína total pelo ensaio de proteína de Bradford 4, ou outro procedimento adequado. Se ensaio de Bradford é utilizado, realizar a curva de calibração na presença de concentrações equivalentes dos detergentes presentes no tampão de lise, uma vez que causam uma subestimação da proteína padrão 4.
2. Detecção da proteína endógena do Receptor
- Affinity Labeling e Immunoprecipitation (todos estes passos, a 4 ° C)
- Coloque 400-500 ug de proteína total de embriões num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e diluir até 1 ug / uL com tampão 1 (ver Tabela 1).
Nota: A fim de obter 500 mg de proteína embrião total, cerca de 100-200 embriões devem ser inicialmente processado. 72 hpf embriões rotineiramente obter ~ 5 ^ g de proteína total de embrião, o qual é suficiente para a detecção betaglicano. - Adicionar um volume suficiente de estoque de TGF-β2 marcado para atingir uma concentração final de 150 pM e incubar com agitação em um tubo de ensaio balancim 2 h a 4 ° C. TGF-β2 deve ser marcado antes AFLIP é iniciado, com 125 I pelo método da cloramina T como descrito por Cheifetz et ai. 5.
CUIDADO: O uso de blindagem para minimizar a exposição ao manusear 125 I ligando marcado. - Adicionar um volume suficiente de anticorpo não diluído contra o receptor de interesse, a fim de chegar a uma diluição de 1: 100 e continuar a incubação durante mais 2 horas a 4 ° C (de incubação pode ser O / N). Esta é a diluição óptima de anti-soro # 31, utilizado neste estudo e descrito noutro local 3, mas, dependendo da qualidade do umtibody, uma diluição maior ou menor pode ser a ideal.
- Adicionar 50 ul de pérolas de ligação de imunoglobulina adequada (por exemplo, a proteína G-Sepharose ', que foi previamente equilibrada em TNTE e ressuspensas 1: 5 do seu volume original em TNTE) e incubar durante 50 minutos com agitação num agitador tubo de ensaio a 4 ° C.
- Recuperar os grânulos por microcentrifugação a 11000 xg durante 20 seg.
- Elimine o sobrenadante em um recipiente de lixo radioactivo apropriado.
- Lavam-se as esferas de IP-se três vezes com 1 ml de tampão de lavagem de IP (ver Tabela 1), por agitação em vórtice e microcentrifugação a 11000 xg durante 20 seg de cada vez.
- Ressuspender IP-grânulos em 250 ul de tampão de lavagem IP.
- Adicionar 1,5 uL de suberato de dissuccinimidilo (DSS, dissolvido em DMSO a 10 mg / ml). Preparar a solução de DSS imediatamente antes da sua utilização neste passo.
- Incubar durante 15 min a 4 ° C com agitação.
- A fim de parar a reacção de reticulação, adicionar 500 ul Otampão de lavagem f IP, suplementado com suficiente de Tris-Cl pH 7,4 estoque para atingir 25 mM de Tris-Cl. Os grupos amino livres em Tris capturar DSS que não reagiu.
- Centrifuga-se a 11000 xg durante 20 seg para recolher IP-grânulos e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender IP-esferas em 30 ul de tampão redutor de Laemmli.
- Ferver as amostras 5 min a 94 ° C.
- Opcionalmente, analisar amostras em um contador gama usando o protocolo do fabricante.
- Coloque 400-500 ug de proteína total de embriões num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e diluir até 1 ug / uL com tampão 1 (ver Tabela 1).
- Análise de amostras
- amostras submetido a uma desnaturação SDS-PAGE. Use poliacrilamida na percentagem adequada para a massa do receptor e executar gel sob procedimento padrão.
- Mergulhar em gel de solução fixadora (ver Tabela 1) durante 30 min à TA.
- Lavar o gel com água destilada durante 15 min.
- Coloque gel em papel de filtro previamente hidratado e cubra com filme de envolvimento Saran.
- gel seco a 80 ° C durante 1 h.
- Expor gel em um scre phosphorimager brancoen à TA S / N.
- Digitalizar tela exposta usando um phosphorimager usando o protocolo do fabricante.
