Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

De Terroir Concept Uitgelegd door de Bes van de Druif Metabolomics en Transcriptomics

Published: October 5, 2016 doi: 10.3791/54410
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1, 1, 1, 1, 1
1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche
* These authors contributed equally

Summary

Dit artikel beschrijft de toepassing van ongerichte metabolomics, transcriptomics en multivariate statistische analyse om druivenbes transcripties en metabolieten om inzicht te krijgen in het terroir concept, dat wil zeggen, de invloed van de omgeving op bes kwaliteitskenmerken.

Abstract

Streek verwijst naar de combinatie van omgevingsfactoren die de eigenschappen van gewassen beïnvloeden, zoals grapevine (Vitis vinifera) volgens bepaalde habitats en beheerspraktijken. Dit artikel laat zien hoe bepaalde terroir handtekeningen kunnen worden gedetecteerd in de bessen metaboloom en transcriptoom van de wijnstok cultivar Corvina met behulp van multivariate statistische analyse. De methode vereist eerst een geschikte bemonsteringsplan. In deze case study, een specifieke kloon van de Corvina cultivar werd geselecteerd om genetische verschillen te minimaliseren, en monsters werden verzameld van zeven wijngaarden vertegenwoordigen drie verschillende macro-zones tijdens drie verschillende groeiseizoenen. Een ongerichte LC-MS metabolomics aanpak wordt aanbevolen vanwege de hoge gevoeligheid, begeleid door een efficiënte verwerking van gegevens met behulp van MZmine software en een metaboliet identificatie strategie gebaseerd op fragmentatie boom analyse. Uitgebreide transcriptoom analyse kan worden bereikt met behulp van microarraysprobes die ~ 99% van de voorspelde genen grapevine, waardoor de gelijktijdige analyse van differentieel tot expressie gebrachte genen in de context van verschillende terroirs. Tenslotte kunnen multivariate data analyse gebaseerd op de projectie methoden worden toegepast om de uitstekende sterke-specifiek effect te overwinnen, waardoor de metabolomics en transcriptomics data te integreren en in detail geanalyseerd om informatieve correlaties te identificeren.

Introduction

Grootschalige data-analyse op basis van de genomen, transcriptomes, proteomen en metabolomes van planten biedt ongekend inzicht in het gedrag van complexe systemen, zoals de streek kenmerken van wijn die de interacties tussen grapevine planten en hun omgeving weerspiegelen. Omdat de streek van een wijn duidelijk kan zijn, zelfs wanneer identieke grapevine klonen worden gekweekt in verschillende wijngaarden, genomics-analyse is van weinig nut, omdat het klonen genomen zijn identiek. In plaats daarvan moet kijken naar correlaties tussen genexpressie en de metabolische eigenschappen van de druiven waarvan de kwaliteitskenmerken wijn bepalen. De analyse van genexpressie op het niveau van de transcriptoom voordelen van de vergelijkbare chemische eigenschappen van alle transcripten, kwantitatieve analyse vergemakkelijkt door gebruik algemene kenmerken zoals hybridisatie met geïmmobiliseerde probes op microarrays. Daarentegen universele analysemethoden in een proteomicsnd metabolomics zijn meer uitdagend vanwege de enorme fysieke en chemische diversiteit van individuele eiwitten en metabolieten. In het geval van metabolomics deze diversiteit is nog extremer omdat individuele metabolieten sterk verschillen in grootte, polariteit, overvloed en de volatiliteit, dus geen enkele extractieproces of analytische methode biedt een holistische benadering.

Onder de analytische platforms geschikt voor niet-vluchtige metabolieten, die uit hoogwaardige vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (HPLC-MS) zijn veel gevoeliger dan alternatieven zoals HPLC met ultraviolet of diode array detector (HPLC-UV, HPLC-DAD ) of kernmagnetische resonantie (NMR) spectroscopie, maar kwantitatieve analyse met HPLC-MS kan worden beïnvloed door verschijnselen zoals matrixeffect en ion onderdrukking / verbetering 1-3. Het onderzoek naar dergelijke effecten bij de analyse van Corvina druivenbessen met HPLC-MS met behulp van een elektrospray ionisatiebron (HPLC-ESI-MS) toonde dat suikers of andere moleculen met de laagste retentietijden waren sterk underreported, waarschijnlijk mede als gevolg van het grote aantal moleculen in deze zone, en dat de overvloed aan andere moleculen kan worden onderschat, overschat of beïnvloed door de matrixeffect , maar de gegevens normalisering van de matrix effect leek te beperkte impact hebben op de algemene resultaten van 4,5 te hebben. De hierin beschreven werkwijze is geoptimaliseerd voor de analyse drager polariteit metabolieten die zich ophopen bij hoge niveaus druivenbessen tijdens het rijpen en die aanzienlijk worden beïnvloed door de streek. Zij omvatten anthocyanen, flavonolen, flavan-3-ols, procyanidins, andere flavonoïden, resveratrol, stilbenen, hydroxykaneelzuren en hydroxybenzoëzuur zuren, die samen de kleur, smaak en gezondheid-gerelateerde eigenschappen van wijnen te bepalen. Andere metabolieten zoals suikers en alifatische organische zuren, worden genegeerd omdat kwantificatie met HPLC-MS onbetrouwbaar door de matrix en effect en ion onderdrukking verschijnselen 5. Binnen het bereik polariteit geselecteerd door deze werkwijze is de benadering irrelevante omdat hij tot doel zoveel mogelijk verschillende metabolieten detecteren mogelijk 6.

Transcriptomics methoden die het mogelijk maken duizenden grapevine transcripten gelijktijdig te bewaken worden vergemakkelijkt door de beschikbaarheid van de volledige grapevine genoomsequentie 7,8. Vroege transcriptomics methoden op basis van hoge doorvoer sequentiebepaling cDNA geëvolueerd met de komst van de volgende generatie sequencing in een verzameling procedures collectief omschreven als RNA-Seq technologie. Deze aanpak is hard op weg de methode van de keuze voor transcriptomics studies. Echter een grote hoeveelheid literatuur gebaseerd op microarray, waarmee duizenden transcripten parallel worden gekwantificeerd door hybridisatie is opgebouwd voor wijnstokken. Sterker nog, voor RNA-Seq werd een mainstream-technologie, hadden vele toegewijde commerciële microarray platformenontwikkeld waardoor grapevine transcriptoom in detail te inspecteren. Onder de grote verscheidenheid aan platforms, slechts twee toegestaan genoom-brede transcriptoom analyse 9. De verst ontwikkelde matrix kon de hybridisatie van tot 12 onafhankelijke monsters op een enkel apparaat, waardoor de kosten van elk experiment verminderen. De 12 sub-arrays elk omvatte 135.000 60-mer probes die 29.549 grapevine transcripten. Dit apparaat is gebruikt in een groot aantal studies 10-24. Deze twee platforms zijn inmiddels gestopt, maar een nieuwe aangepaste microarray is onlangs ontwikkeld en vertegenwoordigt een meer recente ontwikkeling als het een nog groter aantal probes die extra nieuw ontdekte genen grapevine 25 bevat.

