Protocol
Todos los experimentos llevados a cabo en animales fueron aprobados por el Comité para el Laboratorio de Cuidado y Uso de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) Animal, bajo el número CICUAL-Protocolo: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México").
1. Preparación de extracto de proteína de embriones
- Recoger 100 - 200 embriones para cada condición de comparar (morphants vs tipo salvaje) en la etapa deseada, por ejemplo, 72 h después de la fecundación (HPF).
- Coloque los embriones en placas de Petri que contienen los peces de agua (ver Tabla 1) y dechorionate manualmente embriones utilizando unas pinzas de punta fina. Evitar el uso de pronasa durante este paso (o cualquier otra proteasa durante todo el protocolo), ya que puede digerir el receptor diana.
- Coloque los embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se lavan los embriones twhielo con solución tampón de fosfato 1x (PBS) (véase la Tabla 1).
- Añadir 500 l de tampón deyolk (ver Tabla 1).
- Liberar la mayor parte de la yema pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo (aproximadamente 30 - 40 veces) los embriones en la solución. Para el 72 y 48 HPF embriones HPF utilizar azul y amarillo, puntas de pipeta, respectivamente. puntas amarillas puede ser necesario cortar un poco para evitar la destrucción de embriones. La liberación de yema de éxito se puede verificar mediante la observación de los embriones bajo el microscopio.
- Recoger los embriones por centrifugación a 600 xg durante 15 seg.
- Desechar el sobrenadante con cuidado utilizando una pipeta.
- Lavado de embriones dos veces con 500 l de tampón de lavado (ver Tabla 1) por agitación suave a la velocidad más baja.
- Recoger los embriones por centrifugación a 600 xg durante 15 seg.
- A partir de aquí, continuar con el procedimiento a 4 ° C.
- Desechar el sobrenadante con cuidado utilizando una pipeta.
- embriones resuspender en 350 l de tampón de lisis (véase la Tabla 1) y homogeneizar usando una mano de mortero de plástico.
- Incubar los embriones lisadas 30 min con agitación en un agitador tubo de ensayo a 4 ° C.
- Centrifugar lisaron embriones a 11.000 xg durante 15 min con el fin de eliminar los residuos insolubles.
- Transferencia aclaró sobrenadante usando una pipeta a un tubo nuevo.
- Determinación de proteínas totales mediante el ensayo de proteínas de Bradford 4, u otro procedimiento adecuado. Si se utiliza el ensayo de Bradford, lleve a cabo la curva de calibración en presencia de concentraciones equivalentes de los detergentes presentes en el tampón de lisis, ya que provocan una subestimación de la proteína estándar 4.
2. Detección de proteína endógena Receptor
- Etiquetado de afinidad e inmunoprecipitación (todos estos pasos a 4 ° C)
- Coloque 400-500 g de proteína total de embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y diluir a 1 g / l con tampón 1 (ver Tabla 1).
Nota: Con el fin de obtener 500 g de proteína total del embrión, a unos 100 - 200 embriones deben ser procesados inicialmente. 72 HPF embriones producen rutinariamente ~ 5 g de proteína embrión total, que es suficiente para la detección betaglicano. - Añadir suficiente volumen de TGF-β2 etiqueta de valores para alcanzar una concentración final de 150 pM y se incuba con agitación en un tubo de ensayo basculante 2 horas a 4 ° C. TGF-β2 debe ser etiquetado antes de iniciar AFLIP, con 125 I por el método de la cloramina T como se describe por Cheifetz et al. 5.
PRECAUCIÓN: El uso de blindaje para minimizar la exposición durante la manipulación marcado con 125I ligando. - Añadir suficiente volumen de anticuerpo sin diluir contra el receptor de interés con el fin de llegar a una dilución de 1: 100 y continuar la incubación durante otras 2 horas a 4 ° C (incubación puede ser O / N). Esta es la dilución óptima de antisuero # 31, que se utiliza en este estudio y descrito en otra parte 3, pero dependiendo de la calidad de la unatibody, una dilución mayor o menor puede ser la óptima.
- Añadir 50 l de perlas de unión a inmunoglobulina adecuado (por ejemplo, la proteína G-Sepharose, que se equilibró previamente en RTFP y se resuspendió 1: 5 de su volumen original en RTFP) e incubar durante 50 min con agitación en un agitador tubo de ensayo a 4 ° DO.
- Recuperar las cuentas por microcentrifugación a 11.000 xg durante 20 seg.
- Desechar el sobrenadante en un recipiente de basura radiactiva adecuada.
- Se lavan las IP-cuentas tres veces con 1 ml de tampón de lavado IP (ver Tabla 1), por agitación e microcentrifugación a 11.000 xg durante 20 segundos cada vez.
- Resuspender IP-perlas en 250 l de tampón de lavado IP.
- Añadir 1,5 l de suberato de disuccinimidilo (DSS, se disolvió en DMSO a 10 mg / ml). Preparar la solución de DSS justo antes de su uso en esta etapa.
- Incubar durante 15 min a 4 ° C con agitación.