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Representative Results
A Figura 1 mostra um resultado representativo obtido com AFLIP. Os sinais nas faixas 1 vêm do 125I-ligando ligado de forma covalente, quer a proteína de peixe-zebra betaglicano núcleo (núcleo BG, abaixo da kDa marcador 150) ou o núcleo BG que foi processado para a sua forma de proteoglicanos por ligação de glicosaminoglicanos (GAG, esfregaço variando de 170 kDa para a parte superior do gel). Este padrão de migração, uma proteína núcleo afiado mais um proteoglicano manchada (devido à heterogeneidade no comprimento das cadeias de GAG), é característica do TGFBR3 2. Uma vez que o DSS não ligar covalentemente a cada complexo ligando-receptor único formado, não está livre de 125I-ligando que aparece na parte da frente de migração do gel (125I-TGF-β2). Este ligando livre foi ligado ao receptor, e permaneceu ligada durante a imunoprecipitação, mas uma vez que não foi ligado de forma covalente, individual durante o procedimento de SDS-PAGE. Nãonetheless, a força do seu sinal ainda correlaciona-se com a que é dada pelo receptor marcado. Isto pode ser apreciado ao comparar as pistas 2 e 3. A 48 HPF os embriões de peixe-zebra apresentam menores quantidades de BG de 72 embriões HPF 3, que pode ser visto pelos sinais fracos no núcleo e GAG BG, que correspondem a intensidade do sinais emitidos pelo ligando livre que aparecem na frente do gel (pista 2). Dado que os anticorpos contra rato BG 6 não reagem de forma cruzada com a BG ZF, os anticorpos quando utilizados no AFLIP deu nenhum sinal, portanto, servindo como um controlo negativo (pista 3). Resultados negativos semelhantes foram obtidos com o soro pré-imune do anticorpo anti-ZF BG 3.
A Figura 2 mostra como AFLIP pode ser utilizado para medir os níveis de expressão de um dado receptor, em embriões submetidos a uma manipulação experimental, neste caso, a diminuição da betaglicano devido à morfolino eminjeção 3. A pista 1 mostra o nível de TGFBR3 num embrião 72 HPF tipo selvagem, enquanto que a pista 2 mostra o efeito da administração de 7 ng de um morfolino dirigido para o limite exon2-intron2 do transcrito primário ZF BG. Note-se que a regulação para baixo BG obtido com este morfolino não é reproduzida através do seu controlo desencontradas (pista 3). Estes resultados confirmaram que o fenótipo obtido com este morfolino era específico para o knockdown da TGFBR3 como descrito antes 3.
Figura 1. Detecção AFLIP de BG em embriões Zebrafish. Extracto de proteína total a partir de embriões em 72 horas pós-fertilização (HPF) (Pistas 1 e 3) e 48 HPF (pista 2) foram submetidos a rotulagem 125I-TGF-β2 afinidade seguido por IP com anticorpo de coelho anti-zebrafish BG (pistas 1 e 2, ZBG) ou de coelho anti-rato BG (pista 3, RBG) Como um controlo. Na auto-radiografia BG pode ser detectada sem GAG (core BG) ou como uma BG glicosaminoglicanos modificado (GAG). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. BG Morfolino knockdown detectado por AFLIP. 125I-TGF-β2 marcação de afinidade de BG de embriões não tratados (WT lane1), micro-injectadas com a BG específica morfolino (pista 2) ou um controlo de desfasamento (pista 3). As contagens por milhão (CPM) recuperaram após a imunoprecipitação e o passo de reticulação são indicados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amortecedor | Composição |
| tampão 1 | Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% de Triton X-100 |
| tampão Deyolk | NaCl 55 mM, KCl 1,8 mM, 1,25 mM de NaHCO 3 |
| peixes de água | Ver Tabela Materiais |
| solução fixadora | 50% CH3OH, 12% de CH3COOH, 0,185% de HCHO |
| tampão de lavagem IP | 10 mM de Na 2 HPO 4, KH 2 PO 4 2 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 0,1% de Triton X-100, 0,02% de SDS, pH 7,4 |
| tampão Laemmli | 2% de SDS, 10% glicerol, DTT 100 mM, Tris 60 mM (pH 6,8), 0,001% de azul de bromofenol. |
| O tampão de lise | 50 mM Tris-HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, 0,5% de Triton X-100, 0,1% de SDS, 0,5% de sódio DeoxychOlate |
| PBS | 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4 |
| TNTE | 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de Triton X-100 |
| tampão de lavagem | NaCl 110 mM, KCl 3,5 mM, CaCl 2 2,7, 10 mM Tris-HCl pH 8,5 |
Tabela 1: tampão Composições
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Discussion
O uso de transferências de Western com um anticorpo específico contra uma proteína de interesse é uma ferramenta valiosa para estudar a sua expressão 7 durante a embriogénese. No entanto, immunoblotting de proteínas altamente glicosiladas não tem sido muito bem sucedida, devido à sua transferência ineficiente e de ligação fraca para nitrocelulose ou PVDF membranas 8,9.