De grote verkoop datasets geproduceerd door transcriptomics en metabolomics analyse vereisen een geschikte statistische methoden voor data-analyse, met inbegrip van multivariate technieken om correlaties tussen de verschillende vorm bepalens data. De meest gebruikte multivariate technieken zijn die op basis van projectie, en deze kunnen zonder toezicht, zoals principale componenten analyse (PCA), of worden gecontroleerd, zoals bidirectionele orthogonale projectie latente structuren discriminerende analyse (O2PLS-DA) 26. Het protocol in dit artikel maakt gebruik van PCA voor de experimentele data-analyse en O2PLS-DA om de verschillen tussen groepen van de monsters te identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kies geschikte materialen en de bouw van een Sampling Plan

  1. Begin het experiment door het ontwikkelen van een passend bemonsteringsplan. Er is geen generieke en universele aanpak, zodat elk plan op een case-by-case basis te evalueren. Zorg ervoor dat het bemonsteringsplan stelt de sampling plaatsen, tijden en de precieze sampling procedure. Zie figuur 1 voor het bemonsteringsplan gebruikt in deze case study.
    LET OP: In dit geval studie werden druif bessen uit een enkele kloon (. Vitis vinifera cv Corvina, kloon 48) verzameld uit zeven commerciële wijngaarden in drie verschillende macro-zones in de provincie Verona (het Gardameer, Valpolicella en Soave). De belangrijkste kenmerken van elke wijngaard zijn samengevat in tabel 1. Bessen werden verzameld gedurende drie groeiseizoenen (2006, 2007 en 2008) op drie tijdstippen, wat overeenkomt met veraison (het begin van de rijping), mid-rijping en rijpe bessen.
    1. Voor elk van de toetredingen (vineyard / jaar / rijpingsfase), oogst 30 clusters op verschillende posities langs twee wijnstokrijen, met gerandomiseerd hoogtes en locaties op de plant.
    2. Selecteert drie bessen willekeurig uit elke cluster, het vermijden van die zichtbaar beschadigde en / of tekenen van infectie.
    3. Herhaal stap 1.1.1 en 1.1.2 tot drie onafhankelijke zwembaden te verkrijgen.
    4. Ontpit de bessen en vries het zilvervlies onmiddellijk in vloeibare stikstof.
    5. Crush 10 bevroren bessen van elk zwembad met een automatische molen slijpmachine, en verdeel elk gepoederd monster in twee gelijke delen, een voor transcriptomics analyse en één voor metabolomics analyse.
    6. Bewaar het poeder bij -80 ° C.
AM BA BM CS FA MN P.M
Macro-zone Soave Gardameer Valpolicella Gardameer Valpolicella Valpolicella Soave
Hoogte (m) 250 120 450 100 130 250 130
onderstam 41B S04 K5BB 420A 420A K5BB 41B
rijrichting EW NS EW EW EW NS NS
opleidingssysteem Overhead System (Pergola) Overhead System (Pergola) Verticale Shoot Positioning (Guyot) Overhead System (Pergola) Overhead System (Pergola) Verticale Shoot Positioning (Guyot) Verticale Shoot Positioning (Guyot)
bodemtype lemige klei Leem Klei Leem kleileem slib leem kleileem
Het planten van de lay-out (m) 3.20 x 1.00 4.50 x 0.80 4.00 x 1.25 3.50 x 1.20 3.50 x 0.75 2.80 x 1.00 1.80 x 0.80
Totaal lime% 3.9 19.3 18.3 14.4 31 5.9 27.9
Active lime% 0.5 2.6 9.4 6.3 11.3 3.1 8.3
Sand% 15 47 66 42 29 13 36
leem% 43 36 21 37 39 67 36
Klei % 42 17 13 21 32 20 28
pH van de bodem 8.3 7.9 7.8 8.2 8.2 7.8 7.9
Organische stof (%) 2.9 2.5 2.2 1.2 2.9 1.6 2.5
Verwisselbare fosfor (mg / kg) 26 73 73 68 48 47 64
Uitwisselbare kalium (mg / kg) 190 376 620 230 168 154 126
Exchangeable magnesium (mg / kg) 272 468 848 623 294 293 183
Exchangeable calcium (mg / kg) 6500 5380 7358 6346 4652 10055 2878
Berry reducerende suikers 2006 211,25 ± 1,20 176,20 ± 0,42 187,40 ± 0.00 203,70 ± 1.13 212,55 ± 0,64 195,20 ± 0.00 211,65 ± 0,64
Berry reducerende suikers 2007 190.00 ± 1.27 165,25 ± 0,49 153,00 ± 0,42 203,60 ± 0,71 210,90 ± 0,71 192,25 ± 0,64 188,70 ± 1,84
Berry reducerende suikers 2008 191,35 ± 0,64 178,90 ± 0,57 170,05 ± 0,49 205,15 ± 1,48 188,70 ± 0,57 169,35 ± 0,49 108,05 ± 1,06
Berry pH 2006 3.01 ± 0.01 2.96 ± 0.01 2.84 ± 0.00 2.9 ± 0.00 2.98 ± 0.00 3.02 ± 0.00 3.06 ± 0.01
Berry pH 2007 2.97 ± 0.00 3.00 ± 0.00 2.74 ± 0.00 3.07 ± 0.01 2.98 ± 0.00 2,87 ± 0,01 3.09 ± 0.00
Berry pH 2008 2.83 ± 0.00 3.04 ± 0.01 2.71 ± 0.00 2.98 ± 0.01 2.98 ± 0.00 2.82 ± 0.00 3.11 ± 0.00
Oogsten Date 2006 2007 2008
Veraison 8-augustus 18-juli 12-augustus
Mid Rijpen 4-september 8-augustus 2-september
Rijp 18-Sep 29-augustus 23-Sep

Tabel 1: Belangrijkste kenmerken van elke wijngaard enmonstername data. m = meter, EW = Eat-West, NS = Noord-Zuid.
Figuur 1
Figuur 1:. Schematische weergave van de bemonstering De drie wijnproductie macro-zones bevinden zich in de omgeving van de stad Verona, regio Veneto, Italië. De drie tijdstippen zijn veraison (V) die het begin van de rijping in de wijnbouw, mid-rijping (MR) en rijpe bessen (R). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bereid Berry Powder Extracten, Analyseer de metabolieten en verwerken van de gegevens

  1. Bereid de Berry Poeder monsters voor analyse.
    1. Bereid de metabolische extracten van de bes monsters bij kamertemperatuur in drie volumes (w / v) methanol aangezuurd met 0,1% (v / v)mic zuur in een ultrasoon bad bij 40 kHz gedurende 15 min. Gebruik LC-MS-grade water en mierenzuur, en HPLC-grade methanol.
    2. Centrifugeer de extracten bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    3. Verdun de supernatant van stap 2.1.2 in twee delen (v / v) gedeïoniseerd water en gaan door een 0,2 pm filter.
  2. Analyseer de Berry extracten met HPLC-ESI-MS.
    1. Stel de HPLC-ESI-MS systeem volgens de aanbevelingen van de leverancier.
      LET OP: In deze case study, de setup omvatte een HPLC-systeem uitgerust met een autosampler, in-line verbonden is met een ion trap massaspectrometer en elektrospray ionisatie bron.
    2. Sluit het HPLC systeem met een C18 voorkolom (7,5 x 2,1 mm 2) en een omgekeerde fase C18-kolom (150 x 2,1 mm 2, deeltjesgrootte 3 micrometer).
    3. Bereid de gebruikte oplosmiddelen als mobiele fase. Gebruik 5% (v / v) acetonitril, 0,5% (v / v) mierenzuur in water als oplosmiddel A en 100% acetonitril als solvent B. Gebruik LC-MS-grade acetonitril, water en mierenzuur.
    4. Voer de HPLC-scheiding met een lineaire gradiënt van oplosmiddelen A en B op een constante stroomsnelheid van 0,2 ml min-1 met een monster injectievolume van 30 ul.
      1. Aanvankelijk equilibreren van de kolom met 100% solvent A. Na monsterinjectie, stelt een gradiënt van 0% tot 10% oplosmiddel B in 5 minuten, van 10% tot 20% oplosmiddel B in 20 minuten, van 20% tot 25% oplosmiddel B in 5 min en van 25% tot 70% oplosmiddel B in 15 min.
      2. Analyseer elk monster in duplo. Willekeurig monster analyse-instrument gedreven effecten te vermijden. Wacht 20 min voor het opnieuw equilibreren met 100% oplosmiddel A tussen elke analyse.
    5. Acquire massaspectra in afwisselend negatieve en positieve ionisatie modes. Voor de in deze case study beschreven resultaten, stelt de parameters zoals in tabel 2. De precieze machine instelling hangt af van de specifieke platform.
      OPMERKING: U kunt ook gebruik maken van andere suitkunnen werkwijzen volgens de specifieke platform.
      1. In alle gevallen, zoals bij elke scheiding platform, zorg ervoor dat een geschikt re-equilibratie tijd te gebruiken, met het oog op retentietijd reproduceerbaarheid hebben. Wanneer het aantal monsters is hoog (meer dan tien monsters) analyseren in groepen van 9-10 monsters met chromatografiekolom reinigingsprogramma's (traag verlopen tussen de beide elueringsoplosmiddelen) tussen elke partij. Om voldoende retentietijd reproduceerbaarheid hebben, ervoor te zorgen dat de eerste chromatografische analyse van elke partij is een blanco-analyse (dat wil zeggen, de analyse van het oplosmiddel).
    6. Ook verwerven massaspectra in gefragmenteerde negatieve en positieve ionen modes instellen van de fragmentatie opties (twee ion precursors, MS 3). Annoteren de metabolieten door fragmentatie boom analyse (MS / MS en MS 3) volgens instructies van de fabrikant.
      Opmerking: Dit is bijzonder geschikt voor plantenmetabolieten omdat ze vaak geglycosyleerd, therefore de eerste fragmentatie (MS / MS) heeft de neiging om de suikergroepen het verlaten van het vrije aglycon ion, en de daaropvolgende fragmentatie (MS 3) te verwijderen helpt bij het aglycon te identificeren tegen een authentieke normen bibliotheek.
    7. Verwerven van MS / MS en MS 3 spectra in de m / z bereik 50-1,500 met een fragmentatie amplitude van 1 V. Of gebruik andere geschikte methoden op basis van de specifieke platform.
    8. Per m / z signaal vergelijkt het MS / MS en MS3 fragmentatiepatronen en retentietijden van het authentieke standaarden Bibliotheek volgens instructies van de fabrikant.
      LET OP: Veel soort platformen omvatten software faciliteiten om dit soort bibliotheek door de analyse van authentieke normen op te bouwen. Dit moet identificeren veel van de signalen, maar niet alle signalen worden geannoteerd.
    9. Voor de overige anonieme signalen vergelijkt het MS / MS en MS3 fragmentatiepatronen met die in de literatuur, zoekoplossinghing voor m / z waarden (dwz cijfer "m / z 353" zoeken naar publicaties waarin moleculen met zulke m / z genoemd) bij een conventionele zoekmachine vrij beschikbaar, of gebruik maken van online databases zoals MassBank (www .massbank.jp / nl / database.html) en het Human metaboloom Database (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
Massaspectrometer componenten Functie parameters
Electrospray ionisatie Source vernevelen Gas 50 psi, 350 ° C
drooggas 10 L min -1
Ion val en detector Scannen Volledige scan-modus, 13.000 m / z per seconde, bereik 50-1,500 m / z
400 m / z
Collision Gas Helium
onderdruk 1,4 x 10 -5 mbar
capillaire bron 4000 V
Eindplaat offset -500 V
schuimspaan -40 V
Cap exit -121 V
1 oktober DC -12 V
2 oktober DC -1,7 V
lens 1 5 V
lens 2 60 V
ICC voor positieve ionisatie modus 20.000
ICC negatieve ionisatie mode 7000

Tabel 2: Promotor parameterset voor het verwerven van massaspectra.

operatie Selectie Functie parameters waarden
Peak Detection massadetectie centroid Geluidsniveau 3500
chromatogram bouwer Hoogste data point min tijdspanne 0.15
min hoogte 4000
m / z tolerantie 0.3
Peak Detection Peak deconvolutie Lokaal minimum zoekmachine chromatografische drempel 70
Zoek minimum RT bereik (min) 00:50
Minimale relatieve hoogte 15%
Minimale absolute hoogte 4000
Min verhouding van de piek top / edge 2
Duur bereik (min) 0-10
isotopen Isotopische pieken grouper - m / z tolerantie 1.2
RT tolerantie 00:50
monotone vorm Nee
maximale lading 3
vertegenwoordiger isotoop Nee
opstelling Join aligner - m / z tolerantie 1.2
Gewicht voor m / z 10
Retentietijd tolerantie 00:50
Gewicht voor RT 5
Vereisen dezelfde laadtoestand Nee
Vereisen dezelfde ID Nee
Vergelijk isotoop patroon Nee
spleetvullend Peak finder - intensiteit tolerantie 20%
m / z tolerantie 0.9
Retentietijd tolerantie 00:40
RT correctie Nee
filtering Dupliceren Peak filter - m / z tolerantie 1.2
RT tolerantie 00:30
Vereisen dezelfde identificatie Nee

Tabel 3: Mzmine workflow met specifieke waarden negatief LC-MS druivenbes gegevensbestanden te verwerken.

  1. Verwerk de LC-MS-gegevens.
    1. Access ofhet downloaden van een data processing software pakket dat relevante informatie uit vele ruwe chromatogrammen kan halen en het opbouwen van een data matrix waarin elke gedetecteerde metaboliet wordt gekwantificeerd in elk monster.
      LET OP: Het protocol onderstaande stappen worden op maat gemaakt voor de open-source software MZmine v2.14 (http://mzmine.sourceforge.net). Het is een open-source software voor de massa-spectrometrie verwerking van gegevens, met de nadruk op LC-MS-gegevens. 27
    2. Transformeer de LC-MS chromatogram gegevens in NetCDF-formaat met behulp van de software die door de fabrikant van de apparatuur. Voor de hier beschreven resultaten, gebruik maken van de Bruker Daltonics Esquire v5.2 en Data-analyse v3.2 software en de stappen volgens de instructies van de fabrikant.
      LET OP: Andere converters kunnen worden gebruikt (diverse freeware converters zijn beschikbaar).
    3. Importeer de .cdf bestanden in de software.
    4. Implementeren van de piek detectie, uitlijning, spleetvullend en piek filtering procedures met de PARAMETers in tabel 3.
      1. Als eerste stap, selecteer een geïmporteerde .cdf bestand, ga dan naar Visualization → TIC / XIC Visualizer. Zet de cursor op de basis van de kleinste piek in het chromatogram en kennis te nemen over de minimale intensiteit signaal van de basis-ion. Ga dan naar Raw Data Methodes → Peak Detection.
      2. Selecteer Mass Detection en vul het signaal niveau om individuele ionen voor elke scan op te sporen en creëer een ion lijst.
        OPMERKING: Controleer het algoritme voor het uitvoeren van de massadetectie - afhankelijk van de massaspectrometer. In ons geval, selecteren we Centroid.
      3. Selecteer Chromatogram Bouwer en vul met het signaal niveau om datapunten verbinden van de ion lijst en het opbouwen van een chromatogram voor elke massa waarde. Zie het in de handleiding van de massaspectrometer om de Min Time Span en m / z tolerantie aan te passen parameters.
      4. Ga vervolgens naar Peak Lijst Methodes → Peak Detection → Chromatogram Deconvolutie. Kies de juiste algoritme (in casu lokaal minimum Zoeken) om de scheiding chromatogram in afzonderlijke pieken mogelijk.
      5. Handmatig inspecteren de chromatogrammen te vinden van de juiste waarden voor de volgende parameters. Stel de Chromatografische Threshold tot 30% aan de ruis te verwijderen en Search minimum RT Range 2 (min) om de aanwezigheid van minimale bewoners identificeren twee pieken onderscheiden.
      6. Stel Minimum relatieve hoogte op 2,0. Handmatig inspecteren het chromatogram tot het minimum absolute hoogte van signaal dat overeenkomt met een piek en niet om de achtergrond te identificeren; deze waarde Absolute Hoogte (bijvoorbeeld 10.000 in de gepresenteerde experiment).
      7. Set Min Ratio van Peak Top / Edge 1,1 tot het minimum verhouding tussen de top en de laagste data punt intensiteiten van een piek staat om erkend te worden als een echte piek.
      8. Handmatig inspecteren de chromatogrammen om te zien welke is de minimale duur van de verschillende pieken in de gebruikte CHROMATDemografische omstandigheden (bijvoorbeeld tussen 0,2 en 2 minuten, afhankelijk van de verbinding, in de gepresenteerde experimenten), en derhalve gebruikt ze als Peak Range Duur (min) tot het bereik van acceptabele piek lengte tijdlimiet.
      9. Ga dan naar Peak Lijst Methodes → Isotopes → isotopische Peaks Grouper naar groep isotopen in één piek, meestal in de meest intense. Opmerking: De parameters hangen af ​​van de resolutie van de massaspectrometer en de reproduceerbaarheid van de retentietijden.
      10. Tot slot, ga dan naar Peak Lijst Methodes → Aanpassing → Registreer Aligner pieken afhankelijk van de m / z en retentietijd af te stemmen met behulp van een match score.
    5. Na het uitlijnen van de pieken, vul de gegevens lacunes door te klikken op Peak Lijst Methodes → Gap Filling → Peak Finder. Tot slot filter dubbele gegevens punten door te klikken op Peak Lijst Methodes → Filtering → Dubbele Peak Filter.
    6. Exporteer de resulterende dataset als .csv file.
    7. Handmatig veranderen. Csv uitbreiding van een. Txt extensie. Als er geen bestandsextensies zichtbaar zijn, veranderen de instellingen van de computer om bestandsextensies onthullen. Ga naar File Explorer Opties → Beeld → Geavanceerde instellingen en vink het vakje 'verbergen extensies voor bekende bestandstypen'.
    8. Importeer de .txt-bestanden in een spreadsheet. Dit levert een datamatrix waarbij alle gedetecteerde metabolieten, die door een identificatienummer, m / z waarde en retentietijd worden gekwantificeerd in alle monsters wat betreft hun piekoppervlak waarden.

3. Bereid Berry Poeder Extracten voor Transcriptome Analyse en verwerken van de gegevens

  1. Extract Totaal RNA uit de Berry Monsters en Bepaal de RNA Quality.
    1. Extract totaal RNA uit de bessen monsters.
      LET OP: In deze case study, een eigen kit en een aangepaste procedure die de volledige verwijdering van moleculen die onder verzekertfere met RNA-analyse, zoals polysacchariden en polyfenolen, gebruikt. De onderstaande instructies zijn specifiek voor deze kit 18.
      1. Weeg 400 mg bessen poeder voor elk monster, verdeel het in twee porties en plaats 200 mg elk in twee microfugebuizen.
      2. Voeg 900 ul van lysis oplossing die β-mercaptoethanol (verschaft in de kit) aan elk 200 mg poeder en vortex onmiddellijk en krachtig gedurende tenminste 30 sec. Verwarm het monster bij 56 ° C gedurende 5 minuten schudden bij 800 rpm.
      3. Centrifugeer de monsters bij maximale snelheid in een microcentrifuge benchtop 10 min om cellulaire brokstukken te pelleteren.
      4. Pipetteer 700 ul van de supernatant in de filtratiekolom in de kit (blauwe borgring) geplaatst in een 2 ml verzamelbuis. Sluit de dop en centrifuge bij maximale snelheid in een tafelmodel microcentrifuge gedurende 1 minuut om de resterende vuil te verwijderen. Herhaal deze stap tweemaal met dezelfde filtratiekolom maar een nieuwe verzamelbuis, resulterend in drie tubes elk ~ 700 ul van de geklaarde lysaat.
      5. Pipet 750 pi bindingsoplossing (in de kit) in elke buis geklaard lysaat en meng onmiddellijk door en neer te pipetteren minstens vijf keer. Transfer 700 pi van dit mengsel om de binding kolom in de kit (rode borgring) geplaatst in een 2 ml verzamelbuis. Sluit het deksel en centrifuge bij maximale snelheid in een microcentrifuge benchtop 1 min naar het RNA te binden.
      6. Schenk de doorstroomfractie, keren de verzamelbuis en klop kort op een schone pad van absorberend papier om de restvloeistof uitlekken.
      7. Breng de kolom aan de collectie buis en pipet de resterende mengsel in dezelfde kolom en herhaal het centrifugeren en decanteren stappen. Herhalen totdat het gehele mengsel werd gefiltreerd in dezelfde rode bindende kolom.
      8. Nu volgen de overige instructies in de kit en elueer het RNA in 50 pl elutiebuffer (in de kit) en opslaan it bij -80 ° C gereed voor de kwaliteitscontrole stappen.
    2. Bepaal de hoeveelheid en zuiverheid van het RNA met een spectrofotometer. Registreer de absorptie verhoudingen die de vervuilingsgraad eiwitten (A 260/280) en polyfenolen / polysaccharides (A 260/230) onthullen.
      LET OP: RNA geschikt voor microarray hybridisatie moet ten minste 1,8 voor zowel de ratio's te scoren.
    3. Bepaal de integriteit van het RNA.
      OPMERKING: Diverse systemen kunnen worden gebruikt. Een digitale overnemende partij dat een capillaire elektroforese run in combinatie met een fluorescerende kleurstof presteert werd gebruikt in deze case study. RNA geschikt voor microarray hybridisatie zou een RNA integriteit Number (RIN) hebben van ten minste 8.
  2. Bereid Monsters en hybridiseer het RNA om een ​​aangepaste microarray.
    1. Stel het basisbedrag van totaal RNA voor microarray analyse om 200 ng door verdunning van de RNA-oplossing verkregen in stap 3.1.1.8 met gedemineraliseerd RNase-free water. Voeg degeschikte hoeveelheid RNA een 1,5 ml microcentrifugebuis in een uiteindelijk volume van 1,5 pl.
    2. Voeg 2 pl verdunde spike mix aan elk RNA-monster en volg de instructies van de fabrikant om de eerste streng cDNA te synthetiseren, transcriberen deze in cRNA en label de cRNA met cyanine 3CTP.
    3. Zuiver het gemerkte cRNA volgens de instructies van de fabrikant en geëlueerd in 30 gl RNase-vrij water.
    4. Bepaal de opbrengst en de specifieke activiteit van elk cRNA door het opnemen van drie waarden op een spectrofotometer: 3 cyanine kleurstof concentratie (pmol pl -1), RNA zuiverheid (A 260/280) en cRNA concentratie (ng gl -1). Gebruik de formules te vinden in de instructies van de fabrikant van de handleiding om de cRNA opbrengst (pg) en de specifieke activiteit (pmol Cy3 per ug cRNA) te berekenen.
      OPMERKING: Aanbevolen opbrengsten en specifieke activiteiten verschillen op basis van de specifieke microarray formaat. In deze case study was een 4-pack 44K-formaatgekozen, de aanbevolen opbrengst was 1,65 en de specifieke activiteit was 9.
    5. Het ontwerp van de aangepaste microarray met behulp van geschikte software voor probe design.
      1. Voor de in deze case study beschreven resultaten, bereidt u een nieuwe aangepaste microarray, ontworpen op de 4-pack 44K-formaat met behulp van een web-based applicatie voor aangepaste microarray ontwerpen en oligonucleotide bibliotheken. Ontwerp probes aan te passen 34.651 doel transcripties, met inbegrip van 29.971 voorspeld transcripten van de pinot noir V1 array, 4500 nieuwe loci die in de Pinot cultivar door Corvina transcriptoom wederopbouw en 180 particuliere Corvina genen 25.
        LET OP: Dit betrof de productie van 34.651 specifieke 60-mer probes, bestaande uit 29.798 Pinot noir voorspeld transcripties, 4392 nieuwe Pinot loci en 179 Corvina privé-genen.
    6. Bereid de hybridisatie assemblage gebaseerd op 4-pack formaat specificaties als volgt.
      1. Plaats 1,65 ug Cy3-gelabelde cRNA in een eindvolume van 41,8pl gedemineraliseerd RNase-free water. Voeg 11 ul van 10x blokker en 2,2 pl 25x Fragmentatie Buffer. Incubeer bij 60 ° C gedurende 30 minuten in een thermostaatbad op te splitsen RNA. Onmiddellijk koel op ijs gedurende 1 minuut.
      2. Voeg tenslotte 55 ul 2x hybridisatiebuffer, meng door pipetteren en centrifugeren gedurende 1 minuut bij 15.500 x g bij kamertemperatuur. Onmiddellijk plaats de microcentrifugebuis op ijs. Onmiddellijk gebruiken, niet op te slaan.
    7. Laad de aangepaste microarray als volgt.
      1. Plaats een pakking dia met het etiket naar boven in de basis van een hybridisatie kamer. Laden langzaam 100 pl hybridisatie monster verkregen in stap 3.2.6.2 op elke pakking goed, het afgeven van de vloeistof met de punt van de pipet, het vermijden bellen.
      2. Langzaam zet de aangepaste microarray naar beneden, zodat de numerieke barcode naar boven wijst. Zorg ervoor dat de sandwich pair goed is uitgelijnd. Tot slot plaatst de cover van de hybridisatie kamer op de ingeklemdslides en hand-draai de klem op de kamer. Draai de geassembleerde kamer naar de mobiliteit van bellen beoordelen.
    8. Plaats geassembleerd schijfjeskamer in een rotisserie in een hybridisatie oven ingesteld op 65 ° C. Stel de rotator roteert op 10 rpm. Sta hybridisatie doorgaan gedurende 17 uur.
    9. Ga verder met de microarray slide wassen als volgt.
      1. Maak eerst drie slide kleuring gerechten en vullen met de geschikte wasbuffers: 2 schotels met Wash Buffer 1 bij kamertemperatuur en 1 schotel met voorverwarmde (37 ° C) Wash Buffer 2.
      2. Demonteer de hybridisatie kamer en verwijder de sandwich. De microarray slide numerieke barcode naar boven onderdompelen sandwich in de eerste slide-kleuring schaal gevuld met Wash Buffer 1 bij kamertemperatuur en met behulp van schone pincet, scheiden de pakking van de microarray dia. Zo snel mogelijk de microarray dia in een dia rack en plaats het in de tweede slide-kleuring schotel gevuld met Wash Buffer 1bij kamertemperatuur.
      3. Zet de slide-kleuring schotel op een magnetische roerder en spoel 1 minuut onder matig roeren. Zo snel mogelijk de schuif rek in de derde schuif kleuring schotel gevuld met voorverwarmde (37 ° C) Wash Buffer 2 en spoel 1 minuut onder matig roeren.
      4. Verwijder langzaam het rek van de dia kleuring schotel en voorzichtig de schuif te verwijderen uit het rek, het vermijden van druppels.
        OPMERKING: Triton X-102 niet toe te voegen aan het wassen buffers en laat de acetonitril wasstap.
    10. Bewaar de gewassen chip in het donker bij kamertemperatuur.
  3. Scan de Microarray en Extract de meest opvallende kenmerken.
    1. Plaats de microarray dia in een geschikte scanner en scan elke array met de parameterinstellingen aanbevolen in de microarray fabrikant gebruiksaanwijzing. Voor de hier beschreven resultaten, plaatst iedere microarray dia in een houder om het scannen procedure te vergemakkelijken.
    2. Importeer de uitgang .shpbestand op passende software die in staat is een digitaal signaal omgezet in numerieke waarden tl. Controleer de kwaliteitscontrolerapport zodat de hybridisatie procedure succesvol was.
      1. Voor de hier beschreven resultaten, gebruikt u de parameter instellingen aanbevolen in de handleiding van de feature extractie software en inspecteer de kwaliteitscontrole rapport om ervoor te zorgen dat de in tabel 4 genoemde parameters zijn binnen het normale bereik gegeven door de fabrikant.
Metric Naam Bovengrens ondergrens Beschrijving
AnyColorPrcntFeatNonUnif 1.00 NA Percentage van de functies die functie niet-uniformiteit uitschieters in beide kanalen zijn
detectiegrens 2.00 0.10 Gemiddelde plus 1 standaarddeviatie van de nagel ins onder de lineaire concentratiebereik
absGE1E1aSlope 1.20 0.90 Absolute van de helling van fit voor Signal vs. Concentratie van E1a probes
MedCVProcSignal 8.00 NA Mediaan% CV voor het verwerkte signaal
gNegCtrlAveBGSubSig 5.00 -10.00 Gemiddelde van de achtergrond afgetrokken signaal van alle inlier negatieve controles (BGSubSignal wordt berekend door het aftrekken een waarde genaamd BGUsed van de functie betekenen signaal)
gNegCtrlAveNetSig 40.00 NA Gemiddelde van de netto-signaal van alle inlier negatieve controles
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00 NA Standaardafwijking vanachtergrond afgetrokken signalen van alle inlier negatieve controles
gNonCntrlMedCVProcSignal 8.00 NA Mediaan% CV van het verwerkte signaal van de niet-controleprobes
gSpatialDetrendRMSFilter 15.00 NA Residuele van achtergrond detrending fit

Tabel 4: Belangrijkste parameters te controleren om de kwaliteit van microarray hybridisatie te controleren.

  1. Verwerk de microarray data.
    1. Zodra alle microarray dia's zijn gescand en de kwaliteitscontrole is positief beoordeeld, bereiden een tabgescheiden data-matrix door het selecteren van de gProcessedSignal waarden van elke afzonderlijke-subarray uitkomst file, die de rauwe fluorescentie-intensiteiten van elke probe.
    2. In een spreadsheet, normaliseren van de gegevens op de 75 ste percentiel binnen elke array (P-waarden) en Calculat de gemiddelde van alle P-waarden van alle verschillende subnetwerken het R-verhouding te berekenen.
    3. Vervolgens, in dezelfde spreadsheet, normaliseren gProcessedSignal elke waarde voor de verhouding R van zijn eigen sub-array.

4. Carry Out de gedetailleerde statistische analyse van de Metabolomics en Transcriptomics Gegevens

  1. Bereid de software voor statistische analyse.
    LET OP: In deze case study, een software in staat om PCA te voeren, PLS-DA en O2PLS-DA werd gebruikt.
    1. Importeer de metabolomics en transcriptomics data. Ga naar → New Regular Project → Nieuw Regelmatige Project om de gegevens matrix verkregen met MZmine software importeren. Vervolgens klikt u op Bewerken → Omzetting van het hele matrix → Thuis en wijs de juiste primaire en secundaire ID → Voltooien.
    2. Bedoel centreren de data en schaal ze met behulp van het Pareto schaal. In huis venster, ga naar Bewerken → M1 en verander de juiste parameters, afhankelijk van de gegevens. Voor de hier beschreven resultaten, verander de schaal van Unit Variantie tot Par.
    3. Schaal de transcriptomics data met behulp van de eenheid Variantie setting.
  2. Carry Out de multivariate statistische analyse.
    1. Implementeren van de PCA, zoals getoond in F igure 2. In deze case study, PCA onthult de belangrijkste verschillen tussen de monsters, die de verschillende stadia rijpen en groeiseizoenen.
      1. In het venster werkset, selecteer PCA-X als modeltype. Druk Autofit. Besteed aandacht aan de R2X (cum) en Q2 (cum) waarden als ze een idee over de kwaliteit van het model te geven.
        OPMERKING: algemeen, hoe hoger de waarde, hoe beter het model, maar modellen met hoge R2X (cum) kan over-bij de data. Als empirische regel, stoppen we met het toevoegen van Principal Components wanneer de Q2 (cum) waarde begint te dalen.
      2. Selecteer vervolgens Scores → Scatter om het perceel dat de mogelijke groepering van de monsters laat zien.
      3. Inspecteer de PCAScore Plot. Als een goed model wordt verkregen (Q2cum> 0,5), maken gebruik van dezelfde klassen van monsters naar een O2PLS-DA-model (stap 4.2.2) op te bouwen.
    2. De bouw van twee O2PLS-DA-modellen met behulp van de ingedeeld naar macro-zone samples en valideren van de modellen met behulp van een permutatie proef met 200 permutaties.
      1. Wijs de lessen door te gaan naar huis venster → Nieuw Zoals → M1 → waarnemingen. Stel de gewenste klassen. Dan verandert de Model Type van PCA-X O2PLS-DA. Druk Autofit. Zorgen dat het aantal componenten van de PLS-DA-model is gelijk aan die van de O2PLS-DA.
      2. Om de O2PLS-DA-model te valideren, ga dan naar Analyze CV-ANOVA en zie de juiste p-waarde. Bovendien, klik op Nieuw als in het venster Home → M2 en verander de Model Type van O2PLS-DA naar PLS-DA. Druk Autofit.
      3. Ga naar Analyseer → Permutaties en het uitvoeren van 200 permutaties (de-select herberekenen Permutaties optie).
        Opmerking: Het eindresultaat toont een venster waarin de R2 waarde should doorgaans worden de Y-as waarden onder 0,4, terwijl de Q2 het negatieve deel van de Y-as zou raken. Als R2 en / of Q2 waarden onjuist zijn, vermindering van het aantal onderdelen, zowel in PLS-DA en O2PLS-DA-modellen.
      4. Ga verder met M2 in Project Venster te selecteren en klik op Scores → Scatter om het perceel en de positie van het monster klassen te zien. Te observeren wat metabolieten karakteriseren een of meer specifieke klassen, gaat u naar Plot / Lijst → Scatter.
      5. Verander het Select Data Type om waarnemingen en Belastingen → Series toevoegen en wijzigen van het item in X-as en Series in PQ (corr) en Pred Comp in 1 en 2 of andere componenten indien aanwezig, respectievelijk.
      6. Met de rechter muisknop ingedrukt op het perceel, ga dan naar Property → Color en selecteer met termen om de plot symbolen onderscheid te maken tussen moleculen en klassen. Ga naar lay-out → Format Plot → Axis en / of stijlen om het perceel met de gewenste eigenschappen te wijzigen.
      3. <li> Op basis van de resultaten van de metabolomics O2PLS-DA analyse aanwezige verschillen in de relatieve niveaus van specifieke metabolieten of klassen van metabolieten als histogrammen.
    3. Op basis van de resultaten van de transcriptomics O2PLS-DA analyse, ophalen en differentieel gemoduleerde genen toewijzen Gene Ontology (GO) 28 classificaties.
    4. Identificeer relaties tussen metaboliet niveaus en genexpressie handmatig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De case studie in dit artikel beschreven leverde een definitieve gegevens matrix omvattende 552 signalen (m / z functies), met inbegrip van moleculaire ionen plus hun isotopen, adducten en een aantal fragmenten, relatief gekwantificeerd onder 189 monsters (7 wijngaarden x 3 rijpen stadia x 3 groeiseizoenen x 3 biologische herhalingen). Het totale aantal voor data punten was dan ook 104.328. Fragmentatie boom analyse resulteerde in de annotatie van 282 m / z kenmerken overeenkomen met metabolieten plus adducten, isotopen en fragmenten. Verkennende analyse van het hele datamatrix door PCA toonde aan dat de monsters gegroepeerd volgens de rijpingsfase (veraison, mid-rijping en rijpe) langs de eerste en tweede hoofdcomponenten (T1-T2, figuur 2A), en volgens het groeiseizoen langs de derde hoofdcomponent (t1-t3 figuur 2B).

Figuur 2 src = "/ files / ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg" />
Figuur 2:. PCA van de hele metabolomics datamatrix Unsupervised PCA-X score scatter plots met de clustering van grapevine monsters gedurende drie verschillende groeiseizoenen (2006, 2007 en 2008) verzameld en rijping fasen (veraison, mid-rijping en rijpe bessen ). In de eerste grafiek (A) de geclusterd naar de rijping stadia, terwijl in de tweede (B) monsters geclusterd zij volgens het groeiseizoen. De kleuren benadrukken het rijpingsproces stadia als groene (veraison), roze (mid-rijpen) en paars (rijpe bessen). De symbolen geven de groeiende seizoenen: cirkels (2006), pleinen (2007) en driehoeken (2008) .Component T1: Q2: 0,34; R2X: 0,331; Q2cum: 0,304; Component T2: Q2: 0,185; R2X: 0,155; Q2cum: 0,433; Component T3: Q2: 0.145; R2X: 0,0924; Q2cum: 0,515.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De onbewaakte PCA was niet in staat om specifieke terroir functies, die zijn verborgen onder de heersende vintage effecten zichtbaar te maken, zodat een bewaakte O2PLS-DA benadering werd toegepast op twee verschillende datasets, dat wil zeggen, bessen bij veraison en volledig rijpe bessen. Hierdoor kan de verkenning van metabole verschillen die de drie macro-zones (Gardameer, Valpolicella en Soave) in twee belangrijke stadia van rijping, om specifieke terroir handtekeningen die deze zones in deze rijpende stadia te identificeren.

figuur 3
Figuur 3: O2PLS-DA van veraison en rijpe druiven bessen. O2PLS-DA score scatter plots met de clustering van grapevine monsters verzameld in het Gardameer ( blauw), Soave (groen) en Valpolicella (roze) macro-zones bij veraison (A) en wanneer de bessen rijp waren (B). De metabolieten verantwoordelijk voor de clustering waargenomen in (A) en (B) zichtbaar correleren loading plots (C) en (D) respectievelijk. Groepen van metabolieten, voorgesteld als driehoeken, zijn blauw voor resveratrol en stilbenen, roze voor anthocyanen, groen voor hydroxykaneelzuren en hydroxybenzoëzuur zuren, paars voor flavan-3-ols / procyanidins, en geel voor andere flavonoïden. A: component P1: Q2: 0,278; R2X: 0,0529; Q2cum: 0.278; component P2: Q2: 0,33; R2X: 0,0394; Q2cum: 0,608. B: component P1: Q2: 0,353; R2X: 0,0639; Q2cum: 0,353; component P2: Q2: 0,188; R2X: 0,0374; Q2cum:. 0,541 Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figuur 4
Figuur 4: Verdeling van metabole markers tussen de drie macro-zones:. Gardameer, Soave en Valpolicella metabolietniveaus weerspiegelen de gemiddelde ± standaard fout (n = 18 voor Garda en Soave, 27 voor Valpolicella macro-zone) van verschillende geglycosyleerde en geacyleerde anthocyanen, resveratrol / stilbenen en flavonoïden in rijpe Corvina bessen in de drie verschillende groeiseizoenen (2006, 2007 en 2008). Verschillende letters staan voor groepen die significant verschillend zoals bepaald door een t-test (p <0,05) waren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De specifieke handtekeningen van de zeven afzonderlijke wijngaarden werden geïdentificeerd met behulp van een specialeseerde statistische benadering 10. Twee O2PLS DA-modellen werden gebouwd, één verkennen van de verschillen tussen de bessen geteeld in de drie macro-zones in veraison en andere onderzoeken de verschillen tussen de drie macro-zones bij volwassen bessen. De modellen waren cross gevalideerd met een permutatietoets (200 permutaties) en aangezien het model dat de rijpe bessen in de drie macro-zones geldig was, terwijl slechts het Gardameer monsters werden onderscheiden van de andere monsters bij veraison (niet getoond).

De score plots van de twee modellen, die aantonen hoe de monsters van de drie macro-zones bij veraison en looptijd worden gescheiden naar de verdeling van metabolieten zijn weergegeven in Figuren 3A en 3B. Het laden van deze percelen model uitgedrukt pq (corr), dat wil zeggen de correlatie tussen p (de klasse van monsters) en q (metabolieten), worden getoond in figuurs 3C en 3D. In het laden plots rood vierkanten geven de klasse van monsters (macro-zones) en de gekleurde driehoeken vertegenwoordigen de individuele metabolieten. De afstand tussen de metabolieten en de monsters weerspiegelt hun relaties. De metabolieten zijn kleurcode op basis van hun chemische klasse.

Gezien de lage statistische geldigheid van het veraison model zoals getoond door permutatie test, is het waarschijnlijk te lijden onder overfitting. Daarom is de volgende opmerkingen alleen betrekking op de rijpe bessen monsters, wiens model was statistisch valide. In het laden grafiek weergegeven in figuur 3D, worden de stilbenen verschoven naar het Gardameer macro-zone, terwijl de flavonoïden zijn verschoven naar de Soave en Valpolicella macro-zones. Een nadere blik op de individuele metabolieten onthult de asymmetrische verdeling van anthocyanen, met peonidine en zijn derivaten vaker in het Lake Garda macrozones en andere anthocyanen meer voor in de Valpolicella macro-zone (Figuur 4). Eenvoudige anthocyanine-3-O-glucosiden zijn vaker in de Valpolicella macro-zone, terwijl geacyleerde en coumarated derivaten zijn meer voor in de Soave macro-zone.

De transcriptomics onderdeel van deze case study was oorspronkelijk met behulp van een transcriptomics platform dat niet meer wordt ondersteund. Als gevolg daarvan zetten we een alternatieve procedure, met de nog beschikbare platform; het nieuwe platform bevat meer sondes dan de oude, met inbegrip van 249 meer Pinot noir voorspeld transcripties, 4392 nieuw geïdentificeerde Pinot loci en 179 Corvina privé-genen 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit artikel beschrijft de metabolomics, transcriptomics en statistische analyse protocollen die worden gebruikt om de druivenbes terroir begrip interpreteren. Metabolomics analyse met HPLC-ESI-MS is gevoelig genoeg om grote aantallen metabolieten gelijktijdig detecteren, maar de relatieve kwantificering wordt beïnvloed door de matrixeffect en ion onderdrukking / verbetering. Er is echter een soortgelijke aanpak reeds zijn gebruikt om de rijping en post-harvest verdorren van Corvina bessen te beschrijven, en de correctie van matrix-effecten hadden een beperkte invloed op de resultaten 5. Verder is een recente grootschalige multi-instrument inter-laboratorium onderzoek naar de relatieve robuustheid van NMR en LC-MS voor ongerichte metabolomics met dezelfde monsters te bepalen bleek dat de verschillende instrumenten en technologieën leverde consistente resultaten 6. De case study hierin beschreven betrokken het verzamelen en analyseren van monsters op drie rijpende stadia van zeven wijngaarden in drie macro-zdie meer dan drie groeiseizoenen. Hierin werd de handtekening terroir onderzocht op de macro-zone-niveau (het Gardameer en Soave, elk vertegenwoordigd door twee wijngaarden, en Valpolicella, vertegenwoordigd door drie wijngaarden) met behulp van PCA en O2PLS-DA multivariate statistiek. De verschillen tussen de afzonderlijke wijngaarden subtieler en vereisen meer geavanceerde en gevoelige statistische benaderingen 10. Verschillende stappen van de voorgestelde protocollen kritisch en hebben om succesvol antwoord op de biologische vragen streek invloeden op druiven kwaliteit te worden beschouwd.

Allereerst passende steekproefplan kritisch: de keuze van een specifieke kloon de genetische verschillen en meerjarige duur van de sampling de echte, geluid verschillen tussen de verschillende terroirs markeren minimaliseren. Anderzijds, werd het voorgestelde onderzoek verricht in een streek die bijzonder geschikt is voor wijnbouw, en dit kan minimaliseren de terroir-verschillen op druif kwaliteit. Zo zou het interessant zijn om dezelfde cultivar gekweekt in een minder optimaal zone vergelijken maar uiteraard kan deze wijngaarden eenvoudigweg niet beschikbaar.

Vanuit technisch oogpunt zeer reproduceerbare scheiding door middel van HPLC metaboliet is kritisch voor goede gegevensmatrix; aangezien hoe hoger het verschil in verblijftijd in de verschillende analyses, hoe hoger het aantal fouten in piek aanpassing in de uiteindelijke dataset. Het is dus van cruciaal belang een geschikt re-evenwicht in te stellen, de monsters in partijen van 9-10 monsters met cycli van chromatografische reiniging kolom elkaar te verdelen en blancomonsters als het eerste monster van elke partij. LC-MS wordt getroffen door een zekere mate van instabiliteit, wat kan leiden tot verschillen tussen monsters die instrument-gedreven zijn. Dit probleem kan gedeeltelijk worden opgelost door de randomisatie van monsteranalyse, zoals in dit document. een imtering van de methode is het gebruik van de juiste kwaliteitscontrole monsters in elke partij, die kan informeren op het platform staat. Een geschikte standaardverbinding mix (dwz standaardverbindingen met m / z-waarden en retentietijden verspreid over de gehele m / z en retentietijd bereik) en een nieuw controlemonster verkregen door gelijke delen van poeder uit alle monsters kan informeren over platform effecten en ook eventueel worden gebruikt voor a posteriori gegevensnormalisatie.

Een ander belangrijk punt om te vergelijken metabolomics en transcriptomics resultaat was precies hetzelfde materiaal (dat wil zeggen dezelfde gebroken monsters) voor zowel de analyses. In de data-analyse, is het essentieel om een ​​geschikte statistische methode, zoals OPLS-DA, die eenvoudige interpretatie van de verschillen in genexpressie en metaboliet accumulatie met betrekking tot technieken zoals PCA toelaat. Een van de belangrijkste beperkingen van dit type van benadering is hetafwezigheid van sterke methoden voor transcriptomics en metabolomics data-integratie. De ontwikkeling van geschikte methoden voor verschillende soorten data correlatie is nodig om een ​​sterke en betrouwbare correlatie tussen transcriptomics en metabolomics data bouwen.

De in dit artikel beschreven technieken wordt duidelijk op welke rijpen en vintage effecten op de bes metaboloom, maar specifieke chemische handtekeningen die de drie macro-zones werden ook geïdentificeerd in rijpe bessen onder de heersende vintage effect. Interessant was de analyse van veraison bessen geen statistisch valide model verkregen, wat aangeeft dat de streek begrip voornamelijk manifesteert zich door metabolieten die accumuleren tijdens rijping (bijvoorbeeld anthocyanen en stilbenen) dan de reeds in de onrijpe bessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mill Grinder IKA IKA A11 basic
HPLC Autosampler Beckman Coulter  - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter  - System Gold 127 Solvent Module HPLC
C18 Guard Column Grace  - Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column
C18 Column Grace  - Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
Mass Spectometer Bruker Daltonics  - Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap.
Extraction solvents and HPLC buffers Sigma 34966 Methanol LC-MS grade
Sigma 94318 Formic acid LC-MS grade
Sigma 34967 Acetonitrile LC-MS grade
Sigma 39253 Water  LC-MS grade
Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) Sartorius 17764
Softwares for data collection (a) and processing (b) Bruker Daltonics - Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b)
Spectrum Plant Total RNA kit Sigma-Aldrich STRN250-1KT For total RNA extractino from grape pericarps
Nanodrop 1000 Thermo Scientific 1000
BioAnalyzer 2100 Agilent Technologies G2939A
RNA 6000 Nano Reagents Agilent Technologies 5067-1511
RNA Chips Agilent Technologies 5067-1511
Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 Agilent Technologies 5188-5325
Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 Agilent Technologies 5188-5326
LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color Agilent Technologies 5190-2305
Kit RNA Spike In - One-Color Agilent Technologies 5188-5282
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242
RNeasy Mini Kit (50) Qiagen 74104 For cRNA Purification
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray Agilent Technologies G2514F-048771 
eArray Agilent Technologies - https://earray.chem.agilent.com/earray/
Gasket slides Agilent Technologies G2534-60012 Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization
Thermostatic bath Julabo -
Hybridization Chamber Agilent Technologies G2534-60001
Microarray Hybridization Oven Agilent Technologies G2545A
Hybridization Oven Rotator Rack Agilent Technologies G2530-60029
Rotator Rack Conversion Rod Agilent Technologies G2530-60030
Staining kit Bio-Optica 10-2000 Slide-staining dish and Slide rack
Magnetic stirrer device AREX Heating Magnetic Stirrer F20540163 
Thermostatic Oven Thermo Scientific Heraeus - 6030
Agilent Microarray Scanner Agilent Technologies G2565CA
Scanner Carousel, 48-position Agilent Technologies G2505-60502
Slide Holders Agilent Technologies G2505-60525
Feature extraction software v11.5 Agilent Technologies - inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA
SIMCA + V13 Software Umetrics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
  2. Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
  3. Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
  4. Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
  5. Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
  6. Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
  7. Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
  8. Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
  9. Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).
  10. Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
  11. Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
  12. Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
  13. Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
  14. Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
  15. Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
  16. Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
  17. Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
  18. Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
  19. Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
  20. Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
  21. Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
  22. Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
  23. Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
  24. Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
  25. Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
  26. Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
  27. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
  28. Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).

Tags

Genetics metabolomics transcriptomics terroir wijnranken multivariate statistische analyse principal component analyse (PCA) bidirectionele orthogonale projectie latente structuren discriminerende analyse (O2PLS-DA) biochemie
De Terroir Concept Uitgelegd door de Bes van de Druif Metabolomics en Transcriptomics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dal Santo, S., Commisso, M.,… More

Dal Santo, S., Commisso, M., D'Incà, E., Anesi, A., Stocchero, M., Zenoni, S., Ceoldo, S., Tornielli, G. B., Pezzotti, M., Guzzo, F. The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics. J. Vis. Exp. (116), e54410, doi:10.3791/54410 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter