Summary
本文描述了为了深入了解风土概念， 即非靶向代谢组学，转录和多元统计分析，以葡萄果实成绩单和代谢产物的应用中，环境对果实品质性状的影响。
Abstract
风土指的是，根据特定的生境和管理实践影响作物的特性，如葡萄（ 葡萄 ）的环境因素的结合。本文将介绍如何某些风土签名可以使用多元统计分析小道消息科维纳品种的浆果代谢和转录组进行检测。该方法首先需要一个适当的采样计划。在这个案例研究中，科维纳品种的特定克隆选择遗传差异最小化，并从代表在三个不同的生长季节三种不同的宏观区域7葡萄园收集样品。一个不相关的LC-MS代谢物组学的方法是，由于其高灵敏度，建议使用MZmine软件和基于碎片树分析的代谢物的识别策略伴有有效的数据处理。可以使用微阵列可以实现全面的转录组分析含探针涵盖〜所有预测葡萄基因的99％，允许所有的差异表达的基因在不同风土的上下文中同时分析。最后，基于投影的方法多元数据分析可以被用来克服强特异性复古效果，允许代谢和转录数据被集成并详细分析以识别信息相关性。
Introduction
根据植物的基因组，转录组，蛋白质组和代谢组大规模数据分析提供了前所未有的洞察复杂系统，如葡萄酒的风土特性反映葡萄植物及其环境之间的相互作用的行为。因为即使在相同的葡萄无性系在不同的葡萄园种植葡萄酒的风土可以是不同的，基因组学分析是没有多大用处，因为克隆的基因组是相同的。相反，它是必要看看基因表达和浆果，决定葡萄酒的品质性状的代谢特性之间的相关性。基因表达在所有转录物的化学性质相似，它通过在芯片开发通用的特点，如杂交固定的探针有利于定量分析转录福利水平的分析。与此相反，普遍在蛋白质组学分析方法第二代谢是由于个别蛋白质和代谢物的巨大的物理和化学多样性更具挑战性。在代谢组学的情况下，这种多样性是更为极端，因为个体代谢物的大小，极性，丰度和波动性大大不同，所以不存在单一的提取工艺或分析方法提供了一个全面的方法。
之间合适的非易失性代谢物的分析平台，那些基于高效液相色谱耦合质谱（HPLC-MS）比等替代性HPLC用紫外线或二极管阵列检测器（HPLC-UV，HPLC-DAD敏感得多）或核磁共振（NMR）谱，但是通过HPLC-MS定量分析可以通过的现象，如基质效应和离子抑制/增强1-3的影响。这种影响通过HPLC-MS的科维纳葡萄果实的分析过程中使用电喷雾离子源（HPLC-E的调查SI-MS），表明糖和其他分子具有最低保留时间强烈低估，也可能反映在这一区域中的大数目的分子，而其它分子的丰度可能被低估，由基体效应高估或未受影响的的，但对基体效应的数据归一化似乎对总体结果4,5-影响有限。本文所描述的方法是成熟期间积聚在高水平葡萄浆果中等极性代谢物的分析优化，这是由风土显著影响。它们包括花青素，黄酮醇，黄烷-3-醇，花青素，类黄酮等，白藜芦醇，二苯乙烯，羟基酸和羟基苯甲酸，它们共同决定了颜色，口味和葡萄酒的健康相关的属性。其它代谢物，如糖和脂族有机酸，是由于基质短跑运动员忽略，因为定量通过HPLC-MS是不可靠T和离子抑制现象5。内通过该方法选择的极性范围，该方法是在它的目的是检测许多不同的代谢物尽可能6未定位。
转录方法，使成千上万的小道消息成绩单可以同时监控由完整的葡萄基因组序列7,8的可用性提供便利。基于高通量测序的cDNA转录早期方法已经发展下一代测序的到来进入统称为RNA测序技术的过程的集合。这种方法正迅速成为首选转录研究方法。然而，基于芯片，这也让成千上万的成绩单并行通过杂交来量化大量文献，积累了葡萄。事实上，在此之前RNA测序成为一种主流技术，很多专门的商用微阵列平台已经开发允许小道消息转录，并详细检查。在广阔的各种平台，只有两个允许的全基因组转录组分析9。最进化阵列允许在单个设备上多达12个独立样品的杂交，从而减少每个实验的成本。 12个子阵列的每个组成代表29549小道消息成绩单135000 60-mer的探针。该装置已在大量的研究10-24被使用。现在这两个平台已经停产，但一个新的定制芯片最近已经设计并表示最近的发展，因为它包含代表附加新发现的基因葡萄树25探头的更大的数字。
通过转录组和代谢组学分析产生的大数据集销售需要对数据进行分析合适的统计方法，包括多元技术来确定不同形式之间的相关性s的数据的。最广泛使用的多元技术是那些基于投影，并且这些可以是无监督，如主成分分析（PCA），或监督，如双向正交投影到潜结构判别分析（O2PLS-DA）26。在这篇文章中介绍的协议采用PCA进行探索性数据分析和O2PLS-DA来确定样本的群体之间的差异。
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Protocol
1.选择合适的材料和构造一个抽样计划
- 通过制定适当的采样计划，开始实验。有没有通用的和普遍的方法，使评价对案件逐案基础上每一项计划。确保抽样方案规定的抽样地点，时间和精确的抽样程序。参见图1在这种情况下，研究中使用的抽样方案。
注：在这个案例中，从单一的克隆（ 葡萄品种科维纳，克隆48）葡萄浆果从七个商业葡萄园收集于维罗纳省三个不同的宏观区域（加尔达湖，瓦尔波利塞拉葡萄酒和索阿韦）。每个葡萄园的主要功能如表1所示 。在浆果在三个时间点三个日渐长大的季节（2006年，2007年，和2008年），收集对应的转色期（成熟的发作），中熟和成熟的浆果。- 对于每个加入的（VINeyard /年/成熟期），从沿着两个藤行不同的位置，用随机高度和对植物的位置收获30集群。
- 从每个集群选择三个浆果随机，避免那些与可见的损伤和/或感染的迹象。
- 重复步骤1.1.1和1.1.2获得三个独立的游泳池。
- Deseed浆果和立即冻结果皮在液氮中。
- 粉碎从每个池10冷冻浆果用自动粉碎机，并且每个粉末样品分成两个相等的部分，一个用于转录分析，一个用于代谢分析。
- 储存在-80℃下的粉末。
| 上午 | BA | BM | CS | FA | MN | 下午 | |
| 宏区 | 索阿韦 | 加尔达湖 | 瓦尔波利塞拉葡萄酒 | 加尔达湖 | 瓦尔波利塞拉葡萄酒 | 瓦尔波利塞拉葡萄酒 | 索阿韦 |
| 身高（米） | 250 | 120 | 450 | 100 | 130 | 250 | 130 |
| 砧木 | 41B | S04 | K5BB | 420A | 420A | K5BB | 41B |
| 行方向 | EW | NS | EW | EW | EW | NS | NS |
| 培训系统 | 高架系统（凉亭） | 高架系统（凉亭） | 竖拍定位（盖特） | 高架系统（凉亭） | Overhe广告系统（凉亭） | 竖拍定位（盖特） | 竖拍定位（盖特） |
| 土壤类型 | 粉质粘土 | 壤土 | 粘土 | 壤土 | 粘壤土 | 粉质壤土 | 粘壤土 |
| 种植布局（M） | 3.20点¯x1.00 | 4.50点¯x0.80 | 4.00×1.25 | 3.50点¯x1.20 | 3.50×0.75 | 2.80点¯x1.00 | 1.80点¯x0.80 |
| 石灰总计％ | 3.9 | 19.3 | 18.3 | 14.4 | 31 | 5.9 | 27.9 |
| 活性石灰％ | 0.5 | 2.6 | 9.4 | 6.3 | 11.3 | 3.1 | 8.3 |
| 沙％ | 15 | 47 | 66 | 42 | 29 | 13 | 36 |
| 壤土％ | 43 | 36 | 21 | 37 | 39 | 67 | 36 |
| 粘土 ％ | 42 | 17 | 13 | 21 | 32 | 20 | 28 |
| 土壤pH值 | 8.3 | 7.9 | 7.8 | 8.2 | 8.2 | 7.8 | 7.9 |
| 有机物质（％） | 2.9 | 2.5 | 2.2 | 1.2 | 2.9 | 1.6 | 2.5 |
| 可交换磷（毫克/千克） | 26 | 73 | 73 | 68 | 48 | 47 | 64 |
| 交换性钾（毫克/千克） | 190 | 376 | 620 230 | 168 | 154 | 126 | |
| 可交换镁（毫克/千克） | 272 | 468 | 848 | 623 | 294 | 293 | 183 |
| 交换性钙（毫克/千克） | 6500 | 5380 | 7358 | 6346 | 4652 | 10055 | 2878 |
| 贝瑞还原糖2006年 | 211.25±1.20 | 176.20±0.42 | 187.40±0.00 | 203.70±1.13 | 212.55±0.64 | 195.20±0.00 | 211.65±0.64 |
| 贝瑞还原糖2007 | 190.00±1.27 | 165.25±0.49 | 153.00±0.42 | 203.60±0.71 | 210.90±0.71 | 192.25±0.64 | 188.70±1.84 |
| 贝瑞还原糖2008 | 191.35±0.64 | 178.90±0.57 | 170.05±0.49 | 205.15±1.48 | 188.70±0.57 | 169.35±0.49 | 108.05±1.06 |
| 贝瑞2006年pH值 | 3.01±0.01 | 2.96±0.01 | 2.84±0.00 | 2.9±0.00 | 2.98±0.00 | 3.02±0.00 | 3.06±0.01 |
| 贝瑞pH值2007 | 2.97±0.00 | 3.00±0.00 | 2.74±0.00 | 3.07±0.01 | 2.98±0.00 | 2.87±0.01 | 3.09±0.00 |
| 贝瑞pH值2008 | 2.83±0.00 | 3.04±0.01 | 2.71±0.00 | 2.98±0.01 2.98±0.00 | 2.82±0.00 | 3.11±0.00 | |
| 收获期 | 2006年 | 2007年 | 2008年 | ||||
| 转色期 | 8月 | 18月 | 12月 | ||||
| 中秋节成熟 | 4月 | 8月 | 2月 | ||||
| 成熟 | 18月 | 8月29日 | 23月 |
表 1：每个葡萄园的主要功能和样本采集日期。M =米，EW =吃西，NS =南北。 
图 1： 抽样程序的示意图三个葡萄酒生产宏观区位于城市维罗纳，威尼托大区，意大利的环境。这三个时间点都较成熟的葡萄种植的开始转色期（V），中熟（MR）和成熟的浆果（R）。 请点击此处查看该图的放大版本。
2.准备浆果粉提取物，分析代谢产物和处理数据
- 准备贝瑞粉末样品进行分析。
- 制备在室温下将浆果样品的代谢提取三卷（重量/体积）甲醇，0.1％酸化的（V / V）为麦克风酸在40千赫15分钟的超声浴。使用LC-MS级水和甲酸，和HPLC级甲醇。
- 离心提取液以16,000 xg离心在4℃下10分钟。
- 稀释来自步骤2.1.2上清在去离子水中的两卷（体积/体积），并通过一个0.2μm的过滤器。
- 通过分析HPLC-ESI-MS的浆果提取物。
- 根据供应商的建议设立的HPLC-ESI-MS系统。
注：在这个案例中，设置由配有自动进样器的高效液相色谱系统，连接线与离子阱质谱仪和电喷雾离子源。 - HPLC系统连接用C18保护柱（7.5×2.1毫米2）和一个反相C18柱（150×2.1 mm 2时，粒径3微米）。
- 准备作为流动相溶剂。用5％（V / V）乙腈，0.5％（V / V）甲酸的水作为溶剂A和100％乙腈为solvent B.使用LC-MS-级乙腈，水和甲酸。
- 以0.2ml分钟-1使用的30微升样品注入量的恒定流速运行用溶剂A和B的线性梯度的HPLC分离。
- 最初平衡用100％溶剂A中的列之后进样，从0％在5分钟内在20分钟内以建立一梯度至10％溶剂B，由10％至20％溶剂B，由20％至25％溶剂B在15分钟5分钟，从25％至70％溶剂B。
- 分析一式两份每个样品。随机取样分析，以避免仪器驱动的影响。允许重新平衡各分析之间100％的溶剂A 20分钟。
- 获得在替代负和正电离模式的质谱。对于本案例描述的结果，设置参数如表2，精密机械设定取决于特定的平台。
注：此外，使用其他套装根据具体的平台能够方法。- 在任何情况下，与任何分离的平台，确保使用合适的再平衡时，才能有保留时间重现性。当样本的数目是高（高于十个样本），分析它们在9-10样品批次，每个批次之间色谱柱清洗程序（两个洗脱溶剂之间缓慢梯度）。有足够的保留时间重现性，确保每批次的第一色谱分析是一个空白分析（ 即 ，溶剂的分析）。
- 还收购零散阴性和阳性离子模式设置选项碎片（二离子的前体，MS 3）质谱。注释通过根据制造商的说明碎片树分析（MS / MS和MS 3）代谢物。
注意：这是特别适合于植物的代谢物，因为它们通常糖基化，疗法安伏第一碎片（MS / MS）往往以除去糖部分留下游离的糖苷配基离子，以及随后的碎片（MS 3）有助于确定对一个可信标准库中的糖苷配基。 - 获得的MS / MS和MS 3谱与1 V备选的碎裂振幅的m / z范围50-1,500，使用根据特定平台的其他合适的方法。
- 对于每个M / Z信号，根据制造商的说明进行比较的MS / MS和MS 3碎裂模式和保留时间的真实标准库。
注意：许多类型的平台包括软件设施建设，通过地道标准的分析这种库。这应该找出很多的信号，但并不是所有的信号将被注解。 - 对于其余的匿名信号，与那些文献中公布的，变奏比较在MS / MS和MS 3碎裂模式兴为m / z值（ 即数字“M / Z 353”寻求在这样的M / Z提到分子出版物）与任何普通的搜索引擎免费提供，或使用在线数据库，如MassBank（WWW .massbank.jp / EN / database.html）和人类代谢组学数据库（www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search）。
- 根据供应商的建议设立的HPLC-ESI-MS系统。
| 质谱仪组件 | 功能 | 参数 |
| 电喷雾电离源 | 雾化气体 | 50磅，350℃ |
| 干燥气体 | 10升分钟-1 | |
| 离子阱和检测器 | 扫描 | 全扫描模式13000 米/每秒Z，范围50-1,500 M / Z |
| 400 米/ž | ||
| 碰撞气体 | 氦 | |
| 真空压力 | 1.4×10 -5毫巴 | |
| 毛细管源 | +4,000 V | |
| 端板偏移 | -500V的 | |
| 笊篱 | -40 V | |
| 出境章 | -121 V | |
| 10月1日DC | -12 V | |
| 10月2日DC | -1.7 V | |
| 镜头1 | + 5V | |
| 镜头2 | + 60V | |
| IC卡为正电离模式 | 20.000 | |
| ICC负电离模式 | 7000 |
表2：用于获取质谱主要参数集。
| 手术 | 选择 | 功能 | 参数 | 值 |
| 峰值检测 | 质量检测 | 形心 | 噪音水平 | 3500 |
| 色谱建设者 | 最高数据点 | 分钟的时间跨度 | 0.15 | |
| 最低高度 | 4000 | |||
| M / Z容差 | 0.3 | |||
| 峰值检测 | 山顶去卷积 | 本地搜索最低 | 色谱门槛 | 70 |
| 搜索在最小范围RT（分钟） | 0:50 | |||
| 最小相对高度 | 15％ | |||
| 最小的绝对高度 | 4000 | |||
| 峰顶/边缘的民比 | 2 | |||
| 时间范围（分钟） | 0-10 | |||
| 同位素 | 同位素峰石斑鱼 | - | M / Z容差 | 1.2 |
| RT宽容 | 0:50 | |||
| 单调造型 | 没有 | |||
| 最大充电 | 3 | |||
| 代表同位素 | 没有 | |||
| 对准 | 加入光刻 | - | M / Z容差 | 1.2 |
| 重量为M / Z | 10 | |||
| 保留时间公差 | 0:50 | |||
| 重量RT | 五 | |||
| 同样需要充电状态没有 | ||||
| 需要相同的ID | 没有 | |||
| 比较同位素模式 | 没有 | |||
| 间隙填充 | 山顶取景器 | - | 强度宽容 | 20％ |
| M / Z容差 | 0.9 | |||
| 保留时间公差 | 0:40 | |||
| RT修正 | 没有 | |||
| 过滤 | 重复峰值过滤器 | - | M / Z容差 | 1.2 |
| RT宽容 | 0:30 | |||
| 需要相同的识别 | 没有 |
表3：Mzmine工作流与特定的值来处理负LC-MS葡萄浆果数据文件。
- 过程中，LC-MS数据。
- Access或下载数据处理软件包，可以从许多原料提取色谱图的相关信息，并建立在每个检测代谢物每个样品定量数据矩阵。
注：下面的步骤协议量身定制的开源软件MZmine v2.14（http://mzmine.sourceforge.net）。这是质谱数据处理的开源软件，主要集中在LC-MS数据。27 - 使用由设备制造商提供的软件变换在LC-MS色谱数据转换成的netCDF格式。对于这里描述的结果，使用布鲁克·道尔顿君子V5.2和数据分析V3.2软件，并根据制造商的说明进行的步骤。
注：也可使用其它转换器（各种免费软件转换器可）。 - 导入.CDF文件到该软件。
- 实现与PARAMET峰值检测，校准，填缝和峰值滤波程序器报告在表3。
- 作为第一步，选择导入.CDF文件，然后去可视化→TIC /西昌展示台。把光标后在色谱图中的最小峰的底部，并注意到围绕基座离子的最小强度信号。然后去原始数据的方法→峰值检测。
- 选择质量检测和填充的信号电平来检测每个扫描单个离子，并创建一个离子列表。
注：检查算法执行质量检测之前 - 这取决于质谱仪。在我们的例子中，我们选择质心。 - 选择色谱生成器和与信号电平填充到从离子列表连接的数据点，并建立为每个质量值的色谱图。请参阅质谱仪的手动调节最短时间跨度和m / z公差指定的参数。
- 接下来，进入峰值列表的方法→峰值检测→色谱Deconvo（分辨率）。选择合适的算法（在这种情况下，本地最小值搜索），以允许每个色谱成单个峰的分离。
- 手动检查色谱图，找出合适的值以下参数。的色谱阈值设定为30％以去除噪声和在室温范围搜索最小为2（分钟），以确定最小的当地人的存在来区分两个峰。
- 2.0设置最小相对高度。手工检查色谱图，以确定信号的最小绝对高度对应的峰，而不是为背景设置该值作为绝对高度（例如，在所提出的实验10,000）。
- 设置峰顶/边的最小比率为1.1〜述顶部和一个峰的最低数据点强度之间的最小比率被识别为真正的峰。
- 手动检查色谱图，看看哪些是各个峰的最小持续时间在使用chromatographic条件（例如，0.2和2分钟，根据化合物，在所提出的实验之间），因此将这些值作为峰值时间范围（分钟）来设置上可接受的峰长度的持续时间的范围内。
- 然后去峰值列表的方法→同位素→同位素峰石斑鱼分组同位素一个峰，通常在最激烈的。注意：参数取决于质谱仪的分辨率和保留时间的可再现性。
- 最后，进入峰值列表的方法→对齐→加入定位仪使用匹配分数对齐取决于他们的M / Z和保留时间峰。
- 对齐峰后，通过点击峰值列表方法→填隙→山顶搜索填充任何数据空白。最后，过滤器通过点击峰值列表方法→过滤→重复峰值过滤重复的数据点。
- 导出结果数据作为的.csV文件。
- 手动更改。CSV扩展到.txt的扩展名。如果没有文件扩展名是可见的，更改计算机设置，以显示文件扩展名。转到文件浏览器选项→查看→高级设置和取消勾选“对已知文件类型的扩展名隐藏”。
- 导入.txt文件到电子表格中。这将产生其中所有的检测到的代谢物，由识别号码，m / z值和保留时间的认可，被所有的样品在其峰面积积分值来定量数据矩阵。
- Access或下载数据处理软件包，可以从许多原料提取色谱图的相关信息，并建立在每个检测代谢物每个样品定量数据矩阵。
3.准备转录组分析浆果粉提取物和处理数据
- 从贝瑞样本提取总RNA，并确定RNA质量。
- 从浆果提取物样品的总RNA。
注：在这个案例中，一个专有套件，以确保彻底清除分子间的修改程序用RNA分析，如多糖和多酚类FERE，使用。下面的说明是针对此套件18。- 称量400毫克浆果粉末对于每个样品，将其分成两部分，并把200毫克每两个离心管。
- 立即大力添加900微升含β巯基乙醇（在试剂盒中提供的）的裂解溶液，以每个200mg的粉末和旋涡的至少30秒。加热在56℃的样品5分钟以800rpm摇动。
- 离心以最大速度将样品在台式微量10分钟以沉淀细胞碎片。
- 吸管700微升上清液成在2 ml收集管就位在试剂盒（蓝色保持环）提供的过滤柱的。收以最大速度的上限和离心机在台式离心1分钟以去除残留的碎屑。重复此步骤两次使用相同的过滤列，但一个新的收集管，导致3吨ubes每个包含〜700微升澄清的裂解液。
- 吸管粘合溶液（试剂盒中提供）到澄清的裂解的每个管的750微升并通过上下抽吸至少五次立即混合。转移700微升该混合物在2 ml收集管就位在试剂盒（红色保持环）提供的结合柱。收以最大速度的上限和离心机在台式离心1分钟，从而将RNA结合。
- 倒出流过级分，反转收集管，并简要点击它吸收纸的清洁垫以排出残余的液体。
- 返回列到集合管和吸管的剩余混合物成同一列，重复离心和倾析的步骤。重复，直到整个混合物被过滤到相同的红色的结合柱。
- 现在，按照试剂盒中剩下的指令和洗脱在50μl洗脱缓冲液的RNA（试剂盒提供）和存储我T对于-80℃做好准备的质量控制措施。
- 确定使用分光光度计RNA的数量和纯度。记录吸光率这揭示污染与蛋白质（A 260/280）和多酚/多糖（A 260/230）的程度。
注：适用于芯片杂交RNA应该得分率都至少为1.8。 - 确定RNA的完整性。
注意：各种系统都可以使用。在这种情况下，研究中使用的执行结合荧光染料毛细管电泳运行的数字收购。适于微阵列杂交的RNA应具有至少8 RNA完整性（RIN）。
- 从浆果提取物样品的总RNA。
- 制备样品和杂交的RNA到自定义芯片。
- 通过稀释在步骤3.1.1.8用去离子无RNase的水得到的RNA溶液的总RNA用于微阵列分析的起始量设定为200毫微克。加上RNA的适量到1.5ml微量离心管中的1.5微升的最终体积。
- 加入2微升稀释混合秒杀到每个RNA样品，并按照制造商的说明合成cDNA第一链，转录为cRNA这与花青3CTP标记的cRNA。
- 根据制造商的说明纯化标记的cRNA并在30微升不含RNA酶的水洗脱。
- 通过记录在分光光度计上三个值确定每个的cRNA的产率和比活度：花青3染料浓度（皮摩尔微升-1），RNA的纯度（A 260/280）和cRNA的浓度（ng微升-1）。使用制造商的说明书来计算的cRNA产量（微克）和特定的活性（每微克cRNA的皮摩尔Cy3标记）中发现的公式。
注：推荐的产率和特定活动的具体微阵列形式的基础上有所不同。在这种情况下，研究了4包44K格式是选择，推荐的产量为1.65和比活性为9。 - 设计使用合适的软件进行探针设计定制芯片。
- 对于本案例描述的结果，通过使用定制芯片设计和寡核苷酸文库基于web的应用程序准备新的定制芯片，设计上的4个包44K格式。设计探针来匹配34651目标成绩单，其中包括29971预测从黑比诺V1阵列笔录，由科维纳转录重建和180私人科维纳基因25黑品种鉴定4500新位点。
注意：这涉及到生产的34651特定的60-mer的探针，包括29798黑比诺预测成绩单，4,392新的黑位点和179科维纳私人的基因。
- 对于本案例描述的结果，通过使用定制芯片设计和寡核苷酸文库基于web的应用程序准备新的定制芯片，设计上的4个包44K格式。设计探针来匹配34651目标成绩单，其中包括29971预测从黑比诺V1阵列笔录，由科维纳转录重建和180私人科维纳基因25黑品种鉴定4500新位点。
- 准备以4包格式规格如下杂交组装。
- 放置1.65微克Cy3标记的cRNA在41.8的最终体积去离子无RNA酶的水微升。加入10X阻断剂的11微升和2.2微升25X碎片缓冲区。孵育在60℃下30分钟的恒温槽中进行分段的RNA。立即在冰上冷却1分钟。
- 最后加入55微升2×杂交缓冲液，在室温15500 XG 1分钟吹打和自旋拌匀。迅速将离心管冰上。立即使用，不要存放。
- 加载定制芯片如下。
- 加载朝上成杂交室的底部的标签一个垫圈滑动。加载缓慢杂交样品的100微升在步骤3.2.6.2所得到每个垫圈孔，用吸管的尖端分配液体，避免气泡。
- 慢慢地放置定制芯片朝下，确保数字的条形码朝上。确保夹心对被正确对准。最后把杂交室的封面上夹着幻灯片并用手拧紧夹子到室内。旋转组装腔室，以评估气泡的流动性。
- 放置组装滑动室的旋转式烤架烤箱设定为65℃的杂交。设置转子在10rpm旋转。允许杂交进行17小时。
- 与微阵列洗可按如下方式进行。
- 首先，准备三滑动染色菜肴和用适当的洗涤缓冲液填充它们：在RT 2菜肴用洗涤缓冲液1和1菜预热（37℃）洗涤缓冲液2。
- 拆开杂交室并取出三明治。朝上微阵列载玻片数字条形码，淹没夹心到装有洗涤缓冲液1在RT第一滑动染色培养皿，用清洁的镊子的帮助下，该垫圈从微阵列载玻片分开。很快的微阵列载玻片转移到玻片架，并将其放置在填充有洗涤缓冲液1中的第二滑动染色菜在室温。
- 把滑动染色皿上磁力搅拌器和洗涤1分钟，温和搅拌。快速滑动架转移到填充有预热（37℃）洗涤缓冲液2中的第三滑动染色皿洗1分钟，温和搅拌。
- 慢慢地从幻灯片染色菜卸下机架和小心地从机架上卸下滑动，避免飞沫传播。
注：的Triton X-102不添加到洗涤缓冲液并省略乙腈洗涤步骤。
- 在室温下储存在黑暗中洗涤芯片。
- 扫描芯片和提取的显着特征。
- 放置在微阵列载玻片到合适的扫描仪和使用微阵列制造商的说明手册所建议的参数设置扫描每个阵列。对于这里描述的结果，将每个微阵列载玻片成片夹以促进在扫描过程。
- 导入输出.SHP文件中，能够一个数字信号转换成数字的荧光值的适当的软件。检查质量控制报告，以确保杂交过程是成功的。
- 对于这里描述的结果，使用在特征提取软件的使用说明书中建议的参数设置和检查的质量控制报告，以确保在表4中列出的参数是由制造商给定的正常范围内。
| 指标名称 | 上限 | 下限 | 描述 |
| AnyColorPrcntFeatNonUnif | 1.00 | NA | 功能百分比在任一通道功能的非均匀性离群 |
| DetectionLimit | 2.00 | 0.10 | 平均加1下面的线性范围秒杀插件的标准偏差 |
| absGE1E1aSlope | 1.20 | 0.90 | 绝对适合的斜率信号与探头的E1a的浓度 |
| MedCVProcSignal | 8.00 | NA | 平均％CV为经处理的信号 |
| gNegCtrlAveBGSubSig | 5.00 | -10.00 | 背景减去平均全英利尔山区阴性对照的信号（BGSubSignal被减去一个从功能叫做BGUsed值意味着信号来计算） |
| gNegCtrlAveNetSig | 40.00 | NA | 所有英利尔山区阴性对照的净信号的平均 |
| gNegCtrlSDevBGSubSig | 10.00 | NA | 的标准偏差背景减去所有英利尔山区阴性对照的信号 |
| gNonCntrlMedCVProcSignal | 8.00 | NA | 平均％CV为无控制的探针的经处理的信号 |
| gSpatialDetrendRMSFilter | 15.00 | NA | 残留背景去趋势拟合 |
表4：主要参数进行检查，以验证微阵列杂交的质量。
- 过程中的微阵列数据。
- 一旦所有的芯片幻灯片已扫描和质量控制已经积极评价，从每个单子阵成果文件选择gProcessedSignal值，代表每个探测的原始荧光强度准备制表符分隔数据矩阵。
- 在电子表格，规范每个数组（P值）和演算中的第 75 个百分位数据吃所有P值的平均值的所有不同子阵列间来计算R比值。
- 然后，在同一个电子表格，正常化每gProcessedSignal值到它自己的子阵列的R比值。
4.贯彻代谢和转录组数据的详细统计分析
- 准备统计分析软件。
注：在这个案例中，能够执行PCA软件，PLS-DA和O2PLS-DA使用。- 导入代谢和转录的数据。转到文件→新建常规项目→新建常规项目导入与MZmine软件获得的数据矩阵。然后点击编辑→移调整个矩阵→主页并指定相应的中小学ID→完成。
- 平均中心的数据，并使用帕累托规模扩展他们。在主窗口中，转到编辑→M1和更改相应parame根据数据字符。对于这里描述的结果，规模由单位方差改变比肩。
- 缩放使用单位方差设置转录数据。
- 开展多元统计分析。
- 实施PCA如图F中igure 2。在这个案例中，PCA样品揭示之间的主要区别，体现不同的成熟阶段和生长季节。
- 在工作集窗口中，选择PCA-X作为型号。按自动调整。注意R2X（暨）和Q2（暨）值，因为它们提供有关模型质量的想法。
注：一般情况下，值越高越好的模型，但模型具有很高R2X（暨）可能过度拟合数据。作为经验法则，我们停止添加主成分时，Q2（暨）值开始下降。 - 然后，选择分数→分散地看到，显示样品的可能分组的情节。
- 检查PCA得分图。如果得到一个很好的模型（Q2cum> 0.5），使用的样品相同的类建立一个O2PLS-DA模型（步骤4.2.2）。
- 在工作集窗口中，选择PCA-X作为型号。按自动调整。注意R2X（暨）和Q2（暨）值，因为它们提供有关模型质量的想法。
- 构建利用宏观区域划分的样品有两个O2PLS-DA模型，并使用排列测试200排列验证模式。
- 转到主窗口→新建→由于M1→观察分配类。设置所需的类。然后，更改从PCA-X模型类型来O2PLS-DA。按自动调整。确保PLS-DA模型的组件的数量是相同的O2PLS-DA的。
- 为了验证O2PLS-DA模式，去分析CV-ANOVA，看到合适的p值。此外，单击New作为主窗口→M2，改变从O2PLS-DA到PLS-DA模型类型。按自动调整。
- 去分析→置换并执行200排列（取消选择重新计算置换选项）。
注：最终输出显示了一个窗口，其中R2值守LD一般打在值Y轴0,4下，而Q2应该打Y轴的负部分。如果R 2和/或Q 2的值不正确，减少在PLS-DA和O2PLS-DA模式的组件的两者的数目。 - 继续在项目窗口，选择M2和点击成绩→分散看到的情节和样品类的位置。观察什么特征的代谢产物的一个或多个特定的类，去绘制/列表→分散。
- 更改选择数据类型来观测和荷载→添加分别系列和修改X轴和系列项目进入PQ（更正）和强的松比较为1和2或其他组件存在时。
- 随着鼠标的按在情节右键，进入属性→颜色，选择通过以条款分子和阶级区分情节的符号。转到布局→格式→绘制轴线和/或样式修改具有所需特性的情节。
<利>基于代谢O2PLS-DA分析，在代谢物作为直方图的特定代谢物或类的相对水平本的差异的结果。
- 实施PCA如图F中igure 2。在这个案例中，PCA样品揭示之间的主要区别，体现不同的成熟阶段和生长季节。
- 基于所述转录O2PLS-DA分析的结果，检索和分配差异调节的基因到基因本体论（GO）的分类28。
- 确定代谢物水平和基因表达手动之间的关系。
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Representative Results
本文中介绍的案例研究产生了最终的数据矩阵包括552信号（M / Z功能），包括分子离子以及它们的同位素，加合物和一些片断，其中189样本相对量化（7葡萄园×3成熟期×3生长季点¯x 3生物学重复）。因此104328用于数据点的总数为。碎片树分析导致282 M / Z功能注释，相应的代谢产物加合物，同位素和片段。由主成分分析整个数据矩阵的探索性分析表明根据熟化阶段该样品聚集（转色期，中期成熟和成熟）沿第一和第二主成分（T1-T2， 图2A），并且沿着根据生长期第三主成分（T1-T3， 图2B）。
SRC =“/文件/ ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg”/>
图 2： 整个代谢组学数据矩阵的PCA无监督PCA-X得分散点图显示在三个不同的生长季节（2006年，2007年和2008年）采集葡萄样品的聚集和成熟阶段（转色期，中熟和成熟的浆果）。在第一图（A）中的第二个（B）根据本成熟阶段聚集，而样品他们根据生长期群集。颜色彰显成熟阶段，因为绿色（转色期），粉红色（中熟）和紫色（成熟的浆果）。这些符号所代表的生长季节：圆（2006年），广场（2007年）和三角形（2008）.Component T1：Q2：0.34; R2X：0.331; Q2cum：0.304;组件T2：Q2：0.185; R2X：0.155; Q2cum：0.433;组件T3：Q2：0.145; R2X：0.0924; Q2cum：0.515。JPG“目标=”_空白“> 点击此处查看该图的放大版本。
无监督PCA无法透露具体的风土特性，这些特性在流行复古效果隐藏的，所以有监督O2PLS-DA方法应用到两个不同的数据集， 也就是说，在浆果和转色期完全成熟的浆果。这使得较成熟的两个关键阶段，这三个宏观区域（加尔达湖，瓦尔波利塞拉葡萄酒和索阿韦），以确定代表这些区域在这些成熟阶段，具体的风土特征的代谢差异的探索。
图3： 转色期和成熟的葡萄浆果O2PLS-DA。 O2PLS-DA得分散点图显示在加尔达湖采集葡萄样品的集群（蓝色），索阿韦（绿色）和瓦尔波利塞拉（粉红色）在转色期（A），当果实已经成熟（B宏观区域）。负责在（A）中观察到的聚类和（B）中的代谢产物是在分别的相关负载图（C）和（D）是可见的。代谢物，表示为三角形的基团，是蓝色白藜芦醇和芪，粉红色花青素，绿色为羟基和羟基羧酸，紫色为黄烷-3-醇类/花青素和黄色为其他类黄酮。答：组件P1：Q2：0.278; R2X：0.0529; Q2cum：0.278;组件P2：Q2：0.33; R2X：0.0394; Q2cum：0.608。 B：成分P1：Q2：0.353; R2X：0.0639; Q2cum：0.353;组件P2：Q2：0.188; R2X：0.0374; Q2cum：0.541 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 三个宏观区域之间代谢指标的分布：加尔达湖，索夫和Valpolicella的代谢物水平反映平均值±标准差（N = 18，加尔达和索夫，27 Valpolicella的宏观区）不同的糖基化和酰化花青素，白藜芦醇/芪和黄酮类化合物在三个不同的生长季节（2006年，2007年，和2008年）科维纳成熟的浆果。不同的字母表示分别为通过t检验（P <0.05）确定显著不同的组。 请点击此处查看该图的放大版本。
七个人葡萄园的具体特征是采用了特殊的识别美化版统计方法10。两O2PLS-DA模型被建立，人们探索在转色期三个宏区生长的浆果之间的差异，以及其它探索成熟浆果间三宏观区域的差异。该模型是交叉验证使用的置换试验（200排列）示出说明在三个宏区域的成熟浆果的模型是有效的，而只有加尔达样品来自于转色期其它样品不同（未示出）。
两个模型，它说明了如何从三个宏区在转色期和成熟的试样按代谢分布分开的得分图，示于图3A和3B。这些模型表示为PQ（更正）， 即，第（类样品）和q（代谢物）之间的相关的装载图，显示在图第3C和3D。在装载地块，红色正方形代表类样品（宏区域）和着色三角形代表个别代谢物。的代谢物和样品之间的距离反映它们的关系。代谢物是彩色编码根据它们的化学类。
鉴于转色期模型的低统计有效性如由置换检验，很可能从过度拟合受损。因此，下面的观察仅仅指成熟浆果的样品，其模式是有效的统计。在图3D所示的装载情节，芪都转向了加尔达湖宏观区，而黄酮类化合物对索夫和Valpolicella的宏观区域移动。个别代谢产物仔细观察就会发现花青素的不对称分布，peonidin及其衍生物在湖噶尔更普遍DA宏观区及其他花青素在Valpolicella的宏观区域更为普遍（ 图4）。简单花青素-3-O-葡萄糖苷是在Valpolicella的宏区更普遍，而酰化和coumarated衍生物是在索阿韦宏观区域更为普遍。
本案例研究的转录组分量原是出使用转录平台，不再支持。因此，我们建立了一种替代方法，使用仍然可用平台;新平台包含了比那台旧的探头，其中包括249多黑比诺预测的成绩单，4392新发现的黑位点和179科维纳私人的基因25。
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Discussion
本文介绍了用于解释葡萄果实风土理念代谢组学，转录和统计分析的协议。通过HPLC-ESI-MS代谢分析是不够敏感，同时检测大量的代谢产物，但相对定量是由基体效应和离子抑制/增强的影响。然而，类似的做法已经被用来形容科维纳浆果的成熟和收获后枯萎，和基体效应的修正对结果5的影响有限。此外，最近的大型多仪器实验室间研究，以确定NMR和LC-MS的用于使用相同样品非靶向代谢物组学的比较稳健性，发现该不同的仪器和技术，得到一致的结果6。本文所述案例研究涉及样本的收集和分析三个阶段，成熟七个葡萄园在三个宏观-Z那些在三个生长季节。在这里，风土签名是在宏观区域级别采用PCA和O2PLS-DA多元统计调查（加尔达湖和索夫，各由两个葡萄园代表，瓦尔波利塞拉葡萄酒，由三个葡萄园表示）。个别葡萄园之间的差异更加微妙，需要更复杂和敏感的统计方法10。所提出的协议的各个步骤是关键的，以便成功地回答有关对葡萄品质风土影响的生物学问题加以考虑。
首先，适当取样计划是至关重要的：一个特定克隆的选择以最小化遗传差异和取样的多年持续时间允许突出各种风土之间的真实的，声音的差异。在另一侧，所提出的研究是一个沃土，其特别适合于葡萄栽培内进行，而这可以小型迈兹对葡萄质量的沃土-差异。因此，这将是非常有趣的比较在一个不太最佳区生长的同一品种，但，很明显，这些葡萄园可以简单地是不可用的。
从技术角度来看，通过HPLC一个高度可再生的代谢产物的分离是至关重要的，以获得良好的数据矩阵，由于在各种分析中保留时间的差异越大，错误的峰值对准在最终的数据集的数目越高。因此，它是至关重要的，以设定适当的再平衡时间，将样品分成在它们之间色谱柱清洗周期9-10样品批次，使用空白样品，因为每个批次的第一样本。 LC-MS是通过一定程度的不稳定性，这可能导致在那些仪器驱动样品之间的差异的影响。这个问题可以通过样品分析的随机化可以部分地解决，如图本文。一个IM该方法的证法是利用在每批适当的质量控制样品，可以在该平台的状态通知。适当的标准化合物混合物（ 即 ，标准的化合物与m / z值和保留时间跨越整个M / Z和保留时间范围），并通过从所有的样品可告知平台混合粉末的等份而获得的新的控制样品影响，以及最终被用于后验数据正常化。
为了比较代谢和转录结果的另一个重要的一点是要精确地使用相同的材料（ 即，相同的压碎样本）用于两分析。在数据分析中，它是使用一个合适的统计方法，如OPLS-DA，它允许相对于方法如主成分分析中的基因表达和代谢物积累方面的差异容易解释的关键。一的这种方法的主要限制是缺乏对转录和代谢组学数据集成强大的方法。的不同类型的数据的相关性的合适的方法的开发是必要的，以便建立转录和代谢数据之间牢固和可靠的相关性。
在这篇文章中描述的技术清楚地表明在浆果代谢的成熟和老式的影响，但表示这三个宏观区域特定的化学信号在流行复古作用下成熟的浆果也被确认。有趣的是，转色期浆果的分析没有得到有效的统计模型，这表明风土概念主要是由成熟（ 例如 ，花青素和芪）比那些已经存在于未成熟果实中积聚的代谢物表现出来。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | - | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In - One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | - | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | - | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus - 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | - | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
References
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