Proteoglicanos são um bom exemplo desta lacuna, por causa de suas cadeias de glicosaminoglicanos (GAG covalentemente anexado) que são carregadas negativamente e não se ligam bem a qualquer superfícies de poliestireno ou membranas de mancha hidrofóbicas. Além disso, a heterogeneidade de tamanho das cadeias de GAG "espalha" a proteína ao longo de um sector do gel, a sua quantidade eficaz diminuindo por a área da mancha. Além disso, se a proteína de interesse tem baixos níveis de expressão, a sua detecção por Western blot regulares é uma tarefa difícil. O factor de crescimento tipo transformadora III β receptor (TGFBR3) ou betaglicam(BG), um receptor de membrana com dois locais de ligação de GAG em mamíferos e um 1 em peixes-zebra 3, tem todas estas propriedades. Embora, os protocolos para superar estes obstáculos foram concebidos, como a detecção pelo sistema de avidina-biotina complexo (ABC) ou 10,11 a Imunoblotting de proteoglicanos nas membranas com carga positiva 12, que pode não resolver os dois problemas no mesmo protocolo. Tirando vantagem da elevada afinidade de BG para o seu ligando natural, TGF-p2 e da disponibilidade de um anticorpo específico, AFLIP, uma técnica que combina as vantagens de marcação de afinidade e imunoprecipitação, o acima discutido limitações de detecção de western blot podem ser superados.
De marcação de afinidade dos receptores ligados à membrana, com os seus ligandos radiomarcados é um instrumento bem usadas que tem sido fundamental para a identificação e caracterização de vários factores de crescimento importante receptores em células cultivadas 13-16.Enquanto na afinidade convencional rotulagem de uma monocamada de células é submetida a covalentes rotulagem ligante no prato de cultura de tecidos e em seguida lisadas, em AFLIP os complexos ligando-receptor são formadas em primeiro lugar em lisados de embriões, em seguida, purificados por imunoprecipitação e, finalmente, covalentemente reticulados. Devido à sua utilização de ligandos radiomarcados, AFLIP é muito sensível e, em princípio, pode ser adaptado a outros factores de crescimento ou receptores de citocinas que para um ligando marcado e um bom anticorpo estão disponíveis. Este potencial de AFLIP ajudaria a detecção dessas moléculas relevantes baixos abundantes mas fisiológicas.
Por causa da variabilidade inerente ao passo de reticulação de marcação de afinidade, AFLIP não pode ser usado para determinar quantitativamente os níveis dos receptores medidos. No entanto, se for realizada com controlos adequados paralelas, que pode fornecer uma medição muito precisa dos níveis relativos de expressão. Como AFLIP usar extractos de proteína total, que não está restricted para uma localização celular específica do receptor, que revela a sua expressão em todo o indivíduo ou órgão, se aplicada a indivíduos adultos dissecados. Finalmente, se necessário AFLIP poderia ser ligado a outros protocolos bioquímicos, como digestões enzimáticas de hidratos de carbono, para caracterizar melhor o receptor de interesse.
Semelhante a marcação de afinidade convencional, um ligando recém-125 I-marcado é fortemente recomendado. Dado a curta semi-vida de 125I, o ligando deve ser utilizado dentro das primeiras 2 semanas após a marcação com isótopos de fresco. Embora a maioria das advertências do protocolo ter sido mencionado nas etapas correspondentes, uma menção especial deve ser dada à remoção cuidadosa da gema, que deve ser o mais completa e uniforme possível. Deixando quantidades desiguais de gema resultaria na quantificação incorreta de proteínas de embriões de boa-fé nos lisados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disuccinimidyl suberate (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Gel Dryer Model 583 | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-78 | |
| Cobra II Auto gamma counter | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Crystal Sea Marine Mix | Marine Enterprises International | http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
References
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- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
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