Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

קונספט טרואר לפרש דרך הענבים הברים Metabolomics ו transcriptomics

Published: October 5, 2016 doi: 10.3791/54410
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1, 1, 1, 1, 1
1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מתאר את היישום של metabolomics לא ממוקד, transcriptomics ניתוח סטטיסטי רב משתני תמלילי ברי ענבים מטבוליטים כדי לקבל תובנה לגבי מושג טרואר, כלומר, השפעת הסביבה על תכונות איכות ברה.

Abstract

טרואר מתייחס שילוב של גורמים סביבתיים המשפיעים על המאפיינים של גידולים כמו גפן (גפן יין) על פי בתי גידול מסוימים ודרכי ניהולו. מאמר זה מראה כיצד חתימות טרואר מסוימות ניתן לאתר את metabolome גרגרי היער transcriptome של מוסר ים זן גפן באמצעות ניתוח סטטיסטי רב משתנה. השיטה הראשונה דורשת תוכנית הדגימה המתאימה. במחקר במקרה זה, שיבוט מסוים של זן קורבינה נבחר כדי למזער הבדלים גנטיים, דגימות נאספו משבעה כרמים המייצגים שלושה אזורי מאקרו שונים במהלך שלוש עונות גידול שונות. גישת metabolomics ממוקדת LC-MS מומלץ בשל הרגישות הגבוהה שלו, מלווה עיבוד נתונים יעיל באמצעות תוכנת MZmine ואסטרטגית זיהוי המטבוליט סמך ניתוח עץ פיצול. ניתן להשיג ניתוח transcriptome מקיף באמצעות מערכיםבדיקות המכילות כיסוי ~ 99% מכלל גני גפן החזה, המאפשר ניתוח סימולטני של כל הגנים לידי הביטוי באופן דיפרנציאלי בהקשר של terroirs השונה. לבסוף, ניתוח נתונים רבים משתנים המבוסס על שיטות הקרנה ניתן להשתמש כדי להתגבר על ההשפעה וינטאג ספציפי החזקה, המאפשר metabolomics ונתוני transcriptomics להיות משולבים ונותחו בהרחבה לזהות מתאמים אינפורמטיבי.

Introduction

ניתוח נתונים בקנה מידה גדולה מבוססים על הגנום, transcriptomes, proteomes ו metabolomes של צמחים מספק תובנה חסרת תקדים אל תוך ההתנהגות של מערכות מורכבות, כגון מאפייני טרואר יין המשקפים את יחסי הגומלין בין צמחי גפן לבין סביבתם. מכיוון טרואר של יין יכול להיות ברור גם כאשר שיבוטי גפן זהים גדלים בכרמים שונים, ניתוח הגנומיקה הוא שימוש קצת כי הגנום המשובט זהה. במקום יש צורך להסתכל מתאמים בין ביטוי גנים המאפיינים המטבולי של פירות יער, אשר קובעות את תכונות איכות היין. ניתוח ביטוי גנים ברמת יתרונות transcriptome מן התכונות הכימיות הדומות של כל התמלילים, המאפשרות ניתוח כמוני על ידי ניצול מאפיינים אוניברסאליים כמו הכלאת בדיקות משותקות על microarrays. לעומת זאת, שיטות אנליטיות אוניברסלית בתוך פרוטאומיקהnd metabolomics יותר מאתגר בגלל המגוון הפיסיקלי וכימי הענק של חלבונים מטבוליטים פרט. במקרה של metabolomics המגוון הזה הוא עוד יותר קיצוני כי מטבוליטים הפרט להיות שונה בהרבה בגודלם, קוטביות, שפע ותנודתיות, ולכן אין תהליך החילוץ יחיד או שיטה אנליטית מציע גישה הוליסטית.

בין פלטפורמות אנליטית מתאימות מטבוליטים בלתי נדיף, אלה המבוססים על כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים מצמידים ספקטרומטריית מסה (HPLC-MS) הם הרבה יותר רגיש מאשר חלופות כגון HPLC עם גלאי מערך אולטרא סגולים או דיודה (HPLC-UV, HPLC-DAD ספקטרוסקופיה) או תהודה מגנטית גרעינית (NMR), אבל ניתוח כמותי על ידי HPLC-MS יכול להיות מושפע תופעות כגון אפקט מטריקס ודיכוי יון / שיפור 1-3. חקירת תופעות כאלה במהלך הניתוח של פרותי יער ענבי קורבינה ידי HPLC-MS באמצעות מקור יינון electrospray (HPLC-ESI-MS), הראה כי סוכרים ומולקולות אחרות עם פעמי השמירה הנמוכות ביותר היו underreported מאוד, כנראה גם המשקפים את המספר הגדול של מולקולות באזור זה, וכי השפע של מולקולות אחרות יכול לזלזל, בהערכה או מושפע השפעת מטריקס נורמליזציה, אך הנתונים להשפעת מטריקס נראה שתהיה לה השפעה מוגבלת על 4,5 התוצאות הכוללות. השיטה המתוארת במסמך זה הוא אופטימיזציה עבור הניתוח של מטבוליטים בינוני-קוטבי שמצטברים ברמות גבוהות פרותי יער ענבים במהלך הבשלה, ואשר השפיעו באופן משמעותי על ידי טרואר. הם כוללים אנתוציאנינים, flavonols, flavan-3-ols, procyanidins, פלבנואידים אחרים, רזברטרול, stilbenes, חומצות hydroxycinnamic וחומצות hydroxybenzoic, אשר יחד לקבוע את צבע, טעם ומאפיינים הקשורים לבריאות של יינות. מטבוליטים אחרים, כגון סוכרים וחומצות אורגניות אליפטיות, הם התעלמו בגלל quantitation ידי HPLC-MS הוא אמין בשל מטריקס effect ודיכוי יון תופעות 5. בטווח הקוטבי שנבחר על ידי שיטה זו, הגישה היא לא ממוקדת בכך שהיא שואפת לזהות כמה מטבוליטים שונים כמו 6 אפשריים.

שיטות transcriptomics המאפשרים אלף תמלילי גפן להיות במעקב בו זמנית הם הקלו על ידי הזמינות של רצף הגנום גפן המלאה 7,8. שיטות transcriptomics מוקדם על סמך רצף cDNA תפוקה גבוהה התפתחו עם כניסתו של רצף הדור הבא לתוך אוסף של הליכים המתוארים קולקטיבי טכנולוגיית RNA-seq. גישה זו הופכת במהירות את שיטת הבחירה של מחקרי transcriptomics. עם זאת, גוף גדול של ספרות המבוססת על microarray, המאפשר אלף תמלילים כדי לכמת במקביל על ידי כלאה, צבר עבור גפן. ואכן, לפני RNA-seq הפך טכנולוגיה המיינסטרים, פלטפורמות microarray מסחריות ייעודיות רבות היוtranscriptome גפן פתח המאפשר להיבדק בפירוט רב. בין המגוון של פלטפורמות המכריעים, רק שתיים להותיר ניתוח transcriptome הגנום כולו 9. המערך המפותח ביותר אפשר ההכלאה של עד 12 דגימות עצמאיות על מכשיר אחד, ובכך להקטין את העלויות של כל ניסוי. 12 תת-המערכים כל מורכבת 135,000 בדיקות 60-mer מייצג 29,549 תמלילי גפן. מכשיר זה נעשה שימוש במספר רב של מחקרים 10-24. פלטפורמות אלה שתי עכשיו כבר הופסקו אלא microarray מנהג חדש תוכנן לאחרונה ומייצגות התפתחות מאוחר יותר מכיוון שהיא מכילה מספר גדול יותר של בדיקות המייצגים גני גפן שהתגלו לאחרונה נוספים 25.

