Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

مفهوم TERROIR تفسر من خلال العنب بيري الايض وTranscriptomics

Published: October 5, 2016 doi: 10.3791/54410
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1, 1, 1, 1, 1
1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche
* These authors contributed equally

Summary

توضح هذه المقالة تطبيق الايض غير مستهدفة، transcriptomics والتحليل الإحصائي متعدد المتغيرات إلى النصوص التوت العنب والأيض من أجل التبصر في مفهوم TERROIR، أي تأثير البيئة على الصفات النوعية بيري.

Abstract

يشير TERROIR إلى مزيج من العوامل البيئية التي تؤثر على خصائص المحاصيل مثل العنب (كرمة العنب الاوروبي) وفقا لموائل معينة وممارسات الإدارة. يوضح هذا المقال كيف يمكن الكشف عن بعض التوقيعات TERROIR في metabolome التوت وTranscriptome على من كورفينا الكرمة الصنف باستخدام التحليل الإحصائي متعدد المتغيرات. تتطلب هذه الطريقة لأول مرة خطة أخذ العينات المناسبة. في دراسة الحالة هذه، وقد تم اختيار استنساخ معين من الصنف كورفينا لتقليل الاختلافات الوراثية، وجمعت عينات من سبعة الكروم يمثلون ثلاثة مختلفة-مناطق الكلى خلال ثلاثة مواسم النمو المختلفة. ينصح نهج الايض LC-MS تشتته نظرا لحساسيته العالية، يرافقه معالجة البيانات بكفاءة باستخدام برنامج MZmine واستراتيجية تحديد المستقلب على أساس تحليل شجرة تجزئة. تحليل Transcriptome على الشامل يمكن تحقيقه باستخدام ميكروأرستحتوي على تحقيقات تغطي ~ 99٪ من مجموع الجينات الكرمة توقع، والسماح للتحليل المتزامن لجميع الجينات وأعرب تفاضلي في سياق TERROIRS مختلفة. وأخيرا، وتحليل البيانات متعدد المتغيرات على أساس أساليب الإسقاط يمكن استخدامها للتغلب على تأثير قوي، خمر معين، والسماح للالايض والبيانات transcriptomics إلى أن تكون متكاملة وتحليلها في التفاصيل لتحديد الارتباطات بالمعلومات.

Introduction

تحليل البيانات على نطاق واسع على أساس الجينوم، ترنسكربيتوم، proteomes وmetabolomes النباتات يقدم نظرة غير مسبوقة في سلوك الأنظمة المعقدة، مثل الخصائص TERROIR من النبيذ التي تعكس التفاعل بين النباتات الكرمة وبيئتهم. لأن TERROIR من النبيذ يمكن أن يكون مختلفا حتى عندما تزرع استنساخ الكرمة متطابقة في كروم العنب مختلفة، تحليل الجينوم هو من فائدة تذكر لأن الجينوم نسيلي متطابقة. وبدلا من ذلك فإنه من الضروري أن ننظر إلى العلاقات المتبادلة بين التعبير الجيني وخصائص التمثيل الغذائي التوت، التي تحدد سمات نوعية النبيذ. تحليل التعبير الجيني على مستوى الفوائد Transcriptome على من الخصائص الكيميائية مماثلة من كل النصوص، مما يسهل التحليل الكمي من خلال استغلال الخصائص عالمية مثل التهجين لتحقيقات ثبتوا على المجهرية. في المقابل، الأساليب التحليلية الشاملة في البروتينات لالثانية الايض أكثر صعوبة بسبب تنوع الفيزيائية والكيميائية كبير من البروتينات الفردية والأيض. في حالة الايض هذا التنوع هو أكثر تطرفا لأن الأيض الفردية تختلف كثيرا في الحجم، والاستقطاب، وفرة والتقلب، لذلك لا عملية الاستخراج واحدة أو المنهج التحليلي يقدم نهجا شموليا.

بين منصات تحليلية مناسبة لنواتج غير متقلبة، تلك القائمة على الأداء العالي اللوني السائل بالإضافة إلى قياس الطيف الكتلي (HPLC-MS) هي أكثر حساسية بكثير من البدائل مثل HPLC مع الأشعة فوق البنفسجية أو الصمام الثنائي للكشف عن مجموعة (HPLC للأشعة فوق البنفسجية، HPLC-DAD ) أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفي، ولكن التحليل الكمي من قبل HPLC-MS يمكن أن تتأثر الظواهر مثل تأثير مصفوفة وقمع أيون / تعزيز 1-3. التحقيق في مثل هذه الآثار خلال تحليل التوت العنب كورفينا بواسطة HPLC-MS استخدام مصدر تأين بالإرذاذ الإلكتروني (HPLC-Eأظهر SI-MS) أن السكريات والجزيئات الأخرى بأقل مرات الاحتفاظ تم الإبلاغ عنها بقوة، وربما يعكس أيضا عدد كبير من الجزيئات في هذه المنطقة، وذلك وفرة من الجزيئات الأخرى يمكن التقليل من شأنها، المبالغة أو تتأثر تأثير المصفوفة ولكن تطبيع البيانات للتأثير مصفوفة يبدو أن يكون لها تأثير محدود على 4،5 النتائج بشكل عام. تم تحسين طريقة وصفها هنا لتحليل الأيض المتوسطة القطبية التي تتراكم على مستويات عالية في التوت العنب أثناء النضج، والتي أثرت بشكل ملحوظ من قبل TERROIR. وتشمل الانثوسيانين، الفلافونول flavan-3-شريان الحياة، procyanidins، الفلافونويد أخرى، ريسفيراترول، stilbenes والأحماض hydroxycinnamic وحمض الهيدروكسي، التي تحدد معا اللون والطعم والخصائص المتعلقة بالصحة من النبيذ. يتم تجاهل الأيض الأخرى، مثل السكريات والأحماض العضوية الأليفاتية، لأن الكميات التي HPLC-MS لا يمكن الاعتماد عليها نظرا لمصفوفة يالحظر وقمع أيون الظواهر 5. ضمن نطاق القطبية التي اختارتها هذه الطريقة، فإن هذا النهج هو تشتته في أنها تهدف للكشف عن العديد من نواتج الأيض المختلفة ممكن 6.

وسهلت وسائل Transcriptomics التي تسمح الآلاف من سجلات الكرمة التي يتعين رصدها في وقت واحد من قبل توافر كامل الكرمة الجينوم تسلسل 7،8. وقد تطورت أساليب transcriptomics مبكرة على أساس الإنتاجية العالية كدنا] تسلسل مع ظهور الجيل المقبل من التسلسل إلى مجموعة من الإجراءات الموضحة مجتمعة تكنولوجيا الحمض النووي الريبي يليها. هذا النهج سرعان ما أصبحت الطريقة المفضلة للدراسات transcriptomics. ومع ذلك، مجموعة كبيرة من المؤلفات على أساس ميكروأري، والتي تسمح للآلاف من النصوص ليكون كميا في موازاة ذلك عن طريق التهجين، تراكمت لالكرمة. في الواقع، قبل أن يصبح RNA تسلسل وتعميم التكنولوجيا، العديد من المنصات ميكروأري التجارية مخصصة كانوضعت السماح Transcriptome على الكرمة التي يتعين تفتيشها بقدر كبير من التفصيل. من بين تشكيلة واسعة من المنصات، يسمح سوى اثنين من تحليل Transcriptome على الجينوم على نطاق 9. سمحت مجموعة معظم تطورت التهجين لمدة تصل إلى 12 عينة مستقلة على جهاز واحد، وبالتالي تقليل تكاليف كل تجربة. صفائف دون 12 لكل 135،000 تتألف تحقيقات 60 مير تمثل 29549 النصوص الكرمة. وقد استخدم هذا الجهاز في عدد كبير من الدراسات 10-24. وقد تم الآن وقف العمل بهذه الأنظمة الأساسية اثنين ولكن تم مؤخرا تصميم ميكروأري مخصص جديد ويمثل تطورا أكثر حداثة لأنه يحتوي على عدد أكبر من تحقيقات تمثل الجينات العنب المكتشفة حديثا إضافية 25.

مجموعات البيانات البيع الكبيرة التي تنتجها transcriptomics والايض تحليل تتطلب الأساليب الإحصائية المناسبة لتحليل البيانات، بما في ذلك تقنيات متعدد المتغيرات لتحديد العلاقات المتبادلة بين شكل مختلفالصورة من البيانات. تقنيات متعدد المتغيرات الأكثر استخداما هي تلك المبنية على الإسقاط، وهذه يمكن أن تكون غير خاضعة للرقابة، مثل تحليل المكون الرئيسي (PCA)، أو تشرف، مثل الإسقاط المتعامد ثنائي الاتجاه للهياكل الكامنة تحليل التمايز (O2PLS-DA) 26. بروتوكول المعروضة في هذه المقالة يستخدم PCA لتحليل البيانات استكشافية وO2PLS-DA لتحديد الفروق بين مجموعات من العينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. حدد المواد المناسبة وبناء خطة أخذ العينات

  1. بدء التجربة من خلال وضع خطة أخذ العينات المناسبة. لا يوجد نهج عام وشامل حتى تقييم كل خطة على أساس كل حالة على حدة. تأكد من أن خطة أخذ العينات وتنص أماكن أخذ العينات والأوقات وإجراءات أخذ العينات بدقة. انظر الشكل 1 لخطة أخذ العينات المستخدمة في دراسة الحالة هذه.
    ملاحظة: في دراسة الحالة هذه، تم جمع التوت العنب من استنساخ واحد (كرمة العنب الاوروبي السيرة الذاتية كورفينا، استنساخ 48) من سبعة الكروم التجارية في ثلاث مناطق مختلفة الكلي في محافظة فيرونا (بحيرة غاردا، فالبوليسيلا وسوافى). وتتلخص السمات الرئيسية لكل كرم في الجدول 1. وقد تم جمع التوت خلال ثلاثة مواسم النمو (2006، 2007، و 2008) في ثلاث نقاط الوقت، الموافق veraison (بداية نضج)، منتصف النضوج والثمار الناضجة.
    1. لكل من الانضمامات (فينeyard / سنة / النضوج مرحلة)، والحصاد 30 مجموعات من مواقع مختلفة على طول صفين الكرمة، مع المرتفعات والأماكن التي تظهر على النباتات العشوائية.
    2. اختيار ثلاثة التوت عشوائيا من كل مجموعة، وتجنب الذين يعانون من ضرر و / أو علامات العدوى مرئية.
    3. كرر الخطوات من 1.1.1 و 1.1.2 للحصول على ثلاثة حمامات مستقلة.
    4. Deseed التوت وتجميد القشرة مباشرة في النيتروجين السائل.
    5. سحق 10 التوت المجمدة من كل مجموعة مع طاحونة طاحونة التلقائي، وتقسيم كل عينة المجفف إلى قسمين متساويين، واحدة للتحليل transcriptomics واحدة لتحليل الايض.
    6. تخزين المساحيق في -80 درجة مئوية.
صباحا BA بي ام CS الاتحاد الانجليزي MN مساء
منطقة الكلية سوافى بحيرة غاردا فالبوليسيلا بحيرة غاردا فالبوليسيلا فالبوليسيلا سوافى
الارتفاع (م) 250 120 450 100 130 250 130
الجذر 41B S04 K5BB 420A 420A K5BB 41B
الاتجاه التوالي EW NS EW EW EW NS NS
نظام التدريب نظام النفقات العامة (العريشة) نظام النفقات العامة (العريشة) تبادل لاطلاق النار الرأسي لتحديد المواقع (جويو) نظام النفقات العامة (العريشة) Overheنظام الإعلانات (العريشة) تبادل لاطلاق النار الرأسي لتحديد المواقع (جويو) تبادل لاطلاق النار الرأسي لتحديد المواقع (جويو)
نوع التربة الطين الغريني طين طين طين الطيني الطمي الطميية الطيني
تخطيط الزراعة (م) 3.20 X 1.00 4.50 X 0.80 4.00 × 1.25 3.50 X 1.20 3.50 X 0.75 2.80 X 1.00 1.80 X 0.80
مجموع الجير٪ 3.9 19.3 18.3 14.4 31 5.9 27.9
النشطة الجير٪ 0.5 2.6 9.4 6.3 11.3 3.1 8.3
الرمال٪ 15 47 66 42 29 13 36
الطميية٪ 43 36 21 37 39 67 36
الطين٪ 42 17 13 21 32 20 28
حموضة التربة 8.3 7.9 7.8 8.2 8.2 7.8 7.9
مادة عضوية (٪) 2.9 2.5 2.2 1.2 2.9 1.6 2.5
الفوسفور صرف (ملغ / كغ) 26 73 73 68 48 47 64
البوتاسيوم للصرف (ملغ / كغ) 190 376 620 230 168 154 126
المغنيسيوم صرف (ملغ / كغ) 272 468 848 623 294 293 183
الكالسيوم صرف (ملغ / كغ) 6500 5380 7358 6346 4652 10055 2878
التوت السكريات المختزلة 2006 211.25 ± 1.20 176.20 ± 0.42 187.40 ± 0.00 203.70 ± 1.13 212.55 ± 0.64 195.20 ± 0.00 211.65 ± 0.64
التوت السكريات المختزلة 2007 190.00 ± 1.27 165.25 ± 0.49 153.00 ± 0.42 203.60 ± 0.71 210.90 ± 0.71 192.25 ± 0.64 188.70 ± 1.84
التوت السكريات المختزلة 2008 191.35 ± 0.64 178.90 ± 0.57 170.05 ± 0.49 205.15 ± 1.48 188.70 ± 0.57 169.35 ± 0.49 108.05 ± 1.06
التوت درجة الحموضة 2006 3.01 ± 0.01 2.96 ± 0.01 2.84 ± 0.00 2.9 ± 0.00 2.98 ± 0.00 3.02 ± 0.00 3.06 ± 0.01
التوت درجة الحموضة 2007 2.97 ± 0.00 3.00 ± 0.00 2.74 ± 0.00 3.07 ± 0.01 2.98 ± 0.00 2.87 ± 0.01 3.09 ± 0.00
التوت درجة الحموضة 2008 2.83 ± 0.00 3.04 ± 0.01 2.71 ± 0.00 2.98 ± 0.01 2.98 ± 0.00 2.82 ± 0.00 3.11 ± 0.00
حصاد التسجيل 2006 2007 2008
Veraison 8 أغسطس 18 يوليو 12 أغسطس
منتصف النضوج 4 سبتمبر 8 أغسطس 2-سبتمبر
يانع 18-سبتمبر 29-أغسطس 23-سبتمبر

الجدول 1: الميزات الرئيسية كل كرم وجمع العينات التواريخ. م = متر، EW = أكل والغرب، NS = بين الشمال والجنوب.
شكل 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للإجراءات أخذ العينات وتقع بمناطق الكلية ثلاثة إنتاج النبيذ في محيط مدينة فيرونا، منطقة فينيتو، إيطاليا. نقاط بعد ثلاثة هي veraison (V) تمثل بداية النضوج في زراعة الكروم، (MR) والثمار الناضجة (ص) النضوج المتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. إعداد بيري مسحوق مقتطفات، تحليل الأيضية ومعالجة البيانات

  1. تحضير عينات بيري مسحوق لتحليل.
    1. إعداد المستخلصات التمثيل الغذائي من العينات التوت في درجة حرارة الغرفة في ثلاثة مجلدات (ث / ت) من الميثانول المحمضة مع 0.1٪ (ت / ت) لحمض هيئة التصنيع العسكري في حمام بالموجات فوق الصوتية في 40 كيلو هرتز لمدة 15 دقيقة. استخدام المياه LC-MS-الصف وحمض الفورميك، وHPLC الصف الميثانول.
    2. أجهزة الطرد المركزي مقتطفات في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. تمييع طاف من الخطوة 2.1.2 في مجلدين (ت / ت) من الماء منزوع الأيونات ويمر عبر مرشح 0.2 ميكرون.
  2. تحليل مقتطفات بيري من قبل HPLC-ESI-MS.
    1. إعداد نظام HPLC-ESI-MS وفقا لتوصيات المورد.
      ملاحظة: في دراسة الحالة هذه، تتألف الإعداد نظام HPLC مجهزة الاوتوماتيكى، متصلة في خط مع مطياف الكتلة فخ ايون ومصدر تأين بالإرذاذ الإلكتروني.
    2. ربط نظام HPLC مع عمود C18 حارس (7.5 × 2.1 مم 2) وعمود المرحلة C18 عكس (150 × 2.1 مم 2، حجم الجسيمات 3 ميكرون).
    3. إعداد المذيبات المستخدمة كمرحلة النقالة. استخدام 5٪ (ت / ت) الأسيتونتريل، 0.5٪ (ت / ت) وحامض الفورميك في الماء كمذيب وو 100٪ الأسيتونتريل كما قolvent B. استخدام الأسيتونتريل LC-MS-الصف والماء وحمض الفورميك.
    4. تشغيل الفصل HPLC مع الانحدار الخطي من المذيبات A و B في معدل تدفق ثابت من 0.2 مل دقيقة -1 باستخدام حجم حقن عينة من 30 ميكرولتر.
      1. تتوازن في البداية العمود مع 100٪ المذيبات ألف. وبعد حقن عينة، إنشاء التدرج من 0٪ إلى 10٪ المذيبات B في 5 دقائق، من 10٪ إلى 20٪ المذيبات (ب) في 20 دقيقة، من 20٪ إلى 25٪ المذيبات B في 5 دقائق، ومن 25٪ إلى 70٪ المذيبات B في 15 دقيقة.
      2. تحليل كل عينة في مكررة. بطريقة عشوائية تحليل العينات لتجنب الآثار يحركها الصك. سماح 20 دقيقة لإعادة موازنة مع 100٪ مذيب بين كل تحليل.
    5. الحصول على أطياف الشامل في أوضاع سلبية وإيجابية بديلة التأين. للحصول على نتائج وصفها في دراسة الحالة هذه، تعيين المعلمات كما في الجدول 2. يعتمد إعداد الجهاز الدقيق على منصة محددة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم دعوى أخرىأساليب قادرة وفقا لمنصة محددة.
      1. في جميع الحالات، كما هو الحال مع أي منصة الانفصال، تأكد من استخدام وقت إعادة موازنة-مناسبة، من أجل الحصول على الاحتفاظ وقت التكاثر. عندما يكون عدد العينات مرتفعة (أكثر من عشرة عينات) وتحليلها في دفعات من 9-10 العينات، مع برامج التنظيف العمود الكروماتوغرافي (التدرجات بطيئة بين المذيبات شطف اثنين) بين كل دفعة. لديك ما يكفي من الوقت الاحتفاظ استنساخ، تأكد من أن التحليل الكروماتوغرافي الأول من كل دفعة هو تحليل فارغة (أي تحليل المذيب).
    6. الحصول أيضا أطياف الشامل في أوضاع الأيونات السالبة والإيجابية مجزأة تحديد الخيارات تجزئة (اثنان السلائف أيون، MS 3). علق الأيض عن طريق تحليل شجرة تجزئة (MS / MS و MS 3) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: هذا هو مناسبة خاصة لنواتج الأيض المصنع لأنها غالبا ما الغليكوزيلاتي، ذرefore تفتيت الأول (MS / MS) يميل إلى إزالة جزيئات السكر ترك أيون الجزء اللاسكري الحرة، ولاحق تجزئة (MS 3) يساعد على التعرف على الجزء اللاسكري ضد مكتبة المعايير الأصيلة.
    7. الحصول على MS / MS و MS 3 الأطياف في م / ض مجموعة 50-1،500 مع اتساع تجزئة 1 خامسا بدلا من ذلك، استخدام طرق أخرى مناسبة وفقا لمنصة محددة.
    8. لكل إشارة م / ض، مقارنة MS / MS و MS 3 أنماط التشرذم ومرات الاحتفاظ إلى مكتبة المعايير الأصيلة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: نوع العديد من المنصات وتشمل المرافق البرمجيات لبناء هذا النوع من المكتبة من خلال تحليل المعايير الأصيلة. هذا ينبغي أن تحدد الكثير من الإشارات ولكن سيتم شرحها ليست كل الإشارات.
    9. للإشارات مجهولة المتبقية، مقارنة MS / MS و MS أنماط 3 تجزئة مع تلك التي نشرت في الأدب، البحث في الانترنتهينج للقيم / ض م (أي أرقام "م / ض 353" للبحث عن المنشورات التي الجزيئات مع هذه م / ض المذكورة) مع أي من محرك بحث مشترك متاحة بحرية، أو استخدام قواعد البيانات على الانترنت مثل MassBank (الشبكه .massbank.jp / EN / database.html) وقاعدة بيانات Metabolome الإنسان (www.hmdb.ca/search/spectra؟type=ms_search).
> لكتلة
مكونات مطياف الكتلة وظيفة المعلمات
Electrospray التأين المصدر Nebulizing الغاز 50 رطل، و 350 درجة مئوية
الغاز تجفيف 10 L دقيقة -1
فخ ايون وكاشف تفحص وضع المسح الضوئي الكامل، 13000 م / ض في الثانية الواحدة، ومجموعة 50-1،500 م / ض
400 م / ض
تصادم الغاز الهيليوم
ضغط الفراغ 1.4 × 10 -5 مليبار
مصدر الشعرية 4000 V
لوحة نهاية عوضت -500 V
مقشدة -40 V
كاب الخروج -121 V
1 أكتوبر العاصمة -12 V
2 أكتوبر العاصمة -1.7 V
عدسة 1 +5 V
عدسة 2 +60 V
للمحكمة الجنائية الدولية لوضع التأين إيجابي 20،000
للمحكمة الجنائية الدولية لوضع التأين السلبي 7000

الجدول 2: الرئيسي مجموعة المعلمة للحصول على الأطياف الشامل.

في الصفحة = "1" FO: المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">
عملية اختيار وظيفة المعلمات القيم
كشف الذروة الكشف الشامل النقطة الوسطى مستوى الضوضاء 3500
اللوني باني أعلى نقطة البيانات دقيقة زمنية 0.15
ارتفاع دقيقة 4000
م / ض التسامح 0.3
كشف الذروة deconvolution الذروة البحث الحد الأدنى المحلي عتبة الكروماتوغرافي 70
البحث الحد الأدنى في نطاق RT (دقيقة) 00:50
ارتفاع نسبي الحد الأدنى 15٪
ارتفاع المطلق الحد الأدنى 4000
نسبة دقيقة من الذروة أعلى / حافة 2
مجموعة مدة (دقيقة) 0-10
نظائر قمم النظائر الهامور - م / ض التسامح 1.2
RT التسامح 00:50
شكل رتيب لا
تهمة أقصى 3
النظائر تمثيلي لا
المحاذاة تاريخ اليجنر - م / ض التسامح 1.2
الوزن لم / ض 10
الاحتفاظ التسامح الوقت 00:50
الوزن لRT 5
تتطلب ولاية تهمة نفسها لا
تتطلب نفس معرف لا
قارن نمط النظير لا
ملئ الفجوة مكتشف الذروة - التسامح كثافة 20٪
م / ض التسامح 0.9
الاحتفاظ التسامح الوقت 00:40
تصحيح RT لا
تصفية تكرار مرشح الذروة - م / ض التسامح 1.2
RT التسامح 00:30
تتطلب نفس الهوية لا

الجدول 3: Mzmine العمل مع قيم معينة لمعالجة ملفات البيانات العنب التوت LC-MS السلبية.

  1. معالجة البيانات LC-MS.
    1. وصول أوتحميل حزمة برامج معالجة البيانات التي يمكن استخراج المعلومات ذات الصلة من العديد من الاستشرابية الخام وبناء مصفوفة البيانات التي يتم قياسها كل الأيض الكشف في كل عينة.
      ملاحظة: الخطوات بروتوكول مصممة أدناه للحصول على برمجيات المصدر المفتوح MZmine v2.14 (http://mzmine.sourceforge.net). وهو برنامج مفتوح المصدر لمعالجة البيانات مطياف الكتلة، مع التركيز الرئيسي على البيانات LC-MS. 27
    2. تحويل البيانات اللوني LC-MS في شكل netCDF باستخدام البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة للمعدات. للحصول على نتائج الموصوفة هنا، استخدم V5.2 بروكر DALTONICS المحترم وتحليل البيانات البرمجيات V3.2 وتنفيذ الخطوات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      (هي مختلف المحولات خالية من الأدوات المتاحة) ويمكن استخدام محولات أخرى: ملاحظة.
    3. استيراد ملفات .cdf في البرنامج.
    4. تنفيذ كشف الذروة، والمحاذاة، وملء الفجوة وذروة إجراءات الترشيح مع parametذكرت المتطلبات البيئية في الجدول 3.
      1. وكخطوة أولى، حدد ملف .cdf المستوردة، ثم انتقل إلى التصور → TIC / XIC متخيل. ضع المؤشر على قاعدة من أصغر قمة في اللوني واتخاذ ملاحظة حول الحد الأدنى للإشارة شدة أيون قاعدة. ثم انتقل إلى طرق البيانات الخام → كشف الذروة.
      2. حدد الكشف الشامل وملء مستوى إشارة للكشف عن الأيونات الفردية لكل من مسح وإنشاء قائمة أيون.
        ملاحظة: التحقق من الخوارزمية قبل إجراء الكشف الشامل - ذلك يعتمد على مطياف الكتلة. في حالتنا، نحن نختار النقطة الوسطى.
      3. حدد المخطط الاستشرابي البناء وملء مع مستوى إشارة إلى ربط نقاط البيانات من قائمة أيون وبناء اللوني لكل قيمة جماعية. انظر المعايير المحددة في دليل مطياف الكتلة لضبط مين الوقت سبان وم / ض التسامح.
      4. بعد ذلك، انتقل إلى قائمة الذروة طرق → الذروة كشف → المخطط الاستشرابي Deconvolution. حدد الخوارزمية المناسبة (في هذه الحالة المحلية الدنيا البحث) للسماح للفصل كل اللوني إلى قمم الفردية.
      5. يدويا تفقد الاستشرابية لمعرفة القيم المناسبة للمعلمات التالية. تعيين عتبة الكروماتوغرافي إلى 30٪ لإزالة الضوضاء والحد الأدنى بحث في نطاق RT إلى 2 (دقيقة) لتحديد وجود الحد الأدنى من السكان المحليين للتمييز بين قمتين.
      6. تعيين الحد الأدنى للارتفاع النسبي في 2.0. تفقد يدويا اللوني لتحديد الحد الأدنى للارتفاع المطلق للإشارة إلى أن يتوافق مع ذروة وليس إلى الخلفية؛ تعيين هذه القيمة كما المطلق الارتفاع (على سبيل المثال، 10،000 في التجربة قدم).
      7. تعيين الحد الأدنى نسبة الذروة الأعلى / الحافة إلى 1.1 لدولة الحد الأدنى من النسبة بين أعلى وأدنى شدة نقطة بيانات من ذروة إلى أن يعترف به الذروة الحقيقية.
      8. يدويا تفقد الاستشرابية لمعرفة أي هو الحد الأدنى للمدة من مختلف القمم في chromat المستخدمةشروط ographic (على سبيل المثال، بين 0.2 و 2 دقيقة، اعتمادا على المجمع، في التجارب المقدمة)، وبالتالي استخدام هذه القيم كما الذروة مدة المدى (دقيقة) لتعيين مجموعة من طول ذروة مقبول كما المدة.
      9. ثم انتقل إلى الذروة في قائمة طرق → النظائر → النظائر قمم الهامور إلى مجموعة النظائر في قمة واحدة، وعادة في أشده. ملاحظة: تعتمد المعلمات على قرار من مطياف الكتلة واستنساخ مرات الاحتفاظ.
      10. وأخيرا، انتقل إلى الذروة في قائمة طرق → محاذاة → تاريخ أليجنر لمحاذاة القمم اعتمادا على م / ض والاحتفاظ بها وقتهم باستخدام نقاط المباراة.
    5. بعد محاذاة القمم، لسد أية ثغرات البيانات عن طريق النقر على قمة قائمة طرق → الفجوة ملء → الذروة الباحث. وأخيرا، فلتر نقاط البيانات المكررة عن طريق النقر على قائمة الذروة طرق → تصفية → تكرار تصفية الذروة.
    6. تصدير بيانات الناتج كما في .csالملف الخامس.
    7. تغيير يدويا. تمديد CSV إلى التمديد النص. إذا لم يكن هناك ملحقات الملفات مرئية، تغيير إعدادات الكمبيوتر للكشف عن امتدادات الملفات. انتقل إلى ملف مستكشف خيارات → عرض → إعدادات متقدمة، ثم قم بإلغاء خانة "إخفاء ملحقات الملفات لأنواع الملفات المعروفة".
    8. استيراد ملفات .txt في جدول بيانات. وهذا ينتج مصفوفة البيانات فيها جميع نواتج الكشف، معترف بها من قبل وقت رقم الهوية، م / ض قيمة والاحتفاظ بها، وكميا في جميع العينات من حيث القيم المنطقة ذروتها.

3. إعداد بيري مسحوق خلاصات لتحليل Transcriptome على ومعالجة البيانات

  1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من عينات بيري وتحديد نوعية الحمض النووي الريبي.
    1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من عينات بيري.
      ملاحظة: في هذه الدراسة الحالة، مجموعة الملكية وإجراء تعديل يضمن إزالة كاملة من الجزيئات التي بينFERE مع تحليل الحمض النووي الريبي، مثل السكريات ومادة البوليفينول، استخدمت. هي التعليمات التالية محدد لهذه المجموعة 18.
      1. تزن 400 ملغ من مسحوق التوت لكل عينة، تقسيمه إلى جزأين ووضع 200 ملغ في كل من اثنين من أنابيب microfuge.
      2. إضافة 900 ميكرولتر من محلول تحلل تحتوي على بيتا المركابتويثانول (المنصوص عليها في عدة) لكل 200 ملغ من مسحوق ودوامة فورا وبقوة لمدة 30 ثانية على الأقل. تسخين العينة على 56 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تهتز في 800 دورة في الدقيقة.
      3. الطرد المركزي العينات في السرعة القصوى في microfuge الفوق لمدة 10 دقيقة لتكوير الحطام الخلوية.
      4. الماصة 700 ميكرولتر من طاف في العمود الترشيح المنصوص عليها في عدة (حلقة التجنيب الأزرق) يجلس في أنبوب جمع 2 مل. أغلق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة في microfuge الفوق لمدة 1 دقيقة لإزالة الحطام المتبقي. كرر هذه الخطوة مرتين باستخدام نفس العمود الترشيح ولكن أنبوب جمع جديدة، مما أدى إلى ثلاثة طنubes تحتوي كل منها على ~ 700 ميكرولتر من المحللة توضيحها.
      5. الماصة 750 ميكرولتر من حل ملزم (مرفق في المجموعة) في كل أنبوب المحللة أوضح وتخلط على الفور من قبل pipetting صعودا وهبوطا خمس مرات على الأقل. نقل 700 ميكرولتر من هذا الخليط إلى العمود الملزمة المنصوص عليها في عدة (حلقة التجنيب الأحمر) يجلس في أنبوب جمع 2 مل. أغلق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة في microfuge الفوق لمدة 1 دقيقة لربط الحمض النووي الريبي.
      6. صب جزء التدفق من خلال عكس أنبوب جمع واضغط عليها لفترة وجيزة على وسادة نظيفة من ورقة ماصة لتصريف السائل المتبقي.
      7. العودة العمود إلى أنبوب جمع والماصة الخليط المتبقي في نفس العمود وتكرار الطرد المركزي والخطوات الصب. كرر حتى يتم تصفية الخليط كله في نفس العمود ملزم الأحمر.
      8. الآن اتبع الإرشادات المتبقية في المجموعة وأزل الحمض النووي الريبي في شطف العازلة 50 ميكرولتر (المتوفرة في عدة) ومخزن طر -80 ° C جاهزة للخطوات مراقبة الجودة.
    2. تحديد كمية ونقاء من الحمض النووي الريبي باستخدام معمل. تسجيل نسب الامتصاصية التي تكشف عن درجة التلوث مع البروتينات (A 260/280) والبوليفينول / السكريات (A 260/230).
      ملاحظة: RNA مناسبة لتهجين ميكروأري يجب أن يسجل 1.8 على الأقل لكل من النسب.
    3. تحديد سلامة الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: أنظمة مختلفة يمكن استخدامها. تم استخدام المستحوذ الرقمي الذي ينفذ المدى الكهربي الشعري في تركيبة مع صبغة الفلورسنت في دراسة الحالة هذه. يجب أن يكون RNA مناسبة لتهجين ميكروأري والنزاهة عدد RNA (رين) من 8 على الأقل.
  2. إعداد العينات وهجن الحمض النووي الريبي لميكروأري مخصص.
    1. ضبط كمية بدءا من الحمض النووي الريبي مجموع لتحليل ميكروأري إلى 200 نانوغرام عن طريق تمييع الحل RNA التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.1.8 بالماء ريبونوكلياز خالية منزوع الأيونات. إضافةكمية مناسبة من الحمض النووي الريبي لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل في الحجم النهائي من 1.5 ميكرولتر.
    2. إضافة 2 ميكرولتر من مزيج ارتفاع المخفف لكل عينة الحمض النووي الريبي واتبع إرشادات الشركة المصنعة لتجميع أول كدنا] حبلا، تدوين ذلك في كرنا وتسمية كرنا مع 3CTP cyanine.
    3. تنقية كرنا المسمى وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وأزل في 30 المياه خالية من ريبونوكلياز ميكرولتر.
    4. تحديد النشاط المحصول ومحددة من كل كرنا عن طريق تسجيل ثلاثة القيم على معمل: cyanine 3 تركيز الصبغة (بمول ميكرولتر -1)، نقاء الحمض النووي الريبي (A 260/280) وتركيز كرنا (نانوغرام ميكرولتر -1). استخدام الصيغ الموجودة في دليل تعليمات الشركة المصنعة لحساب العائد كرنا (ميكروغرام) ونشاط محدد (بمول و Cy3 في كرنا ميكروغرام).
      تختلف الموصى بها الغلة وأنشطة محددة على أساس شكل ميكروأري محددة: ملاحظة. في دراسة الحالة هذه كان شكل 44K 4-حزمةالمختار، كان العائد أوصى 1.65 وكان نشاط معين 9.
    5. تصميم ميكروأري مخصصة باستخدام البرمجيات المناسبة لتصميم التحقيق.
      1. للحصول على نتائج وصفها في دراسة الحالة هذه، إعداد ميكروأري مخصص جديد، مصممة على شكل 44K 4-حزمة باستخدام أحد تطبيقات على شبكة الإنترنت لتصاميم ميكروأري العرف والمكتبات النوكليوتيد. تحقيقات التصميم لتتناسب 34651 النصوص المستهدفة، بما في ذلك 29971 وتوقع المحاضر من بينوت نوير V1 مجموعة، 4500 مواضع جديد المحددة في الصنف بينو التي كتبها كورفينا إعادة الإعمار Transcriptome على و 180 الجينات كورفينا خاصة 25.
        ملاحظة: شمل ذلك إنتاج 34651 تحقيقات محددة 60-مير، تضم 29798 بينوت نوير توقع النصوص، 4392 جديد مواضع بينو و 179 الجينات كورفينا خاصة.
    6. إعداد الجمعية التهجين على أساس مواصفات الشكل 4-حزمة النحو التالي.
      1. ضع 1.65 ميكروغرام من كرنا المسمى و Cy3 في الحجم النهائي من 41.8ميكرولتر من الماء ريبونوكلياز خالية منزوع الأيونات. إضافة 11 ميكرولتر من 10X حجب عامل و 2.2 ميكرولتر 25X تجزئة العازلة. احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام الحراري لتفتيت الحمض النووي الريبي. بارد فورا على الجليد ل1min.
      2. أخيرا، إضافة 55 ميكرولتر من العازلة التهجين 2X، وتخلط جيدا من قبل pipetting وتدور لمدة 1 دقيقة في 15500 x ج في RT. وضع على الفور أنبوب microcentrifuge على الجليد. استخدام على الفور، لا تخزينه.
    7. تحميل ميكروأري مخصصة على النحو التالي.
      1. تحميل الشرائح طوقا مع التسمية مواجهة في قاعدة غرفة التهجين. ببطء تحميل 100 ميكرولتر من العينة التهجين التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.2.6.2 على كل طوقا جيدا، والاستغناء السائل مع غيض من ماصة، وتجنب الفقاعات.
      2. وضع ببطء ميكروأري المخصصة لأسفل، وضمان أن الباركود الرقمية ومواجهة. تأكد من أن هذا الزوج شطيرة يتم محاذاة بشكل صحيح. وأخيرا وضع غطاء غرفة التهجين على ورطةالشرائح واليد تشديد المشبك على الغرفة. تدوير غرفة تجميعها لتقييم التنقل من الفقاعات.
    8. ضع دائرة شريحة تجميعها في المشواة في التهجين وضع الفرن إلى 65 درجة مئوية. تعيين الدوار لتدوير في 10 دورة في الدقيقة. السماح التهجين المضي قدما لمدة 17 ساعة.
    9. المضي قدما في غسل ميكروأري الشريحة على النحو التالي.
      1. أولا، إعداد ثلاثة أطباق تلطيخ الشريحة وشغل لهم مخازن الغسيل المناسبة: 2 الأطباق مع الاحتياطي اغسل 1 في RT و 1 الطبق مع ما قبل تحسنت (37 ° C) الاحتياطي اغسل 2.
      2. تفكيك غرفة التهجين وإزالة شطيرة. مع الباركود الرقمية ميكروأري الشرائح مواجهة، غمر شطيرة في أول طبق الشريحة تلطيخ مليئة الاحتياطي اغسل 1 في RT و، بمساعدة ملقط نظيفة، فصل طوقا من الشريحة ميكروأري. بسرعة نقل الشريحة ميكروأري في رفوف الشريحة ووضعه في طبق الثاني الشريحة تلطيخ مليئة الاحتياطي اغسل 1في RT.
      3. وضع طبق الشريحة تلطيخ على محرك مغناطيسي وغسل 1 دقيقة مع التحريك المعتدل. بسرعة نقل رف الانزلاق الى الصحن تلطيخ الشريحة الثالثة مليئة قبل تحسنت (37 ° C) غسل العازلة 2 وغسل 1 دقيقة مع التحريك المعتدل.
      4. ببطء إزالة رف من الصحن تلطيخ الشريحة وإزالة بعناية الشرائح من الرف، وتجنب قطرات.
        ملاحظة: لا تقم بإضافة تريتون X-102 للمخازن الغسيل وتغفل خطوة الأسيتونتريل الغسيل.
    10. تخزين رقاقة غسلها في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  3. مسح ميكروأري واستخراج الميزات البارزة.
    1. ضع الشريحة ميكروأري إلى ماسح ضوئي مناسب ومسح كل مجموعة باستخدام إعدادات المعلمة الموصى بها في دليل إرشادات الشركة المصنعة ميكروأري ل. للحصول على نتائج وصفها هنا، وضع كل شريحة ميكروأري إلى حامل الانزلاق الى تسهيل إجراءات المسح.
    2. استيراد إخراج .shpملف في البرامج المناسبة التي هي قادرة على تحويل الإشارات الرقمية إلى القيم فلوري رقمية. التحقق من تقرير مراقبة الجودة للتأكد من أن إجراء التهجين كانت ناجحة.
      1. للحصول على نتائج وصفها هنا، استخدام إعدادات المعلمة الموصى بها في دليل التعليمات من ميزة البرنامج استخراج وفحص تقرير مراقبة الجودة لضمان أن المعلمات المدرجة في الجدول رقم 4 هي ضمن المعدل الطبيعي التي قدمتها الشركة المصنعة.
اسم المتري الحد الأعلى الحد الأدنى وصف
AnyColorPrcntFeatNonUnif 1.00 NA النسبة المئوية من الميزات التي هي ميزة القيم المتطرفة غير التوحيد في أي قناة
حد الكشف 2.00 0.10 متوسط ​​زائد 1 الانحراف المعياري من خصوصيات ارتفاع أقل من النطاق تركيز الخطي
absGE1E1aSlope 1.20 0.90 مطلقة من منحدر صالح للإشارة مقابل تركيز تحقيقات E1A
MedCVProcSignal 8.00 NA متوسط٪ السيرة الذاتية للإشارة المصنعة
gNegCtrlAveBGSubSig 5.00 -10.00 متوسط ​​خلفية طرح إشارة من جميع الضوابط السلبية inlier (يحسب BGSubSignal التي كتبها substracting قيمة تسمى BGUsed من ميزة يعني إشارة)
gNegCtrlAveNetSig 40.00 NA متوسط ​​إشارة صافي من جميع الضوابط السلبية inlier
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00 NA الانحراف المعياريطرح خلفية إشارات من جميع الضوابط السلبية inlier
gNonCntrlMedCVProcSignal 8.00 NA متوسط٪ السيرة الذاتية للإشارة المصنعة للتحقيقات غير مراقبة
gSpatialDetrendRMSFilter 15.00 NA المتبقي من يصلح خلفية detrending

الجدول 4: معلمات الرئيسية لفحصها للتحقق من جودة التهجين ميكروأري.

  1. معالجة البيانات ميكروأري.
    1. مرة واحدة وقد تم مسح جميع الشرائح ميكروأري وجرى تقييم لمراقبة الجودة بشكل إيجابي، وإعداد بيانات مصفوفة المفصول عن طريق تحديد القيم gProcessedSignal من كل ملف نتائج واحد subarray، وهو ما يمثل كثافة مضان الخام لكل التحقيق.
    2. في جدول بيانات، وتطبيع البيانات على المئين ال 75 داخل كل مجموعة (قيم P) وCALCULتناولوا في المتوسط من كل القيم P بين جميع المصفوفات الفرعية المختلفة لحساب نسبة R.
    3. ثم في نفس جدول البيانات، وتطبيع كل قيمة gProcessedSignal إلى نسبة R خاصة بها دون مجموعة.

4. إجراء التحليل الإحصائي التفصيلي لالايض والبيانات Transcriptomics

  1. إعداد برامج التحليل الإحصائي.
    ملاحظة: في هذه الدراسة حالة، وهو برنامج قادرة على أداء PCA، وقد استخدم PLS-DA وO2PLS-DA.
    1. استيراد الايض والبيانات transcriptomics. انتقل إلى ملف → مشروع منتظم جديد → مشروع منتظم جديد لاستيراد مصفوفة البيانات التي تم الحصول عليها مع برنامج MZmine. ثم انقر على تحرير → تبديل مصفوفة كاملة → الرئيسية وتعيين إنهاء معرف → الابتدائي والثانوي المناسب.
    2. يعني توسيط البيانات وتوسيع نطاقها وذلك باستخدام مقياس باريتو. في الصفحة الرئيسية نافذة، انتقل إلى تحرير → M1 وتغيير parame المناسبالنسب اعتمادا على البيانات. للحصول على نتائج وصفها هنا، تغيير مقياس من حدة التباين لالاسمية.
    3. حجم البيانات transcriptomics باستخدام الإعداد حدة التباين.
  2. إجراء التحليل الإحصائي متعدد المتغيرات.
    1. تنفيذ اتفاقية الشراكة والتعاون كما هو مبين في F igure 2. وفي دراسة الحالة هذه، PCA يكشف عن الاختلافات الرئيسية بين العينات، مما يعكس مراحل النضج المختلفة ومواسم الزراعة.
      1. في الإطار Workset، حدد PCA-X كنوع نموذج. الصحافة الاحتواء التلقائي. إيلاء الاهتمام لR2X (نائب الرئيس) وQ2 (نائب الرئيس) تقدر لأنها تعطي فكرة عن نوعية النموذج.
        ملاحظة: بشكل عام، وارتفاع القيم وأفضل نموذج، ولكن مع نماذج عالية جدا R2X (نائب الرئيس) قد الإفراط في احتواء البيانات. كما حكم التجريبية، نتوقف عن إضافة مكونات الرئيسية عندما تبدأ (نائب الرئيس) قيمة Q2 في الانخفاض.
      2. ثم حدد عشرات → مبعثر أن نرى المؤامرة التي تبين تجمع ممكن من العينات.
      3. تفقد PCAتسجيل قطعة أرض. إذا تم الحصول على نموذج جيد (Q2cum> 0.5)، استخدم نفس الفصول من عينات لبناء نموذج O2PLS-DA (الخطوة 4.2.2).
    2. بناء نموذجين O2PLS-DA باستخدام عينات مصنفة حسب منطقة الكلية والتحقق من صحة نماذج باستخدام اختبار التقليب مع 200 التباديل.
      1. تعيين الطبقات من خلال الذهاب الى الصفحة الرئيسية نافذة → الملاحظات الجديدة و→ M1 →. تعيين الطبقات المرجوة. ثم، تغيير نوع نموذج من PCA-X إلى O2PLS-DA. الصحافة الاحتواء التلقائي. تأكد من أن عدد من مكونات النموذج PLS-DA هو نفسه كما ان من O2PLS-DA.
      2. للتحقق من صحة النموذج O2PLS-DA، انتقل إلى تحليل CV-ANOVA ورؤية الحق ف قيمة. وعلاوة على ذلك، انقر على جديد كما هو الحال في النافذة الرئيسية → M2 وتغيير نوع نموذج من O2PLS-DA لPLS-DA. الصحافة الاحتواء التلقائي.
      3. الذهاب إلى تحليل → التباديل وتنفيذ 200 التباديل (دي-حدد خيار إعادة حساب التباديل).
        ملاحظة: يظهر الناتج النهائي نافذة فيها شو قيمة R2ضرب دينار عموما Y-axis في القيم تحت 0،4، في حين أن Q2 يجب ضرب الجزء السلبي من العمودي. إذا R2 و / أو Q2 قيم غير صحيحة، والحد من عدد من المكونات في كل من PLS-DA وO2PLS-DA النماذج.
      4. الشروع في تحديد M2 في المشروع نافذة وانقر على عشرات → مبعثر لرؤية مؤامرة وموقف الطبقات عينة. لمراقبة ما الأيض تميز واحد أو أكثر تحديدا الطبقات، انتقل إلى قطعة أرض / قائمة → مبعثر.
      5. تغيير نوع البيانات حدد للملاحظات والحمولات → أضف السلسلة وتعديل البند في المحور السيني والسلسلة في الانفصالى (المراسل) وبرد شركات في 1 و 2 أو مكونات أخرى عندما تكون موجودة، على التوالي.
      6. مع الزر الأيمن للماوس وضغطت على المؤامرة، انتقل إلى الملكية → اللون واختر بواسطة شروط للتمييز رموز المؤامرة بين الجزيئات والطبقات. الذهاب إلى تخطيط → تنسيق مؤامرة → المحور و / أو أنماط لتعديل مؤامرة مع الخصائص المطلوبة.
      3. <لى> وبناء على نتائج تحليل الايض O2PLS-DA، والاختلافات الموجودة في المستويات النسبية للالأيض أو فئات معينة من المركبات كما رسوم بيانية.
    3. وبناء على نتائج التحليل transcriptomics O2PLS-DA، استرداد وتعيين الجينات التضمين تفاضلي لجين علم الوجود (GO) التصنيفات 28.
    4. تحديد العلاقات بين مستويات الأيض والتعبير الجيني يدويا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أسفرت دراسة الحالة الموصوفة في هذه المقالة مصفوفة البيانات النهائية التي تضم 552 إشارات (ميزات م / ض) بما في ذلك الأيونات الجزيئية بالإضافة إلى نظائر، وadducts وبعض شظايا، كميا نسبيا بين 189 عينات (7 الكروم × 3 مراحل النضوج × 3 مواسم س 3 مكررات البيولوجية). لذا 104328 وبلغ العدد الإجمالي لنقاط البيانات. أدى تحليل شجرة تجزئة في الشرح من 282 ميزات م / ض، الموافق الأيض بالإضافة إلى adducts، نظائر وشظايا. وأظهر تحليل استكشافي للمصفوفة البيانات كاملة من قبل محكمة التحكيم الدائمة أن عينات عنقودية وفقا لمرحلة النضوج (veraison، وحان-النضج منتصف) على طول المكونات الرئيسية الأولى والثانية (T1-T2، الشكل 2A)، وفقا لموسم النمو جنبا إلى جنب المكون الثالث الرئيسي (T1-T3، الشكل 2B).

الشكل 2 SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg" />
الشكل 2: PCA للكلها مصفوفة البيانات الايض بدون اشراف PCA-X نتيجة المؤامرات مبعثر يظهر تجميع عينات الكرمة التي تم جمعها خلال ثلاثة مواسم النمو المختلفة (2006، 2007، و 2008) والنضوج مراحل (veraison، منتصف النضوج وناضجة التوت ). في المؤامرة الأولى (A) عينات عنقودية وفقا لمراحل النضج، في حين أن الثاني (B) التي تتجمع وفقا لموسم النمو. الألوان تبرز مراحل النضج كما الخضراء (veraison)، الوردي (منتصف النضوج) والأرجواني (الثمار الناضجة). تمثل رموز مواسم النمو: الدوائر (2006)، والساحات (2007) ومثلثات (2008) .Component T1: Q2: 0.34. R2X: 0،331، Q2cum: 0،304، مكون T2: Q2: 0.185. R2X: 0.155. Q2cum: 0.433. مكون T3: Q2: 0.145. R2X: 0.0924. Q2cum: 0.515.JPG "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كانت محكمة التحكيم الدائمة غير خاضعة للرقابة غير قادر على الكشف عن ملامح TERROIR محددة، التي كانت مخبأة تحت تأثير خمر السائدة، لذلك تم تطبيق نهج O2PLS-DA إشراف على مجموعتين من البيانات المنفصلة، أي التوت في veraison والثمار الناضجة تماما. وهذا يسمح للاستكشاف الاختلافات الأيضية التي تمثل ثلاثة مناطق الكلي (بحيرة غاردا، فالبوليسيلا وسوافى) على مرحلتين الأساسية للنضج، لتحديد التوقيعات TERROIR محددة تمثل هذه المناطق في هذه المراحل النضوج.

الشكل (3)
الشكل (3): O2PLS-DA من veraison والتوت العنب الناضجة. O2PLS-DA المؤامرات النتيجة مبعثر يظهر تجميع عينات الكرمة التي تم جمعها في بحيرة غاردا ( الأزرق)، سوافى (الخضراء) وفالبوليسيلا (الوردي)، مناطق الكلي في veraison (A) وعندما كانت الثمار الناضجة (B). والتأيض المسؤولة عن تجميع لوحظ في الفقرة (أ) و (ب) واضحة في قطع علاقة تحميل (C) و (D) على التوالي. مجموعة من المركبات، ممثلة في المثلثات، والأزرق للريسفيراترول وstilbenes والوردي للالانثوسيانين، والأخضر للأحماض الهيدروكسي hydroxycinnamic ووالأرجواني لflavan-3-شريان الحياة / procyanidins، والأصفر للمركبات الفلافونويد أخرى. ج: مكون P1: Q2: 0.278. R2X: 0.0529. Q2cum: 0.278. عنصر P2: Q2: 0.33. R2X: 0.0394. Q2cum: 0.608. باء: مكون P1: Q2: 0،353، R2X: 0.0639. Q2cum: 0،353، عنصر P2: Q2: 0.188. R2X: 0.0374. Q2cum: 0،541 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل (4)
الشكل 4: توزيع علامات الأيضية بين ثلاثة مناطق الكلي: بحيرة غاردا، سوافى، وفالبوليسيلا مستويات الأيض تعكس المتوسط ± الخطأ المعياري (ن = 18 للقردة وسوافى، 27 للفالبوليسيلا الكلي منطقة) من مختلف الغليكوزيلاتي و الانثوسيانين acylated، ريسفيراترول / stilbenes وفلافونيدات في التوت كورفينا ناضجة في ثلاثة مواسم النمو المختلفة (2006، 2007، و 2008). رسائل مختلفة تمثل المجموعات التي كانت مختلفة بشكل ملحوظ وفقا لما تقرره اختبار t (ع <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تحديد التوقيعات محددة من سبعة الكروم الفردية باستخدام خاصأوتوماتيكية المنهج الإحصائي 10. وقد تم بناء نموذجين O2PLS-DA، واحدة استكشاف الفروق بين التوت التي تزرع في المناطق الكلية ثلاثة في veraison، والآخر استكشاف الاختلافات في مناطق-الكلية ثلاثة من بين التوت ناضجة. وكانت النماذج عبر التحقق من صحة باستخدام اختبار التقليب (200 التباديل) تبين أن نموذج يصف التوت ناضجة عبر المناطق الكلية ثلاثة كان ساري المفعول، في حين كانت عينات بحيرة غاردا فقط تختلف عن عينات أخرى في veraison (لا يظهر).

المؤامرات درجة من النموذجين، والتي تثبت كيف يتم فصل عينات من المناطق الكلية ثلاثة في veraison والنضج وفقا للتوزيع الأيض، وتظهر في أرقام 3A و 3B. المؤامرات تحميل هذه نموذج معبرا عنها الانفصالى (المراسل)، أي العلاقة بين ص (فئة عينات) وف (من نواتج الأيض)، وتظهر في الشكلالصورة 3C و 3D. في المؤامرات تحميل، تمثل المربعات الحمراء فئة من عينات (-مناطق الكلي) ومثلثات ملونة تمثل نواتج الفردية. المسافة بين الأيض والعينات تعكس علاقاتهم. والتأيض وفقا لفئة الكيميائي مرمزة.

ونظرا للصحة الإحصائية منخفضة من طراز veraison كما هو موضح من قبل الاختبار التقليب، فمن المرجح أن تعاني من overfitting. ولذلك، فإن الملاحظات التالية تشير فقط إلى عينات التوت ناضجة، الذي كان ساري المفعول إحصائية نموذج. في المؤامرة تحميل هو مبين في الشكل 3D، وتحول stilbenes نحو منطقة الكلية بحيرة غاردا، في حين تحول فلافونيدات نحو بمناطق ماكرو سوافى وفالبوليسيلا. إذا ما أمعنا النظر في الأيض الفردية يكشف عن التوزيع غير المتماثل من الانثوسيانين، مع فاوانيدين ومشتقاته أكثر انتشارا في بحيرة غاردا الكلي منطقة والانثوسيانين أخرى أكثر انتشارا في الماكرو منطقة فالبوليسيلا (الشكل 4). بسيط الأنثوسيانين-3-O-غلوكوزيد هي أكثر انتشارا في الماكرو منطقة فالبوليسيلا في حين المشتقات acylated وcoumarated هي أكثر انتشارا في منطقة الكلى سوافى.

كان عنصر transcriptomics من دراسة الحالة هذه أصلا باستخدام منصة transcriptomics التي لم تعد معتمدة. ونتيجة لذلك، أنشأنا إجراء بديل، مع منصة تزال متاحة. منصة جديدة على المزيد من تحقيقات من القديم، بما في ذلك 249 أكثر نوير بينو توقع النصوص، 4392 التي تم تشخيصها حديثا مواضع بينو و 179 الجينات كورفينا خاصة 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توضح هذه المقالة الايض، transcriptomics والبروتوكولات التحليل الإحصائية المستخدمة لتفسير مفهوم TERROIR العنب التوت. تحليل الايض بواسطة HPLC-ESI-MS حساسة بما يكفي للكشف عن أعداد كبيرة من المركبات في وقت واحد، ولكن يتأثر الكميات النسبية من تأثير مصفوفة وقمع أيون / تعزيز. ومع ذلك، فقد تم استخدام نهج مماثل لوصف النضج وذبول ما بعد الحصاد من التوت كورفينا، وكان التصحيح من الآثار مصفوفة تأثير محدود على نتائج 5. وعلاوة على ذلك، كشفت متعددة أداة الدراسة بين المختبرات على نطاق واسع في الآونة الأخيرة لتحديد قوة النسبية للNMR وLC-MS لالايض غير المستهدفة باستخدام نفس العينات أن الأدوات والتكنولوجيات المختلفة أسفرت نتائج متسقة 6. دراسة الحالة الموصوفة هنا تشارك في جمع وتحليل عينات من ثلاث مراحل النضوج من سبعة كروم العنب في ثلاث الكلي ضمنها أكثر من ثلاثة مواسم النمو. هنا، تم التحقيق التوقيع TERROIR على مستوى منطقة الكلية (بحيرة غاردا وسوافى، ممثلة من قبل اثنين من الكروم لكل منهما، وفالبوليسيلا، ممثلة ثلاثة الكروم) باستخدام PCA وإحصاءات المتغيرات المتعددة O2PLS-DA. الاختلافات بين كروم العنب الفردية هي أكثر دهاء وتتطلب مناهج إحصائية أكثر تطورا والحساسة 10. خطوات مختلفة من البروتوكولات المقترحة حاسمة ويتعين النظر من أجل الإجابة بنجاح على الأسئلة البيولوجية حول التأثيرات TERROIR على نوعية العنب.

أولا وقبل كل شيء، وخطة أخذ العينات المناسبة أمر بالغ الأهمية: خيار استنساخ واحدة محددة للحد من الاختلافات الوراثية ومدة لعدة سنوات أخذ العينات يسمح لتسليط الضوء على حقيقية، والاختلافات سليمة بين مختلف TERROIRS. على الجانب الآخر، تم إجراء البحوث المقترحة في غضون فترة TERROIR الذي هو مناسبة خاصة لزراعة الكروم، وهذا يمكن مصغرةاآلثار على TERROIR الخلافات على نوعية العنب. وبالتالي، سيكون من المثير للاهتمام للغاية مقارنة نفس الصنف المزروع في منطقة أقل الأمثل، ولكن من الواضح، يمكن أن تكون هذه الكروم ببساطة غير متوفرة.

من الناحية الفنية، وهو فصل الأيض تكرار للغاية من خلال HPLC أمر بالغ الأهمية للحصول على مصفوفة بيانات جيدة، لأن ارتفاع الفروق في الوقت الاحتفاظ في مختلف التحليلات، وارتفاع عدد من الأخطاء في ذروة محاذاة في مجموعة البيانات النهائية. وبالتالي، فإنه من الأهمية الحاسمة لتحديد الوقت المناسب إعادة موازنة، لتقسيم العينات إلى دفعات من 9-10 العينات مع دورات التنظيف العمود الكروماتوغرافي بينهما واستخدام عينات فارغة كما العينة الأولى من كل دفعة. يتأثر LC-MS بدرجة معينة من عدم الاستقرار، مما قد يؤدي إلى اختلافات بين العينات التي يحركها الصك. هذه المشكلة يمكن حلها جزئيا العشوائي من تحليل العينات، كما هو مبين في هذه الورقة. لايمprovement الأسلوب هو استخدام العينات المناسبة لمراقبة الجودة في كل دفعة، التي يمكن أن توفر معلومات عن حالة النظام الأساسي. مزيج مركب القياسي المناسب (أي مركبات القياسية مع قيم م / ض ومرات الاحتفاظ تمتد على مدى م / ض والوقت الاحتفاظ كله المدى) وعينة التحكم الجديدة التي تم الحصول عليها عن طريق خلط أجزاء متساوية من مسحوق من جميع العينات يمكن إبلاغ عن منصة آثار وأيضا في نهاية المطاف أن تستخدم عن اللاحق تطبيع البيانات.

وكانت نقطة هامة أخرى من أجل مقارنة الايض وtranscriptomics النتائج إلى استخدام بالضبط نفس المواد (أي نفس العينات سحقت) لكل من التحليلات. في تحليل البيانات، فمن الأهمية بمكان أن استخدام أسلوب الإحصاء المناسب، مثل OPLS-DA، والذي يسمح التفسير السهل للاختلافات من حيث التعبير الجيني وتراكم المستقلب فيما يتعلق بأساليب مثل محكمة التحكيم الدائمة. واحدة من القيود الرئيسية لهذا النوع من النهج هوغياب وسائل قوية لtranscriptomics والبيانات الايض التكامل. تطوير أساليب مناسبة لأنواع مختلفة من ارتباط البيانات ضروري من أجل بناء علاقة قوية وموثوق بها بين transcriptomics والبيانات الايض.

الأساليب المذكورة في هذه المقالة كشفت بوضوح نضج والآثار خمر على metabolome التوت، ولكن تم تحديد التوقيعات الكيميائية محددة تمثل ثلاثة مناطق الكلية أيضا في الثمار الناضجة تحت تأثير خمر انتشارا. ومن المثير للاهتمام، فإن تحليل التوت veraison لم تسفر نموذجا صالحا إحصائيا، مشيرا إلى أن مفهوم TERROIR يتجلى في الغالب عن طريق التمثيل الغذائي التي تتراكم خلال النضوج (على سبيل المثال، الانثوسيانين وstilbenes) من تلك الموجودة بالفعل في التوت غير ناضج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mill Grinder IKA IKA A11 basic
HPLC Autosampler Beckman Coulter  - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter  - System Gold 127 Solvent Module HPLC
C18 Guard Column Grace  - Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column
C18 Column Grace  - Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
Mass Spectometer Bruker Daltonics  - Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap.
Extraction solvents and HPLC buffers Sigma 34966 Methanol LC-MS grade
Sigma 94318 Formic acid LC-MS grade
Sigma 34967 Acetonitrile LC-MS grade
Sigma 39253 Water  LC-MS grade
Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) Sartorius 17764
Softwares for data collection (a) and processing (b) Bruker Daltonics - Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b)
Spectrum Plant Total RNA kit Sigma-Aldrich STRN250-1KT For total RNA extractino from grape pericarps
Nanodrop 1000 Thermo Scientific 1000
BioAnalyzer 2100 Agilent Technologies G2939A
RNA 6000 Nano Reagents Agilent Technologies 5067-1511
RNA Chips Agilent Technologies 5067-1511
Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 Agilent Technologies 5188-5325
Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 Agilent Technologies 5188-5326
LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color Agilent Technologies 5190-2305
Kit RNA Spike In - One-Color Agilent Technologies 5188-5282
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242
RNeasy Mini Kit (50) Qiagen 74104 For cRNA Purification
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray Agilent Technologies G2514F-048771 
eArray Agilent Technologies - https://earray.chem.agilent.com/earray/
Gasket slides Agilent Technologies G2534-60012 Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization
Thermostatic bath Julabo -
Hybridization Chamber Agilent Technologies G2534-60001
Microarray Hybridization Oven Agilent Technologies G2545A
Hybridization Oven Rotator Rack Agilent Technologies G2530-60029
Rotator Rack Conversion Rod Agilent Technologies G2530-60030
Staining kit Bio-Optica 10-2000 Slide-staining dish and Slide rack
Magnetic stirrer device AREX Heating Magnetic Stirrer F20540163 
Thermostatic Oven Thermo Scientific Heraeus - 6030
Agilent Microarray Scanner Agilent Technologies G2565CA
Scanner Carousel, 48-position Agilent Technologies G2505-60502
Slide Holders Agilent Technologies G2505-60525
Feature extraction software v11.5 Agilent Technologies - inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA
SIMCA + V13 Software Umetrics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
  2. Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
  3. Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
  4. Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
  5. Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
  6. Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
  7. Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
  8. Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
  9. Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).
  10. Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
  11. Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
  12. Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
  13. Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
  14. Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
  15. Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
  16. Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
  17. Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
  18. Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
  19. Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
  20. Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
  21. Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
  22. Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
  23. Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
  24. Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
  25. Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
  26. Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
  27. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
  28. Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).

Tags

علم الوراثة، العدد 116، الايض، transcriptomics، TERROIR، الكرمة، والتحليل الإحصائي متعدد المتغيرات، تحليل المكون الرئيسي (PCA)، والإسقاط المتعامد ثنائي الاتجاه للهياكل الكامنة تحليل التمايز (O2PLS-DA)، والكيمياء الحيوية
مفهوم TERROIR تفسر من خلال العنب بيري الايض وTranscriptomics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dal Santo, S., Commisso, M.,… More

Dal Santo, S., Commisso, M., D'Incà, E., Anesi, A., Stocchero, M., Zenoni, S., Ceoldo, S., Tornielli, G. B., Pezzotti, M., Guzzo, F. The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics. J. Vis. Exp. (116), e54410, doi:10.3791/54410 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter