Summary
一种通过调节过程中样品干燥过程中衬底温度降低MALDI质谱离子信号的空间分异协议证明。
Protocol
注：此协议为减少与干滴法制备麦芽三糖和激肽片段（1-7）的空间异质性的发展。该协议包括三个主要步骤，包括准备和预处理，样品沉积和干燥，和质谱数据分析。的程序概述，并在下面更详细描述：
1.准备和预
- 清洗样品板
- 戴上丁腈手套，并用清洁剂和蒸馏水，去离子水（DDW）轻轻手洗样品板。
- 冲洗用甲醇（MeOH）和DDW样品板。
- 插入样品板在一个600ml烧杯中，用DDW填充。
- 超声处理在DDW样品板为在超声浴中（200瓦，40千赫）15分钟。
- 从烧杯中取出DDW和填充用甲醇烧杯中。
- 超声处理在MeOH样品板在超声浴（200瓦，40千赫）15分钟。
- 吹掉溶剂滴上用氮气板和保持样品板样品沉积之前干燥。
- 调节烘干室温度
注意：干燥室是一个35×20×45 立方厘米 （宽x深x高）丙烯酸室图1显示了干燥系统的图片。该腔室通过气体流量计以恒定的流率通入室温的氮气，以保持由所述干燥室内部安装了一个校准湿度计监测的低相对湿度条件。在装有编程的恒温循环器的干燥室的铜基块用于容纳不锈钢样品板。铜基块能够从5样品板温度调节至25℃。空气，铜基块和样品板的温度由K型热电偶监控。- 打开门，迅速投入样品板的铜基块然后关门。
- 手动调节气体流量计来设置氮气流速至10标准立方英尺每小时（SCFH）。
- 监测由湿度计和微调气体流量计在干燥室中的相对湿度，以确保相对湿度总是低于25％。
- 监测样品板的由K型热电偶的温度和手动调整水循环器温度，直到该样品板达到5℃下的实验或用于控制室温（25℃）。
注意：为了在一个设计温度稳定的样品板，水环温度通常设定为0〜小于设计的样品低5℃。例如，为了保持5℃，在样品板中，水环行器的温度设定在0〜2℃的范围内;保持样品板在25℃，水环行器的温度设定在23至25℃的范围内。 - 确保所需的温度和相对湿度样品沉积之前达到（ 表1）。
注：所有参数，以及用于与不同的样品板的温度的干燥方法其设置值示于表1。
注：在一个较低的样品板温度，如果室内大门是敞开的很长一段时间，可能会发生在样品板上冷凝水。如果出现冷凝水，关上门，直到水冷凝干燥就可以了不要存放任何样本。
- 矩阵和分析物溶液的制备
- 基质溶液的制备
- 制备0.1，用50％乙腈（ACN）M THAP溶液：50％DDW水溶液。
- 分析物的制备
- 准备10 -4与DDW中号麦芽三糖的解决方案。
- 在50％乙腈制备10 -5 M激肽片段（1-7）溶液（ACN）：50％DDW水溶液。
- 基质溶液的制备
2.样品沉积和干燥
- 预混物的0.1M THAP溶液0.25微升和0.25微升10 -4 M麦芽三糖或10 -5 M激肽片段（1-7）在微量离心管的解决方案。
- 涡3秒的混合溶液中。
- 离心2秒（2,000 XG）的混合溶液中，收集在离心管底部的溶液。
- 打开干燥室的门，小心地存放0.1微升与吸管样品板解决方案，并立即关门。
- 等待样品液滴干燥。
注：本典型地观察到的干燥时间具有不同的样品板的温度列于表1对于5℃的样品板的温度，在平均干燥时间为800〜1000秒;为25℃的样品板的温度，在平均干燥时间为100〜150秒EC。 - 干燥后，打开干燥室的门。
- 设置水循环器温度至室温（25℃）。
注意：如果该样品板是不断在室温（25℃）在干燥过程中保持跳过此步骤。 - 该样品板温度恢复到室温（25℃）后，从干燥室的样品板。
- 检查5倍的立体显微镜下样品形态和拍摄快照亮场图像。
注意：如果晶体形态并不如预期，有必要用相同的程序准备一个新的样品。典型的晶体形貌示于图2的上面板。
注意：在低的样品板的温度，如5℃的情况下，它预热样品板来带离干燥室的前室的温度很重要。当沉积的样品中， 不守预混搜索解决方案N的吸管在10秒内一角。 不要沉积样品后，再次使用预混液。 图2的上图显示具有不同的样品板的温度制备的样品的亮场图像。
3.质谱数据分析
- 质谱数据采集
注：制备后，将样品可以利用成像质谱进行分析。在目前的研究中，成像MS实验使用的是实验室自制同步的双极性TOF进行（DP-TOF）成像质谱仪。15商业MALDI-TOF质谱仪具有成像能力也适用于这样的实验。质谱仪以线性萃取并用优化的提取延迟正离子模式操作。离子的动能为20千伏。激光束尺寸为35微米的样品表面上的直径，并且每一个点的光谱是大街5激光发射愤怒。- 插入样品板进入MALDI质谱仪。
- 执行成像质谱分析，以在步骤2.1-2.9中制备的样品。
- 选择在结果窗口所示的质量列表的特征质量峰并点击“2D”绘制二维离子的图像。
注：对于麦芽三糖与THAP混合的特征峰sodiated麦芽三糖，质子THAP和sodiated THAP。用于与THAP混合激肽片段（1-7），特征峰包括质子激肽片段（1-7），质子化THAP和sodiated THAP。 - 点击弹出窗口中的调节按钮，以确定信号强度的上限和下限，并点击“保存图片”。此设置定义离子图像的对比度。
注意：在每个单独的数据集，裂化区域和示出低亮度的零点被消除。 - 观察比较离子与采取了一步2.9亮场图像的图像。
注：成像质谱和特定离子的图像的构造可以与商业仪器来实现。由于各种数据采集和分析软件时，用户应遵循由仪器供应商提供，以获得高品质的图像的软件指令。
- 数据分析
注：样品的异质性定量分析。在这个演示中，每个样本分为内部开发的分析离子的空间分布由软件的多个同心区。也可以使用单独的数据分析软件进行分析。- 点击在结果窗口中显示的离子图像中的空斑和裂化区以除去不重要的区域。
注：此过程定义离子形象的重要领域。 - 单击“查找边缘”按钮找到离子图像的最外层。
- 点击“扣除”保存在数据库中最外层的离子丰度的信息和同时除去从离子图像这一层。这代表最外层一个复选框会出现在结果窗口中的“输出数据”名单。
- 重复步骤3.2.2和3.2.3直到离子图像的中心被定义。
- 点击并在“输出数据”列表中选择所有的复选框，然后单击“导出”导出数据。
- 打开使用电子表格软件来计算每一层的平均离子丰度来获得离子的空间分布信息导出的数据。
- 点击在结果窗口中显示的离子图像中的空斑和裂化区以除去不重要的区域。
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Representative Results
亮场图像以及以5样品板温度和25℃制备麦芽三糖和激肽片段（1-7）的所述MS图像示于图1中 。在sodiated麦芽三糖，的离子信号主要填充的情况下在样品区域的周围时，它是在25℃的样品板温度制备。通过降低样品板温度至5℃，信号均匀在整个样品区填充。在5℃，准备样品时，唯一明显的缺点是，有比在25℃制备的样品更多的裂缝。质子缓激肽片段（1-7）的离子图像显示了类似的趋势，因为这些sodiated麦芽三糖。成像MS的结果表明，较低的样品板的温度下制备的样品可显著引入分子和降低异质性。
图3示出了用于下5和25℃的样品板的温度下制备麦芽三糖和激肽片段（1-7）的统计分析的结果。对于每个样品，平均强度进行归一化。在用25℃的样品板温度sodiated麦芽三糖的情况下，在中心的信号强度比为5℃下的样品板温度低得多。质子缓激肽片段（1-7）的结果也显示出较小的变化减小从25样品板温度至5℃时。
图1：样品干燥系统的图片。干燥室由丙烯酸制成。该室通入室温的氮气，以保持低的相对湿度条件。装备有编程恒温循环器的铜基块用于调节的不锈钢样品板的温度。温度计监测空气，铜基块，和样品板。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：降低样品板的温度使得更好的信号的均匀性的明场图像（上部的图像）以及麦芽三（a）和激肽片段（1-7）的MALDI图像（低级图像）（b）与THAP制备在不同的样品板的温度。该MALDI分别从总频谱，：和质子缓激肽片段（1-7）（757 M / Z）：图像通过提取sodiated麦芽三糖（527米/ Z）获得。离子图像的像素大小为35微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 信号变化减少作为样品板温度下干燥过程中降低的MALDI图像与麦芽三糖（a）和（b）根据不同的样品板的温度与THAP制备缓激肽片段（1-7）中获得。红色和蓝色的数据表明，在25和5℃的样品板的温度制备的样品，分别为。G“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
| 样品板温度（℃） | 样品 | 空气温度（℃） | 相对湿度（RH％） | 干燥时间（秒） |
| 五 | 与THAP麦芽三糖 | 20±3 | <25 | 800 - 1000 |
| 缓激肽片段（1-7）与THAP | ||||
| 25 | 与THAP麦芽三糖 | 25±3 | 100 - 150 | |
| 缓激肽片段（1-7）与THAP |
表1： 实验参数和在不同的样品板的温度的干燥条件。
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Discussion
根据以往的理论预测，液滴内温度引起的水动力流可以向外克服溶剂挥发诱导毛细血管流动。当温度液滴增加内梯度分子的这种内部再循环的效率提高。根据预测结果，保持样品板温度时低于5℃，同时保持其周围环境温度，再循环流动的液滴内的平均流速大于向外毛细管流动的速度的4倍左右。如果样品板温度是相同的环境中，再循环流的平均速度比向外毛细流慢1800倍。这一计算的结果表明，样品制备过程中减少样品板温度是有利的。实验观察同意这一预测。
样品板脾气ATURE应在整个样品制备过程。 表1中可以精确控制显示了典型的液滴的干燥时间，在不同的样品板上的温度0.1微升的样品。在板沉积样品溶液之前，重要的是要确保在样品板表面干燥。如果准备在低温下的样品时，会出现冷凝水，不建议样品溶液沉积，因为水珠凝结扩大样本地区和稀释的解决方案。因此，为了保持在干燥室的相对湿度在25％以下是重要的。此外，在低温下制备的样品时，该样品板应带离干燥室之前被预热到室温。虽然样品结晶完成后轻微水缩合不改变样本总体，显著缩合应该避免。
使用新鲜预混解决方案是RECOM谁料。一旦预混合溶液暴露于空气中，发生样品溶液的预结晶和最终晶体尺寸和形态可以改变。因此，在移液过程应以合理的效率进行，通常在10秒内，以防止移液管尖内从预结晶的样品液滴。建议观察显微镜下样品的形态，以确保合适的晶体形态是质谱分析之前生产的。如果晶体形态是不如预期的那样，重复必要在沉积过程。
根据我们的理论和实验研究，制备样品在环境条件下安装在低温样品板大大提高在MALDI-MS中的数据再现性和质量。随后的实验也显示信号强度的显著增强这种样品制备方法。用t获得的实验数据他的方法显着提高的MALDI质谱进行定量分析的可靠性。在涉及溶液成分或表面属性更改其它方法相比，8,16-18改变干燥条件是常规的样品更简单，更普遍适用。因此，大多数质谱用户可以在常规的应用从中受益。
改善MALDI信号均匀性与降低样品板温度也是有效的一些其他流行矩阵。例如，改进的α环糊精（α-CD）配THAP，α氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），为低温样品干燥条件下的矩阵信号同质最近已经报道14与改变的样品板的缺点温度是，该方法是目前不适合高通量分析，由于在低温条件下，长的样品的干燥时间。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) | Sigma-Aldrich | T64602 | |
| Bradykinin fragment (1-7) | Sigma-Aldrich | B1651 | |
| Maltotriose | Sigma-Aldrich | 47884 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 ml beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | this lab | ||
| Synchronized dual-polarity time-of-flight imaging mass spectrometer (DP-TOF IMS) | this lab | ||
| MALDI-TOF stainless steel sample target | this lab |
References
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