בבסיסי הנתונים גדול למכירה המיוצרים על ידי ניתוח transcriptomics ו metabolomics דורשים שיטות סטטיסטיות מתאימות לניתוח נתונים, כוללים טכניקות מרובות משתנות כדי לקבוע מתאמים בין צורה שונהים של נתונים. הטכניקות רבות המשתנה הנפוץ ביותר הן אלה המבוססים על הקרנה, ואלה יכולים להיות ללא השגחה, כגון ניתוח מרכיבים ראשי (PCA), או בפיקוח, כגון היטל אורתוגונלי דו-כיוונית למבנים סמויים ניתוח מבחין (O2PLS-DA) 26. הפרוטוקול המובא במאמר זה מנצל PCA לניתוח נתונים גישוש O2PLS-DA לזהות הבדלים בין קבוצות של דגימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בחר חומרים מתאימים ובונים תוכנית דגימה

  1. בגין הניסוי ידי פיתוח תכנית דגימה מתאימה. אין גישה גנריים אוניברסלי כך להעריך כל תוכנית על בסיס כל מקרה לגופו. ודא כי תכנית הדגימה קובעת מקומות הדגימה, פעמים ואת שיטת הדגימה המדויקת. ראה איור 1 עבור תוכנית דגימה השתמשו במחקר במקרה זה.
    הערה: במחקר במקרה זה, פירות יער ענבים מתוך שיבוט אחד (. Cv גפן היין קורבינה, שיבוט 48) נאספו משבע כרמים מסחריים בשלושה אזורי מאקרו שונים במחוז ורונה (אגם גארדה, Valpolicella ו Soave). המאפיינים העיקריים של כל כרם מסוכמים בטבלה 1. בריס נאספו במהלך שלוש עונות גידול (2006, 2007, ו -2008) בשלוש נקודות זמן, המתאים veraison (תחילת הבשלת), אמצע ההבשלה ופירות יער בשלים.
    1. עבור כל אחת הצטרפויות (vineyard / שנה / שלב הבשלה), קציר 30 אשכולות מעמדות שונות לאורך שתי שורות גפנים, עם גבהים אקראיים ומקומות על הצמח.
    2. בחר שלושה גרגרים באקראי מתוך כל אשכול, הימנעות אלה שיש להם מום גלוי ו / או סימני זיהום.
    3. חזור על שלבי 1.1.1 1.1.2 להשיג שלוש ברכות עצמאיות.
    4. Deseed התותים ולהקפיא את המעטפת מיד בחנקן נוזלי.
    5. קראש 10 פירות יער קפואים מכל בריכה עם מטחנת טחנת אוטומטית, ולחלק כל דגימה אבקת לשני חלקים שווים, אחד לניתוח transcriptomics ואחד לניתוח metabolomics.
    6. אחסן את האבקות ב -80 מעלות צלזיוס.
AM תוֹאַר רִאשׁוֹן בע"מ CS FA MN אחר הצהריים
אזור מאקרו Soave אגם גארדה Valpolicella אגם גארדה Valpolicella Valpolicella Soave
גובה (מ ') 250 120 450 100 130 250 130
כנות 41B S04 K5BB 420A 420A K5BB 41B
כיוון Row EW NS EW EW EW NS NS
מערכת הדרכה מערכת תקורה (פרגולה) מערכת תקורה (פרגולה) מיצוב תירה אנכי (Guyot) מערכת תקורה (פרגולה) Overheמערכת מודעות (פרגולה) מיצוב תירה אנכי (Guyot) מיצוב תירה אנכי (Guyot)
סוג הקרקע חימר בוצי טִין חֶרֶס טִין קליי טין טין טין טין טין
פריסת נטיעות (מ ') 3.20 x 1.00 4.50 x 0.80 4.00 x 1.25 3.50 x 1.20 3.50 x 0.75 2.80 x 1.00 1.80 x 0.80
% סיד סה"כ 3.9 19.3 18.3 14.4 31 5.9 27.9
% סיד Active 0.5 2.6 9.4 6.3 11.3 3.1 8.3
% חול 15 47 66 42 29 13 36
טיט% 43 36 21 37 39 67 36
קליי% 42 17 13 21 32 20 28
pH באדמה 8.3 7.9 7.8 8.2 8.2 7.8 7.9
חומר אורגני (%) 2.9 2.5 2.2 1.2 2.9 1.6 2.5
זרחן חליפי (מ"ג / ק"ג) 26 73 73 68 48 47 64
אשלגן חליפי (מ"ג / ק"ג) 190 376 620 230 168 154 126
מגנזיום חליפי (מ"ג / ק"ג) 272 468 848 623 294 293 183
סידן חליפי (מ"ג / ק"ג) 6500 5380 7358 6346 4652 10055 2878
ברי הפחתת סוכרים 2006 211.25 ± 1.20 176.20 ± 0.42 187.40 ± 0.00 203.70 ± 1.13 212.55 ± 0.64 195.20 ± 0.00 211.65 ± 0.64
ברי הפחתת סוכרים 2007 190.00 ± 1.27 165.25 ± 0.49 153.00 ± 0.42 203.60 ± 0.71 210.90 ± 0.71 192.25 ± 0.64 188.70 ± 1.84
ברי הפחתת סוכרים 2008 191.35 ± 0.64 178.90 ± 0.57 170.05 ± 0.49 205.15 ± 1.48 188.70 ± 0.57 169.35 ± 0.49 108.05 ± 1.06
PH הבר 2006 3.01 ± 0.01 2.96 ± 0.01 2.84 ± 0.00 2.9 ± 0.00 2.98 ± 0.00 3.02 ± 0.00 3.06 ± 0.01
PH הבר 2007 2.97 ± 0.00 3.00 ± 0.00 2.74 ± 0.00 3.07 ± 0.01 2.98 ± 0.00 2.87 ± 0.01 3.09 ± 0.00
PH הבר 2008 2.83 ± 0.00 3.04 ± 0.01 2.71 ± 0.00 2.98 ± 0.01 2.98 ± 0.00 2.82 ± 0.00 3.11 ± 0.00
תאריך קציר 2006 2007 2008
Veraison 8 באוג 18-Jul 12 באוג
אמצע הבשלה 4 בספט 8 באוג 2 בספט
בָּשֵׁל 18 בספט 29 באוג 23 בספט

טבלה 1: תכונות עיקריות של כל כרםאוסף מדגם תאריכים. מ = מטר, EW = לאכול-מערב, NS = צפון-דרום.
איור 1
איור 1:. ייצוג סכמטי של שיטת הדגימה ייצור היין שלושה אזורי מאקרו ממוקמים בסביבה של העיר ורונה, באזור ונטו, איטליה. שלושת נקודות הזמן הם veraison (V) המייצג את תחילת הבשלת ב גפנים, באמצע ההבשלה (MR) ופירות יער בשלים (R). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. כן תמציות אבקה ברה, ניתוח מטבוליטים ולעבד את הנתונים