- Con el fin de detener la reacción de reticulación, añadir 500 l Otampón de lavado f IP, suplementado con suficiente Tris-Cl pH 7,4 de stock para llegar a 25 mM Tris-Cl. Los grupos amino libres en Tris capturan DSS no reaccionado.
- Se centrifuga a 11.000 xg durante 20 segundos para recoger IP-cuentas y desechar el sobrenadante.
- Resuspender IP-perlas en 30 l de tampón reductor Laemmli.
- Hervir las muestras de 5 min a 94 ° C.
- Opcionalmente, el análisis de muestras en un contador gamma utilizando el protocolo del fabricante.
- Coloque 400-500 g de proteína total de embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y diluir a 1 g / l con tampón 1 (ver Tabla 1).
- Análisis de las muestras
- Las muestras sometidas a desnaturalización SDS-PAGE. Utilice poliacrilamida en el porcentaje adecuado para la masa del receptor y ejecutar gel bajo procedimiento estándar.
- Sumergir gel en solución de fijación (véase la Tabla 1) durante 30 min a TA.
- Lavar gel con agua destilada durante 15 min.
- Coloque gel en papel de filtro previamente hidratado y cubrir con papel film película.
- gel seco a 80 ° C durante 1 hr.
- Exponer en gel en una scre PhosphorImager blancoa temperatura ambiente en O / N.
- Analiza pantalla expuesta mediante un PhosphorImager usando el protocolo del fabricante.
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Representative Results
La Figura 1 muestra un resultado representativo obtenido con AFLIP. Las señales en el carril 1 provienen de la I-ligando 125 covalentemente ya sea a la proteína de pez cebra betaglicano núcleo (BG núcleo, por debajo del marcador de 150 kDa) o el núcleo de BG que ha sido procesada a su forma de proteoglicanos mediante la unión de los glicosaminoglicanos (GAG, frotis que van desde 170 kDa a la parte superior del gel). Este patrón de migración, una proteína núcleo agudo más un proteoglicano untado (debido a la heterogeneidad en la longitud de las cadenas de GAG), es característico de la TGFBR3 2. Dado que el DSS no enlaza covalentemente formado cada complejo único ligando-receptor, no es libre de 125 I-ligando que aparece en el frente de migración del gel (125 I-TGF-β2). Este ligando libre fue unido al receptor, y permaneció unido durante la inmunoprecipitación, pero ya que no se une covalentemente, individual durante el procedimiento de SDS-PAGE. Nonetheless, la fuerza de su señal todavía se correlaciona a la dada por el receptor marcado. Esto puede apreciarse mediante la comparación de los carriles 2 y 3. En 48 hpf los embriones de pez cebra exhiben cantidades inferiores de BG de 72 embriones HPF 3, que se pueden ver por las señales débiles en el núcleo GAG y BG, que corresponden a la intensidad de la señales dadas por el ligando libre que aparece en la parte frontal del gel (carril 2). Dado que los anticuerpos contra la rata BG 6 no tienen una reacción cruzada con la ZF BG, los anticuerpos cuando se utiliza en la AFLIP dieron ninguna señal, por lo tanto, sirve como control negativo (carril 3). Resultados negativos similares se obtuvieron con el suero pre-inmune del anticuerpo anti-ZF BG 3.
La Figura 2 muestra cómo AFLIP se puede utilizar para medir los niveles de expresión de un receptor dado en embriones sometidos a una manipulación experimental, en este caso, la disminución de betaglicano debido a morfolino en3 proyección. El carril 1 muestra el nivel de TGFBR3 en un embrión de tipo salvaje hpf 72, mientras que el carril 2 muestra el efecto de la administración de 7 ng de un morfolino dirigida al límite exon2-intron2 del transcrito primario ZF BG. Tenga en cuenta que la regulación hacia abajo BG obtenido con este morfolino no se reproduce por su control emparejado-MIS (carril 3). Estos resultados confirmaron que el fenotipo obtenido con este morfolino era específico para la caída de la TGFBR3 como se ha descrito antes 3.
Figura 1. Detección AFLIP de BG en embriones de pez cebra. De extracto de proteínas totales a partir de embriones a las 72 horas después de la fertilización (hpf) (carriles 1 y 3) y 48 hpf (carril 2) se sometieron a marcaje por afinidad 125 I-TGF-β2 seguido por IP con conejo anti-pez cebra BG (carriles 1 y 2, ZBG) o conejo anti-rata BG (carril 3, RBG) Como un control. En la autorradiografía BG puede detectarse sin GAG (núcleo BG) o como BG modificada con glucosaminoglucano (GAG). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. BG morfolino Desmontables detectado por AFLIP. 125 I-TGF-β2 de marcaje por afinidad de BG a partir de embriones no tratados WT (carril 1), microinyectados con BG específica morfolino (carril 2) o un control de desajuste (carril 3). Los conteos por millón (cpm) se recuperaron después se indican la inmunoprecipitación y la etapa de reticulación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Buffer | Composición |
| tampón 1 | 50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% de Triton X-100 |
| tampón Deyolk | NaCl 55 mM, KCl 1,8 mM, 1,25 mM NaHCO 3 |
| peces de agua | Ver Tabla de Materiales |
| solución fijadora | 50% CH3OH, 12% CH3COOH, 0,185% de HCHO |
| tampón de lavado IP | 10 mM Na 2 HPO 4, KH 2 PO 4 mM 2, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 0,1% de Triton X-100, 0,02% de SDS, pH 7,4 |
| tampón de Laemmli | 2% de SDS, 10% de glicerol, DTT 100 mM, Tris 60 mM (pH 6,8), 0,001% de azul de bromofenol. |
| tampón de lisis | 50 mM Tris-HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, 0,5% de Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% de sodio DeoxychOlate |
| PBS | NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4 |
| RTFP | 50 mM Tris-HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de Triton X-100 |
| tampón de lavado | NaCl 110 mM, KCl 3,5 mM, 2,7 mM CaCl 2, 10 mM Tris-HCl pH 8,5 |
Tabla 1: Composiciones de búfer
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Discussion
El uso de transferencias de Western con un anticuerpo específico contra una proteína de interés es una herramienta valiosa para estudiar su expresión durante la embriogénesis 7. Sin embargo, la inmunotransferencia de proteínas altamente glicosiladas no ha sido muy exitoso debido a su transferencia ineficiente y débil unión a nitrocelulosa o PVDF membranas 8,9.
Los proteoglicanos son un buen ejemplo de este inconveniente, debido a sus cadenas de glicosaminoglicanos unidos de forma covalente (GAG) que están cargados negativamente y no se unen bien a cualquiera de las superficies de poliestireno o membranas hidrofóbicas Blot. Además, la heterogeneidad de tamaño de las cadenas de GAG "se extiende" la proteína sobre un sector de la gel, reduciendo eficazmente su cantidad por unidad de superficie de la mancha. Además, si la proteína de interés tiene niveles bajos de expresión, su detección por transferencias Western regulares es una tarea difícil. El factor de crecimiento transformante de tipo III β receptor (TGFBR3) o betaglicano(BG), un receptor de membrana con dos sitios de unión de GAG en los mamíferos 1 y uno en el pez cebra 3, tiene todas estas propiedades. Si bien, los protocolos para superar estos obstáculos se han ideado, como la detección por el sistema complejo avidina-biotina (ABC) 10,11 o el immunobloting de proteoglicanos en membranas cargadas positivamente 12, no pueden resolver ambos problemas en el mismo protocolo. Tomando ventaja de la alta afinidad de BG para su ligando natural TGFβ2 y de la disponibilidad de un anticuerpo específico, AFLIP, una técnica que combina las ventajas de marcaje por afinidad y la inmunoprecipitación, la anteriormente discutida limitaciones de la detección de transferencia de western se pueden superar.
Marcaje por afinidad de los receptores unidos a la membrana con sus ligandos radiomarcados es una herramienta bien usado que ha sido fundamental para la identificación y caracterización de varios factores de crecimiento importantes receptores en células cultivadas 13-16.Mientras que en la afinidad convencional etiquetado de una monocapa de células se somete a covalente etiquetado ligando sobre la placa de cultivo de tejido y después se lisaron, en AFLIP los complejos ligando-receptor se forman primero en lisados de embriones, después se purificó por inmunoprecipitación y finalmente, covalentemente reticulados. Debido a su uso de ligandos radiomarcados, AFLIP es muy sensible y, en principio, puede ser adaptado a otros factores de crecimiento o receptores de citocinas los que se dispone un ligando marcado y una buena anticuerpo. Este potencial de AFLIP ayudaría a la detección de estos abundantes pero fisiológicos pertinentes moléculas bajas.
Debido a la variabilidad inherente en la etapa de reticulación de marcaje por afinidad, AFLIP no puede utilizarse para determinar cuantitativamente los niveles de los receptores medidos. Sin embargo, si se realiza con controles paralelos adecuados, puede proporcionar una medición muy exacta de los niveles relativos de su expresión. Como AFLIP utilizar extractos de proteína total, no se restricted a una localización celular específica del receptor, que revela su expresión en la totalidad del individuo o de órganos, si se aplica a los especímenes adultos disecados. Por último, si es necesario AFLIP podría estar vinculado a otros protocolos bioquímicos, como digestiones enzimáticas de hidratos de carbono, para caracterizar mejor el receptor de interés.
Al igual que en el etiquetado de afinidad convencional, es muy recomendable un ligando recién marcado con I125. Dada la corta vida media de 125 I, el ligando debe ser utilizado dentro de las primeras 2 semanas después de marcar con isótopo fresco. Aunque la mayoría de las advertencias del protocolo se han mencionado en los pasos correspondientes, una mención especial se dará a la cuidadosa eliminación de la yema, que debe ser lo más completa y uniforme posible. Dejando cantidades desiguales de yema daría lugar a la cuantificación incorrecta de la proteína de embriones de buena fe en los lisados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disuccinimidyl suberate (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Gel Dryer Model 583 | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-78 | |
| Cobra II Auto gamma counter | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Crystal Sea Marine Mix | Marine Enterprises International | http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
References
- López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
- Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
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