  1. הכן את דוגמאות האבקה הברה לניתוח.
    1. הכן את התמציות המטבולי של הדגימות הברות בטמפרטורת חדר בשלושה כרכים (w / v) של מתנול acidified עם 0.1% (v / v) עבורחומצת מיקרופון באמבטיה קולית ב 40 קילוהרץ במשך 15 דקות. השתמש במים LC-MS כיתה וחומצה פורמית, מתנול HPLC כיתה.
    2. צנטריפוגה תמציות ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °.
    3. לדלל את supernatant משלב 2.1.2 בשני כרכים (v / v) של מים ללא יונים ולהעביר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר.
  2. נתח את התמציות הברות ידי HPLC-ESI-MS.
    1. הגדר את מערכת HPLC-ESI-MS על פי המלצות של הספק.
      הערה: במחקר במקרה זה, ההתקנה מורכבת מערכת HPLC מצויד autosampler, מחובר ב-קו עם ספקטרומטר מסה יון מלכודת מקור יינון electrospray.
    2. חבר את מערכת HPLC עם טור שומר C18 (7.5 x 2.1 מ"מ 2) ו טור C18 היפוך פאזות (150 x 2.1 מ"מ 2, מיקרומטר בגודל 3 חלקיקים).
    3. הכן את הממסים בשימוש כשלב הנייד. השתמש 5% (v / v) אצטוניטריל, 0.5% (v / v) חומצה פורמית במים כמו מרכך A ו- אצטוניטריל 100% כמו יםolvent .ב שימוש LC-MS כיתה אצטוניטריל, מים וחומצה פורמית.
    4. הפעל את ההפרדה HPLC עם שיפוע ליניארית של ממיסים A ו- B בקצב זרימה מתמדת של 0.2 מ"ל דקות -1 באמצעות נפח הזרקה מדגם של 30 μl.
      1. בתחילה לאזן את העמודה עם 100% א ממס בעקבות הזרקת מדגם, ליצור שיפוע בין 0% ל 10% ב ממס ב 5 דקות, מ -10% ל -20% ב ממס ב 20 דק ', מ -20% ל -25% ב ממס 5 דקות, ולאחר מ -25% ל -70% ב ממס ב -15 דק '.
      2. לנתח כל דגימה בשני עותקים. בחר באקראי ניתוח מדגם כדי למנוע תופעות מונחות מכשיר. אפשר 20 דקות מחדש איזון עם 100% ממס בין כל ניתוח.
    5. רוכשת ספקטרה המונית מצבי יינון שלילי וחיובי חלופי. לקבלת התוצאות שתוארו במחקר במקרה זה, להגדיר את הפרמטרים כמו בטבלה 2. הגדרת המכונית המדויקת תלויה הפלטפורמה הספציפית.
      הערה: לחלופין, להשתמש בחליפה אחרתשיטות מסוגלות פי הפלטפורמה הספציפית.
      1. בכל המקרים, כמו עם כל פלטפורמת הפרדה, הקפד להשתמש זמן מחדש איזון מתאים, כדי שיהיה שחזור זמן שמירה. כאשר מספר הדגימות גבוה (מעל עשר דגימות), לנתח אותם בקבוצות של 9-10 דגימות, עם תוכניות ניקוי עמודת chromatographic (הדרגתיים איטי בין שני ממסי elution) בין כל אצווה. כדי לקבל שחזור זמן השמירה מספיק, להבטיח כי ניתוח chromatographic הראשון של כל אצווה הוא ניתוח ריק (כלומר, ניתוח של הממס).
    6. כמו כן לרכוש ספקטרה המונית במצבי יונים שליליים וחיוביים מקוטעת הגדרת אפשרויות הפיצול (שני מבשרי יון, MS 3). ותסמן את מטבוליטים על ידי ניתוח עץ פיצול (MS / MS ו -3 MS) על פי הוראות היצרן.
      הערה: זה מתאים במיוחד עבור מטבוליטים צמח כי הם לעתים קרובות glycosylated, יסefore הפיצול הראשון (MS / MS) נוטה להסיר את moieties הסוכר עוזב את יון aglycone חינם, ופיצול עקב (MS 3) מסייע לזהות את aglycone נגד ספריית סטנדרטים אותנטית.
    7. רוכשת MS / MS ספקטרה 3 MS בטווח m / z 50-1,500 עם משרעת פיצול של 1 V. לחלופין, להשתמש בשיטות מתאימות אחרת על פי הפלטפורמה הספציפית.
    8. עבור כל אות מ '/ z, השווה את MS / MS ו- MS 3 תבניות קיטוע פעמי שמירה לספריית הסטנדרטים האותנטית על פי הוראות היצרן.
      הערה: סוג של פלטפורמות רבים כוללת מתקני תוכנה לבנות סוג זה של ספרייה באמצעות הניתוח של סטנדרטים אותנטיים. זה אמור לזהות רב של האותות אבל לא כל האותות יהיו מבואר.
    9. עבור האותות המוכנים לחשוף את זהותו, השווה את MS / MS ו- MS 3 תבניות פיצול עם אלו שפורסמו בספרות, searcהינג עבור ערכי m / z (כלומר, הספרה "m / z 353" לחפש פרסומים שבה מולקולות עם מוזכרים m / z כאלה) עם כל אחד מנוע החיפוש הנפוץ זמין בחינם, או להשתמש מאגרי מידע מקוונים כגון MassBank (www .massbank.jp / he / database.html) ואת מסד האדם metabolome (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
> מסת יעד
רכיבי ספקטרומטר מסה פוּנקצִיָה פרמטרים
מקור electrospray יינון Nebulizing גז 50 psi, 350 ° C
גז ייבוש 10 L דקות -1
מלכודת גלאי יון לִסְרוֹק במצב סריקה מלאה, 13,000 מ '/ z לשנייה, מגוון 50-1,500 m / z
400 מ '/ z
התנגשות גז הֶלִיוּם
לחץ אבק 1.4 x 10 -5 mbar
מקור נימים 4000 V
צלחת הסוף לקזז -500 V
מְקַפָּה -40 V
יציאת Cap -121 V
Oct 1 DC -12 V
Oct 2 DC -1.7 V
עדשות 1 +5 V
עדשות 2 +60 V
ICC עבור מצב יינון חיובי 20.000
ICC עבור מצב יינון שלילי 7,000

טבלה 2: סט פרמטר עיקרי לרכישת ספקטרה המונית.

ב-page = "1" FO: keep-עם-next.within-page = "תמיד">
מבצע בְּחִירָה פוּנקצִיָה פרמטרים ערכים
שיא גילוי זיהוי Mass centroid רמת רעש 3,500
בונה הכרומתוגרמה נקודת נתונים הגבוהה ביותר טווח זמן דק ' 0.15
גובה דקות 4,000
מ '/ סובלנות z 0.3
שיא גילוי deconvolution Peak חיפוש מינימום מקומי סף זיהוי תכונות החומרים 70
מינימום חיפוש בטווח RT (דקות) 00:50
גובה ביחס מינימום 15%
גובה מוחלט מינימום 4,000
יחס מינימום של העליון / קצה שיא 2
טווח משך (דקות) 0-10
איזוטופים לוקוס פסגות איזוטופי - מ '/ סובלנות z 1.2
סובלנות RT 00:50
צורת מונוטונית לא
חיוב מקסימאלי 3
איזוטופ נציג לא
יישור הצטרף aligner - מ '/ סובלנות z 1.2
משקל עבור m / z 10
סובלנות זמן שמירה 00:50
משקל עבור RT 5
דרוש באותה מדינה תשלום לא
דרוש אותו מזהה לא
השוואת דפוס איזוטופ לא
מילוי גאפ מאתר Peak - סובלנות Intensity 20%
מ '/ סובלנות z 0.9
סובלנות זמן שמירה 00:40
תיקון RT לא
סִנוּן שכפל מסנן שיא - מ '/ סובלנות z 1.2
סובלנות RT 00:30
דרוש זיהוי זהה לא

טבלה 3: עבודת Mzmine עם ערכים ספציפיים לעבד קבצי נתוני LC-MS ענבים ברים שליליים.

  1. לעבד את הנתונים LC-MS.
    1. גישה אולהוריד חבילת תוכנה לעיבוד נתונים שיכולים לחלץ מידע רלוונטי מתוך chromatograms גלם רב ולבנות מטריקס נתונים שבו כל המטבוליט זוהה הוא לכמת במדגם אחד.
      ההערה: שלבי הפרוטוקול בהמשך מותאמים עבור v2.14 תוכנת MZmine הקוד הפתוח (http://mzmine.sourceforge.net). זהה תוכנות קוד פתוח לעיבוד נתונים ספקטרומטר מסה, כאשר הדגש העיקרי מושם על נתוני LC-MS. 27
    2. להמיר את נתוני הכרומתוגרמה LC-MS לפורמט netCDF באמצעות התוכנה שספקה יצרן הציוד. לקבלת התוצאות שתוארו כאן, השתמש v5.2 Bruker Daltonics אסקווייר ותוכנות v3.2 ניתוח נתונים ולבצע צעדים על פי הוראות היצרן.
      הערה: ממירים אחרים עשויים לשמש (ממירים בחינם כלים שונים זמינים).
    3. לייבא את הקבצים .cdf לתוך התוכנה.
    4. הטמע את שיא גילוי, יישור, פער נהלי סינון מילוי לשיא עם parametERS שדווח בטבלה 3.
      1. כפי הצעד הראשון, בחר קובץ .cdf מיובאים, ואז ללכת ויזואליזציה → TIC / XIC Visualizer. שים את הסמן על הבסיס של השיא הקטן ביותר הכרומתוגרמה ושים לב על עוצמת אות המינימום של יון הבסיס. ואז ללכת שיטות הנתונים הגולמיים → שיא איתור.
      2. בחר איתור Mass ולמלא את רמת האות לזהות יונים בודדים עבור כל סריקה וליצור רשימת יון.
        הערה: בדוק את האלגוריתם קודם לביצוע האיתור ההמוני - זה תלוי ספקטרומטר המסה. במקרה שלנו, אנו בוחרים centroid.
      3. בחר הכרומתוגרמה בונה וממלא את רמת האות להתחבר נקודות נתונים מרשימת היונים לבנות הכרומתוגרמה לכל ערך המוני. ראה הפרמטרים שצוינו במדריך של מסת ספקטרומטר להתאמת Min טווח זמן וסובלנות m / z.
      4. לאחר מכן עבור אל שיא רשימת שיטות → שיא איתור → הכרומתוגרמה Deconvolution. בחר את האלגוריתם המתאים (במקרה זה חיפוש מינימום מקומי) כדי לאפשר הפרדה של כל הכרומתוגרמה לתוך פסגות בודדות.
      5. ידני לבדוק את chromatograms לברר את הערכים המתאימים עבור הפרמטרים הבאים. הגדר את סף זיהוי תכונות החומרים ל -30% כדי להסיר את הרעש חפש מינימום בטווח RT עד 2 (דקות) כדי לזהות נוכחות של המקומיים מינימום להפלות שני שיאים.
      6. גדר גובה יחסית מינימום 2.0. ידני לבדוק את הכרומתוגרמה לזהות את הגובה מוחלט המינימום של אות מתאים לשיא ולא לרקע; הגדר ערך זה כמו גובה מוחלט (למשל, 10,000 בניסוי שהוצג).
      7. גדר Min יחס Peak למעלה / Edge ל -1.1 לציין את היחס המינימאלי בין החלק העליון ואת עוצמות נקודת נתונים הנמוכות ביותר של שיא יוכר לשיא נכון.
      8. ידני לבדוק את chromatograms לראות המהווה את משך הזמן המינימאלי של הפסגות השונות chromat בשימושתנאי ographic (למשל, בין 0.2 ל 2 דקות, תלוי במתחם, בניסויים שהוצגו), וכתוצאה מכך להשתמש בערכים אלו שיא משך טווח (מינימום) כדי להגדיר את טווח אורך שיא מקובל כמו משך.
      9. ואז ללכת שיא רשימת שיטות → איזוטופים → איזוטופים פיקס מקבץ לקבוצת האיזוטופים שיא אחד, בדרך כלל האינטנסיבי ביותר. הערה: הפרמטרים תלויים ברזולוציה של ספקטרומטר המסה ואת השחזור של פעמי השמירה.
      10. לבסוף, עבור אל שיא רשימת שיטות יישור → → הצטרפות Aligner ליישר פסגות תלויות בזמן m / z ושימור שלהם באמצעות ציון משחק.
    5. לאחר יישור הפסגות, למלא כל פערי נתונים על ידי לחיצה על גאפ → שיא רשימת שיטות מילוי Finder שיא →. לבסוף, לסנן לשכפל נקודות נתונים על ידי לחיצה על שיא רשימת שיטות → סינון → שכפל מסנן שיא.
    6. לייצא את הנתונים שהתקבלו בתור .csקובץ נ.
    7. לשנות באופן ידני את. סיומת CSV אל הרחבה. Txt. אם לא נבחרו סיומות קבצים גלויות, לשנות את גדרות המחשב לחשוף סיומות קבצים. עבור אל קובץ → אפשרויות תצוגת סייר → הגדרות מתקדמות ובטל את "הסתר סיומות עבור סוגי קבצים מוכרים" תיבת.
    8. ייבא את קבצי txt לתוך גיליון אלקטרוני. זה מייצר מטריצת נתונים שבו כל מטבוליטים המזוהה, מוכר באמצעות מספר זיהוי, מ '/ z זמן ערך ושימור, הם לכמת בכל הדגימות מבחינה ערכי אזור השיא שלהם.

3. להכין תמציות אבקה ברות עבור ניתוח transcriptome ולעבד את הנתונים

  1. חלץ סה"כ RNA מן הדוגמות הברות לקבוע את איכות RNA.
    1. חלץ RNA הכולל הדגימות הברות.
      הערה: במחקר במקרה זה, ערכת קנייני הליך שונה המבטיח הסרה מלאה של מולקולות היתרfere עם ניתוח RNA, כמו סוכרים ופוליפנולים, שמש. ההוראות הבאות הן ספציפיות עבור ערכה זו 18.
      1. לשקול 400 מ"ג של אבקה ברה עבור כל דגימה, לחלק אותו לשני חלקים ומניחים 200 מ"ג כל אחד משני צינורות microfuge.
      2. להוסיף 900 ​​μl של פתרון תמוגה המכיל mercaptoethanol β (המסופק בערכה) לכל 200 מ"ג של אבקת מערבולת מיד נמרצות במשך 30 שניות לפחות. מחמם את המדגם ב 56 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות רועד ב 800 סל"ד.
      3. צנטריפוגה דגימות במהירות מרבית בתוך microfuge benchtop במשך 10 דקות כדי גלולת פסולת הסלולר.
      4. Pipet 700 μl של supernatant לתוך טור הסינון שנקבע (טבעת המייצבת הכחולה) ערכת יושב צינור איסוף 2 מיליליטר. סגור את המכסה צנטריפוגות במהירות מרבית בתוך microfuge benchtop דקות 1 כדי להסיר שאריות שיורית. חזור על פעולה זו פעמים באמצעות באותו טור הסינון אבל צינור איסוף טרי, וכתוצאה מכך שלושה tubes שכל אחת מהן מכילה ~ 700 μl של lysate הבהיר.
      5. Pipet 750 μl של פתרון מחייב (מסופק בערכה) לתוך צינור אחד של lysate הבהיר ומערבבים מיד על ידי pipetting מעלה ומטה לפחות חמש פעמים. העבר 700 μl של תערובת זו לעמודה המחייבת המסופקת בערכה (טבעת המייצבת אדומה) יושבת בתוך צינור איסוף 2 מיליליטר. סגור את המכסה צנטריפוגות במהירות מרבית בתוך microfuge benchtop דקות 1 לחייב את RNA.
      6. למזוג את שבר הזרימה דרך, להפוך את הצינור האוסף והקש עליו בקצרה על כרית נקיה של נייר סופג לניקוז נוזל השיורים.
      7. החזר את עמודת צינור האיסוף ו pipet את התערובת שנותרה לתוך באותו הטור וחזור על צנטריפוגה וצעדי decanting. חזור על הפעולה עד התערובת כולה סוננה לתוך באותו טור מחייב אדום.
      8. כעת בצע את ההוראות הנותרות בערכה ו elute רנ"א חיץ elution 50 μl (מסופק בערכה) ולאחסן it ב -80 ° C מוכן הצעדים בקרת איכות.
    2. לקבוע את הכמות וטוהר של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. רשום את יחסי ספיגה המגלים את מידת הזיהום עם חלבונים (א 260/280) ופוליפנולים / סוכרים (א 260/230).
      הערה: RNA המתאים כלת microarray צריך להבקיע לפחות 1.8 עבור שניהם יחסיים.
    3. קבע את שלמות RNA.
      הערה: ניתן להשתמש במערכות שונות. רוכש דיגיטלי שמבצע ריצת electrophoretic נימים בשילוב עם פלורסנט לצבוע נעשה שימוש במחקר במקרה זה. RNA מתאים הכלאה microarray צריך מספר Integrity RNA (רין) של 8 לפחות.
  2. הכינו דגימות להכליא את הרנ"א על ​​Microarray אישית.
    1. הגדר את הסכום ההתחלתי של רנ"א הכל לניתוח microarray 200 ng על ידי דילול פתרון RNA שהושג בשלב 3.1.1.8 עם מים RNase ללא deionized. תוסיף את ההכמות המתאימה של RNA לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל בנפח סופי של 1.5 μl.
    2. הוסף 2 μl של תמהיל ספייק מדולל מדגם RNA ופעל לפי הוראות היצרן לסנתז cDNA הגדיל הראשון, לתמלל את זה לתוך קרנתי ואת התווית קרנו עם 3CTP cyanine.
    3. לטהר את קרנה שכותרתו פי הוראות היצרן ו elute ב 30 מים μl RNase חינם.
    4. קבע את פעילות התשואה ספציפית של כל קרן על ידי הקלטת שלושה ערכים על ספקטרופוטומטר: cyanine 3 ריכוז לצבוע (pmol μl -1), טוהר RNA (א 260/280) וריכוז קרנה (ng μl -1). השתמש בנוסחות נמצאות הוראות ההפעלה של היצרן כדי לחשב את התשואה קרן (מיקרוגרם) ואת הפעילות הספציפית (Cy3 pmol לכל קרנה מיקרוגרם).
      הערה: תשואות מומלצות ופעילויות ספציפיות שונות על בסיס פורמט microarray הספציפי. במחקר במקרה זה פורמט 44K 4-חבילה היהנבחר, התשואה המומלצת הייתה 1.65 ואת הפעילות הספציפית הייתה 9.
    5. לעצב את microarray המותאם אישית באמצעות תוכנה מתאימה לעיצוב חללי.
      1. לקבלת התוצאות שתוארו במחקר במקרה זה, להכין microarray מנהג חדש, מעוצב על פורמט 44K 4-חבילה באמצעות יישום מבוסס אינטרנט עבור עיצובי microarray המנהג וספריות oligonucleotide. בדיקות עיצוב כדי להתאים 34,651 תמלילי יעד, כולל 29,971 חזה תמלילים מן המערך V1 פינה יואר, לוקוסים חדשים 4,500 שזוהו זן הפינו ידי שחזור transcriptome קורבינה ו -180 גני קורבינה פרטיים 25.
        הערה: זה מעורב בייצור של 34,651 בדיקות ספציפיות 60-mer, המהווה 29,798 פינו יוארו חזה תמלילים, 4,392 לוקוסים פינו חדשים 179 גנים פרטיים מוסרת.
    6. הכן את הרכבת ההכלאה בהתאם למפרטים בפורמט 4-חבילה כדלקמן.
      1. מניחים 1.65 מיקרוגרם של קרנה Cy3 שכותרתו בנפח סופי של 41.8μl של RNase ללא מים ללא יונים. להוסיף 11 μl של 10x סוכן חסימה ו -2.2 μl 25x פיצול הצפה. לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמבט תרמוסטטי לפצל RNA. מיד מגניב על קרח למשך 1min.
      2. לבסוף, להוסיף 55 μl של חיץ הכלאה 2x, ומערבבים היטב על ידי pipetting ספין דקות 1 ב 15,500 XG ב RT. מיד במקום צינור microcentrifuge על הקרח. להשתמש מיד, לא לאחסן אותו.
    7. טען את microarray מנהג כדלקמן.
      1. טען שקופיות אטם עם התווית פונה כלפי מעלה לתוך הבסיס של חדר כלה. לאט לטעון 100 μl של המדגם הכלאה שהושגו בשלב 3.2.6.2 על כל אטם היטב, מחלק את הנוזל עם קצה פיפטה, הימנעות בועות.
      2. לאט למקם את microarray המנהג פונה כלפי מטה, להבטיח כי את הברקוד המספרי הוא פונה כלפי מעלה. ודא כי צמד הכריך מיושר כמו שצריך. לבסוף למקם את המכסה של תא הכלאה על דחוקהמגלשות יד להדק את המהדק על קאמרי. סובב את התא התאסף כדי להעריך את הניידות של בועות.
    8. מניחים קאמרי שקופיות התאספו בבית אסכלה בתוך הכלאה להגדיר תנור ל 65 מעלות צלזיוס. הגדר את הכתף כדי לסובב ב 10 סל"ד. אפשר הכלאה להמשיך במשך 17 שעות.
    9. המשך עם לשטוף שקופיות microarray כדלקמן.
      1. ראשית, להכין שלוש מנות מכתימות שקופיות ולמלא אותם עם מאגרי הכביסה המתאימים: 2 מנות עם הצפה לשטוף 1 ב RT ו 1 צלחת עם טרום חממתי (37 ° C) לשטוף הצפה 2.
      2. לפרק את תא הכלאה ולהסיר את הכריך. עם ברקוד מספרי שקופיות microarray פונה כלפי מעלה, להטביע את הכריך לתוך צלחת שקופיות המכתים הראשונה מלאה לשטוף הצפת 1 ב RT ו, בעזרת מלקחיים נקיים, להפריד את אטם משקופית microarray. העבר במהירות את שקופית microarray לתוך תצוגת שקופיות ומניחים אותו בצלחת שקופיות המכתימה השנייה מלאה לשטוף הצפת 1ב RT.
      3. שים את צלחת שקופיות המכתימה גבי בוחש מגנטי ולשטוף 1 דקות עם ערבוב מתון. העבר במהירות מתלת השקופית לתוך צלחת מכתים השקופיות השלישית מלאה מראש התחממתי (37 ° C) לשטוף הצפה 2 ולשטוף 1 דקות עם ערבוב מתון.
      4. לאט להסיר את מתלת מצלחת מכתים השקופיות ולהסיר את השקופית בזהירות מהמדף, הימנעות טיפות.
        הערה: אל תוסיפי טריטון X-102 מאגרי הכביסה להשמיט את שלב כביסת אצטוניטריל.
    10. אחסן את שבב שטף בחושך בטמפרטורת החדר.
  3. סרוק את microarray ו חלץ את התכונות הבולטות.
    1. מניחים את השקף microarray לתוך סורק מתאים ולסרוק כל מערך באמצעות הגדרות פרמטר מומלץ במדריך הוראות היצרן microarray. לקבלת התוצאות שתוארו כאן, במקום כל שקופית microarray לתוך החזיק שקופיות כדי להקל על הליך הסריקה.
    2. ייבא את התפוקה .shpלהגיש בתוך תוכנה מתאימה כי הוא מסוגל להמיר אותות דיגיטליים לתוך ערכי ניאון מספריים. בדוק את דו"ח בקרת איכות על מנת להבטיח כי הליך הכלאה היה מוצלח.
      1. לקבלת התוצאות שתוארו כאן, להשתמש בהגדרות פרמטר מומלץ במדריך ההוראות של התוכנה הבלטת תכונות ולבדוק את הדו"ח בקרת איכות על מנת להבטיח כי הפרמטרים המפורטים בטבלה 4 הם בטווח התקין שניתנו על ידי היצרן.
שם מטרי גבול עליון גבול תחתון תיאור
AnyColorPrcntFeatNonUnif 1.00 NA אחוז התכונות שאינם חריגים שאינו אחיד תכונה או ערוץ
DetectionLimit 2.00 0.10 בתוספת ממוצע 1 סטיית התקן של ins ספייק מתחת לטווח הריכוז ליניארי
absGE1E1aSlope 1.20 0.90 המוחלט של השיפוע של כ"י איתותים לעומת ריכוז של בדיקות e1a
MedCVProcSignal 8.00 NA CV% חציון עבור מעובד האיתותים
gNegCtrlAveBGSubSig 5.00 -10.00 ממוצע של רקע מופחתי אות של כל פקדי inlier השליליים (BGSubSignal מחושב על ידי substracting ערך שנקרא BGUsed מן התכונה אומר אות)
gNegCtrlAveNetSig 40.00 NA ממוצע של אות נטו של כל פקדי inlier השליליים
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00 NA סטיית התקן שלרקע מופחת אותות של כל פקדי inlier השליליים
gNonCntrlMedCVProcSignal 8.00 NA CV% החציונית האות מעובד של חלליות בלתי מלאה
gSpatialDetrendRMSFilter 15.00 NA שיורית של detrending רקע בכושר

לוח 4: פרמטרים עיקריים להיבדק כדי לוודא את איכות כלת microarray.

  1. לעבד את נתוני microarray.
    1. לאחר כל שקופיות microarray נסרקו בקרת האיכות כבר העריכה באופן חיובי, להכין מטריצה-נתונים מופרדים באמצעות טאבים ידי בחירת ערכי gProcessedSignal מכל קובץ תוצאה חד subarray, המייצגת את עוצמות קרינת גלם של כל בדיקה.
    2. בגיליון אלקטרוני, לנרמל את הנתונים על 75 לאחוזון ה בתוך כל מערך (ערכי P) ו calculאכל את הממוצע של כל הערכים P בין כל מערכי משנה שונים כדי לחשב את יחס R.
    3. לאחר מכן, באותו גיליון אלקטרוני, לנרמל כל ערך gProcessedSignal ליחס R של תת-סוג משלה.

4. לבצע את הניתוח הסטטיסטי המפורט של Metabolomics ו transcriptomics הנתונים

  1. הכן את תוכנה לניתוח סטטיסטי.
    הערה: במחקר זה מקרה, התוכנה מסוגלת לבצע PCA, PLS-DA ו O2PLS-DA היה בשימוש.
    1. ייבא את metabolomics ונתוני transcriptomics. עבור אל קובץ → פרויקט חדש רגיל → פרויקט רגיל חדש לייבא מטריקס הנתונים המתקבל עם תוכנת MZmine. לאחר מכן לחץ על → ערוך לשרבב המטריצה ​​כולה → בית ולהקצות את סיום → מזהה ראשיים ומשניים המתאים.
    2. Mean למרכז הנתונים ולהרחיב אותם באמצעות סולם פארטו. בחלון הבית, ללכת → ערוך M1 ולשנות את parame המתאיםters בהתאם לנתונים. לקבלת התוצאות שתוארו כאן, לשנות את הסולם מהיחידה שונה בינוני.
    3. קנה המידה של נתוני transcriptomics באמצעות הגדרת היחידה השונה.
  2. לבצע את הניתוח הסטטיסטי רב המשתנה.
    1. הטמע את PCA כמוצג F igure 2. במחקר במקרה זה, PCA חושף את ההבדלים העיקריים בין דגימות, המשקף את שלבי הבשלה שונים וצומח עונות.
      1. בחלון Workset, בחר PCA-X כסוג מודל. לחץ התאמה אוטומטית. שים לב R2X (בהצטיינות) ו Q2 (בהצטיינות) ערכים כפי שהם נותנים מושג על איכות המודל.
        הערה: באופן כללי, ככל שעולה הערכים טובים יותר את המודל, אבל דגמים עם מאוד גבוהה R2X (בהצטיינות) עשויים יתר להתאים את הנתונים. כפי כלל אמפירי, אנחנו מפסיקים הוספת מרכיבים עיקריים כאשר Q2 (בהצטיינות) הערך מתחיל ירידה.
      2. לאחר מכן, בחר ציוני → פיזור לראות עלילה המציגה את הקיבוץ האפשרי של הדגימות.
      3. בדוק את PCAציון מגרש. אם מודל טוב מתקבל (Q2cum> 0.5), השתמש באותה סוגי דגימות לבנות מודל O2PLS-DA (שלב 4.2.2).
    2. בנה שני דגמים O2PLS-DA באמצעות דגימות מסווגים לפי אזור מאקרו ותיקוף מודלים באמצעות מבחן תמורה עם 200 פרמוטציות.
      1. הקצה את הכיתות ידי הולך חלון בית → תצפיות → החדש כפי → M1. הגדר את שיעורי רצוי. לאחר מכן, לשנות את סוג הדגם מ PCA-X כדי O2PLS-DA. לחץ התאמה אוטומטית. ודא כי מספר מרכיבי המודל PLS-DA הוא זהה לזה של O2PLS-DA.
      2. כדי לאמת את מודל O2PLS-DA, ללכת לנתח CV-ANOVA ולראות את p-value התקין. יתר על כן, לחץ על חדש כפי בחלון בית → M2 ולשנות את סוג הדגם מ O2PLS-DA כדי PLS-DA. לחץ התאמה אוטומטית.
      3. עבור אל לנתח → צירופים ולבצע 200 פרמוטציות (בטל את הבחירה באפשרות חישוב מחדש צירופים).
        הערה: הפלט הסופי מראה חלון שבו שו ערך R2ld בדרך כלל להכות את ציר Y בערכים תחת 0,4, בעוד ש 2 צריכים להכות את החלק השלילי של ציר ה- Y. אם ערכי R2 ו / או Q2 אינם נכונים, לצמצם את מספר רכיבים הוא PLS-DA ו O2PLS-DA מודלים.
      4. להמשיך לבחור M2 בפרויקט חלון לחץ על ציוני → פיזור לראות את העלילה ואת המיקום של המעמדות המדגמות. כדי לבחון מה מטבוליטים לאפיין כיתות ספציפית אחת או יותר, עבור אל מגרש / רשימה → פיזור.
      5. שנה את סוג הנתונים בחרו תצפיות והעמסות → מוסיפים סדרה ולשנות את הפריט ב X- ציר וסדרה לתוך pq (קור) ו Comp Pred לתוך 1 ו -2 או מרכיבים נוספים כאשר קיימים, בהתאמה.
      6. עם הלחצן הימני של העכבר נלחץ על המגרש, עבור אל צבע → נכס ובחר לתנאים להבחין בסמלי העלילה בין מולקולות וכיתות. עבור אל מגרש פורמט הפריסה → → ציר ו / או סגנונות כדי לשנות את העלילה עם התכונות הרצויות.
      3. <li> על סמך התוצאות של metabolomics ניתוח O2PLS-DA, הבדלים נוכחים הרמות היחסיות של מטבוליטים או לסוגים של מטבוליטים כמו היסטוגרמות.
    3. בהתבסס על תוצאות ניתוח transcriptomics O2PLS-DA, לאחזר ולהקצות גנים מווסתים באופן דיפרנציאלי ג'ין אונטולוגיה (GO) סיווגי 28.
    4. לזהות יחסים בין רמות המטבוליט ו ביטוי גנים באופן ידני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מקרה המבחן המתואר במאמר זה ניב מטריקס נתונים סופי הכולל 552 אותות (תכונות מ '/ z) כוללים יונים מולקולריים בתוספת איזוטופים שלהם, adducts ושברים מסוימים, לכמת יחסית בקרב 189 דגימות (7 כרמים x 3 שלבי הבשלת x 3 x עונות גידול 3 משכפל ביולוגי). המספר הכולל של נקודות נתונים ולכן היה 104,328. ניתוח עץ הפיצול הביא ביאור של 282 תכונות מ '/ z, מתאים מטבוליטים בתוספת adducts, איזוטופים ושבר. ניתוח גישוש של מטריקס הנתונים כולו על ידי PCA הראה כי דוגמיות התקבצו בהתאם לשלב הבשל (veraison, אמצע הבשלה ובשל) לאורך המרכיבים העיקריים הראשונים ושניים (T1-T2, איור 2 א), ועל פי עונת הגידול יחד הרכיב העיקרי השלישי (T1-T3, איור 2B).

איור 2 src = "/ files / ftp_upload / 54,410 / 54410fig2.jpg" />
איור 2:. PCA של מטריקס נתוני metabolomics כל ההשגחה PCA-X ציון מגרשי פיזור מראים התקבצות דגימות גפן שנאספו במהלך שלוש עונות גידול שונות (2006, 2007, ו -2008) והבשלים שלבים (veraison, אמצע הבשלה ובשל פרותי יער ). בעלילה הראשונה (א ') את הדגימות התקבצו פי השלבים הבשלים, ואילו השני (B) הם התקבצו על פי עונת הגידול. הצבעים להדגיש את השלבים הבשלים כמו ירוק (veraison), ורוד (אמצע הבשלה) וסגול (גרגרי יער בשלים). הסמלים מייצגים את עונות גידול: עיגולים (2006), ריבועים (2007) ומשולשים (2008) .Component T1: ש 2: 0.34; R2X: 0.331; Q2cum: 0.304; T2 רכיב: ש 2: 0.185; R2X: 0.155; Q2cum: 0.433; T3 Component: ש 2: 0.145; R2X: 0.0924; Q2cum: 0.515.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

את PCA השגחה לא הצליח לחשוף תכונות טרואר ספציפיים, אשר מוסתרים תחת השפעת וינטאג נפוצה, כך גישה בפיקוח O2PLS-DA היה מוחל על שני מערכי נתונים נפרד, כלומר, פירות יער ב veraison ופירות יער בשלים לגמרי. דבר זה מאפשר בדיקה של הבדלים מטבוליים המייצגים את שלושת אזורי מאקרו (אגם גארדה, Valpolicella ו Soave) בשני שלבים מרכזיים של הבשלה, לזהות חתימות טרואר ספציפי המייצג באזורים אלה בשלבים ההבשלה אלה.

איור 3
איור 3: O2PLS-DA של veraison ופירות יער ענבים בשלים. O2PLS-DA ציון מגרשי פיזור מראים התקבצות דגימות גפן שנאספו אגם גארדה ( כחול), סואבה (ירוק) ו Valpolicella (ורוד) אזורי המאקרו veraison (א) וכאשר פירות יער בשלים (B). מטבוליטים אחראים האשכולות שנצפו (א) ו- (ב) גלויים בחלקות טעינת קורלציה (ג) ו- (ד) בהתאמה. קבוצות של מטבוליטים, מיוצגים משולשים, הם כחולים רזברטרול ו stilbenes, ורוד עבור אנתוציאנינים, ירוק חומצות hydroxycinnamic ו hydroxybenzoic, סגולות flavan-3-ols / procyanidins, וצהוב עבור פלבנואידים אחרים. ת: ש 2:: P1 רכיב 0.278; R2X: 0.0529; Q2cum: 0.278; רכיב P2: ש 2: 0.33; R2X: 0.0394; Q2cum: 0.608. B: P1 רכיב: ש 2: 0.353; R2X: 0.0639; Q2cum: 0.353; רכיב P2: ש 2: 0.188; R2X: 0.0374; Q2cum:. .541 נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

_content "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 4
איור 4: התפלגות סמנים מטבוליים בין שלושה אזורי מאקרו:. אגם גארדה, Soave, ו Valpolicella רמות המטבוליט לשקף את ממוצע ± סטיית התקן (n = 18 עבור גרדה Soave, 27 עבור Valpolicella אזור מאקרו) של glycosylated שונים אנתוציאנינים acylated, רזברטרול / stilbenes ו פלבנואידים ב גרגרי יער בשלים קורבינה בשלוש עונות גידול השונות (2006, 2007, ו -2008). אותיות שונות מייצגות קבוצות שהיו שונים באופן משמעותי כפי שנקבע על פי מבחן t (p <0.05). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

החתימות הספציפיות משבעת הכרמים הבודדים זוהו באמצעות מיוחדized גישה סטטיסטית 10. שני מודלים O2PLS-DA נבנו, אחד לחקור את ההבדלים בין פירות יער גדל בשלושת אזורי המאקרו veraison, והשני לחקור את ההבדלים בשלושת אזורי מאקרו בין פירות יער בשלים. המודלים היו צולבים תוקף באמצעות מבחן תמורה (200 פרמוטציות) מראה כי המודל המתאר את התותים הבוגרים על פני השלושה אזורי מאקרו היה תקף, ואילו רק דגימות האגם גארדה היו ברורות מן הדגימות הנוספות veraison (לא מוצג).

המגרשים ציון של שני המודלים, שיש בהם כדי להעיד עד כמה דגימות משלוש-אזורי המאקרו veraison ובגרות מופרדים על פי ההתפלגות של מטבוליטים, מוצגים איורים 3A ו 3B. מגרשי העמסת המודל אלה מבוטא pq (קור), כלומר, המתאם בין p (הכיתה של דגימות) ו- q (מטבוליטים), מוצגים באיורים 3C ו 3D. בחלקות ההעמסה, הריבועים האדומים מייצגים את המעמד של דגימות (אזורי מאקרו) ואת משולשי הצבעוניות מייצגים את מטבוליטים הפרט. המרחק בין מטבוליטים לבין הדגימות משקף את יחסיהם. מטבוליטים מקודדים באמצעות צבע על פי המעמד הכימי שלהם.

בהתחשב התקפות הסטטיסטית הנמוכה של מודל veraison כפי שמוצג על ידי מבחן תמורה, היא עשויה סובל overfitting. לכן, התצפיות הבאות מתייחסות אך ורק על הדגימות הברות בשלה, המודל אשר היה סטטיסטי תקפות. בעלילת הטעינה שמוצגת באיור 3D, stilbenes מוזז לקראת המאקרו-אזור האגם גארדה, ואילו פלבנואידים מוזזים לעבר אזורי מאקרו Soave ו Valpolicella. מבט מקרוב על מטבוליטים הפרט מגלה התפלגות סימטרית של אנתוציאנינים, עם peonidin ונגזרותיו שכיח יותר אצל אגם גארמאקרו-אזור דה ו אנתוציאנינים אחרים הנפוצים יותר במאקרו-אזור Valpolicella (איור 4). אנתוציאנין-3-O-glucosides פשוט הרווחות יותר במאקרו-אזור Valpolicella ואילו נגזרים acylated ו coumarated הרווחות יותר במאקרו-אזור Soave.

מרכיב transcriptomics לימוד במקרה זה בא אפוא מתוך באמצעות פלטפורמת transcriptomics שכבר לא נתמכת. כתוצאה מכך, הקמנו הליך חלופי, עם הפלטפורמה עדיין זמינה; הפלטפורמה החדשה כוללת בדיקות יותר מאשר את הישן, כולל 249 יותר פינו יואר חזה תמלילים, לוקוסים פינו זיהו לאחרונה 4392 ו 179 קורבינה פרטי גנים 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר את metabolomics, transcriptomics ופרוטוקולים ניתוח סטטיסטי המשמש לפרש את המושג טרואר ברי ענבים. ניתוח Metabolomics ידי HPLC-ESI-MS הוא רגיש מספיק כדי לזהות מספר רב של מטבוליטים זמנית, אבל quantitation ביחס מושפע השפעה מטריקס ודיכוי / שיפור יון. עם זאת, גישה דומה כבר נעשה שימוש כדי לתאר את הבשלת ופוסט הקציר מצמית של פירות יער קורבינה, ואת תיקון תופעות מטריקס הייתה השפעה מוגבלת על תוצאות 5. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה בקנה מידה גדול רב מכשיר הבין-מעבדה לקבוע את החוסן היחסי של NMR ו- LC-MS עבור metabolomics ממוקדות באמצעות דגימות אותו גילה כי מכשירים שונים וטכנולוגיות הניב 6 תוצאות עקביות. מקרה המבחן המתואר כאן מעורב באיסוף והניתוח של דגימות ב בשלושה שלבי הבשלה משבעה כרמים בשלושה-z מאקרואלה פני שלוש עונות גידול. בזאת, החתימה טרואר נחקר ברמת המאקרו-אזור (אגם גרדה Soave, כל אחד מהם מיוצג על ידי שני כרמים, ואת Valpolicella, מיוצג על ידי שלושה כרמים) באמצעות PCA ו סטטיסטיקה רב משתנית O2PLS-DA. ההבדלים בין כרמים בודדים הם עדינים יותר ודורשים יותר מתוחכמות גישות סטטיסטיות רגישות 10. השלבים השונים של פרוטוקולים המוצעים הם קריטיים צריך להיחשב על מנת לענות על שאלות ביולוגיות בהצלחה על מקורות ההשראה טרואר על איכות הענבים.

קודם כל, תכנית הדגימה המתאימה היא קריטית: הבחירה של שיבוט אחד ספציפי כדי למזער את ההבדלים הגנטיים ואת משך שנים הרבות של הדגימה מאפשר להדגיש את ההבדלים האמיתיים, הקול בין terroirs השונה. בצד השני, המחקר המוצע בוצע בתוך טרואר כי היא מתאימה במיוחד עבור גידול גפנים, ולא מן הנמנע שהדבר מינימייז את ההבדלים טרואר על איכות הענבים. לכן, זה יהיה מעניין מאוד להשוות אותו הזן גדל באזור פחות אופטימלי אבל, ללא ספק, כרמים אלו יכולים להיות פשוט לא זמינים.

מנקודת מבט הטכנית, פרדה המטבוליט מאוד לשחזור באמצעות HPLC היא קריטית להשגת מטריקס נתונים טוב, מאז גבוה ההבדלים בזמן שמירה בניתוחים השונים, ככל שהמספר גבוה יותר של טעויות יישור שיא הנתונים הסופיים. לפיכך, יש חשיבות קריטית כדי לקבוע זמן מחדש איזון מתאים, לחלק את הדגימות לתוך קבוצות של 9-10 דגימות עם מחזורים של ניקוי עמודת chromatographic ביניהם לבין להשתמש דגימות ריקות כמו המדגם הראשון של כל אצווה. LC-MS מושפעת במידה מסוימת של חוסר יציבות, דבר אשר עלול לגרום הבדלים בין הדגימות כי הם מונחים מכשיר. בעיה זו ניתן לפתור חלקית על ידי אקראי של ניתוח מדגם, כפי שמוצגת במאמר זה. הודעה מיידיתprovement של השיטה הוא השימוש דגימות בקרת האיכות מתאימות בכל אצווה, כי יכול להודיע ​​על מדינת הפלטפורמה. תערובת תרכובת תקן מתאימה (כלומר, תרכובות רגילות עם ערכי m / z ו פעמי שמירה פורשים מעל m / z ושימור זמן המגוון השלם) ו מדגם בקרה חדש מתקבל על ידי ערבוב כמויות שווות של אבקה מכל הדגימות יכולים להודיע על פלטפורמה תופעות וגם בסופו של דבר לשמש א-פוסטריורית נורמליזציה נתונים.

נקודה חשובה נוספת כדי להשוות את תוצאות metabolomics ו transcriptomics הייתה להשתמש בחומר בדיוק (כלומר, דגימות אותו הכתוש) עבור שני הניתוחים. בניתוח הנתונים, חשוב להשתמש בשיטת סטטיסטיקה מתאימה, כגון OPLS-DA, המאפשר פרשנות קלה ההבדלים במונחים של ביטוי גנים וצבירת המטבוליט ביחס לשיטות כגון PCA. אחת המגבלות העיקריות של סוג זה של גישה הואבהיעדר שיטות חזקות לשילוב נתוני transcriptomics ו metabolomics. פיתוח השיטות מתאימות לסוגים שונים של מתאם נתונים הוא הכרחי על מנת לבנות קשר חזק ואמין בין transcriptomics ונתוני metabolomics.

הטכניקות המתוארות במאמר זה בבירור חשפו את ההבשלה ואפקטי בציר על metabolome ברי, אבל חתימות כימיות ספציפיות המייצגות את השלושה אזורי מאקרו גם זוהו גרגרי יער בשלים מתחת אפקט וינטאג נפוץ. מעניין לציין, כי ניתוח של פירות יער veraison לא הניב מודל תקף סטטיסטית, המציין כי המושג טרואר מתבטאת בעיקר על ידי מטבוליטים שמצטבר במהלך ההבשלה (למשל, אנתוציאנין stilbenes) מאלה כבר נוכח פירות יער בשלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mill Grinder IKA IKA A11 basic
HPLC Autosampler Beckman Coulter  - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter  - System Gold 127 Solvent Module HPLC
C18 Guard Column Grace  - Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column
C18 Column Grace  - Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
Mass Spectometer Bruker Daltonics  - Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap.
Extraction solvents and HPLC buffers Sigma 34966 Methanol LC-MS grade
Sigma 94318 Formic acid LC-MS grade
Sigma 34967 Acetonitrile LC-MS grade
Sigma 39253 Water  LC-MS grade
Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) Sartorius 17764
Softwares for data collection (a) and processing (b) Bruker Daltonics - Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b)
Spectrum Plant Total RNA kit Sigma-Aldrich STRN250-1KT For total RNA extractino from grape pericarps
Nanodrop 1000 Thermo Scientific 1000
BioAnalyzer 2100 Agilent Technologies G2939A
RNA 6000 Nano Reagents Agilent Technologies 5067-1511
RNA Chips Agilent Technologies 5067-1511
Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 Agilent Technologies 5188-5325
Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 Agilent Technologies 5188-5326
LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color Agilent Technologies 5190-2305
Kit RNA Spike In - One-Color Agilent Technologies 5188-5282
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242
RNeasy Mini Kit (50) Qiagen 74104 For cRNA Purification
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray Agilent Technologies G2514F-048771 
eArray Agilent Technologies - https://earray.chem.agilent.com/earray/
Gasket slides Agilent Technologies G2534-60012 Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization
Thermostatic bath Julabo -
Hybridization Chamber Agilent Technologies G2534-60001
Microarray Hybridization Oven Agilent Technologies G2545A
Hybridization Oven Rotator Rack Agilent Technologies G2530-60029
Rotator Rack Conversion Rod Agilent Technologies G2530-60030
Staining kit Bio-Optica 10-2000 Slide-staining dish and Slide rack
Magnetic stirrer device AREX Heating Magnetic Stirrer F20540163 
Thermostatic Oven Thermo Scientific Heraeus - 6030
Agilent Microarray Scanner Agilent Technologies G2565CA
Scanner Carousel, 48-position Agilent Technologies G2505-60502
Slide Holders Agilent Technologies G2505-60525
Feature extraction software v11.5 Agilent Technologies - inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA
SIMCA + V13 Software Umetrics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
  2. Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
  3. Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
  4. Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
  5. Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
  6. Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
  7. Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
  8. Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
  9. Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).
  10. Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
  11. Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
  12. Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
  13. Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
  14. Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
  15. Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
  16. Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
  17. Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
  18. Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
  19. Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
  20. Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
  21. Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
  22. Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
  23. Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
  24. Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
  25. Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
  26. Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
  27. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
  28. Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).

Tags

גנטיקה גיליון 116 Metabolomics transcriptomics טרואר גפן ניתוח סטטיסטי רב משתנה ניתוח מרכיבים ראשי (PCA) הקרנת מאונך דו-כיוונית למבנים סמויים ניתוח מבחין (O2PLS-DA) ביוכימיה
קונספט טרואר לפרש דרך הענבים הברים Metabolomics ו transcriptomics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dal Santo, S., Commisso, M.,… More

Dal Santo, S., Commisso, M., D'Incà, E., Anesi, A., Stocchero, M., Zenoni, S., Ceoldo, S., Tornielli, G. B., Pezzotti, M., Guzzo, F. The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics. J. Vis. Exp. (116), e54410, doi:10.3791/54410 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter