Introduction
Methylatie van cytosine basen in DNA (5MC) vormt een belangrijke epigenetische merk gevonden in gewervelde dieren genomen in verband met transcriptie silencing 1. 5MC wordt geïntroduceerd en beheerd door DNA-methyltransferase 2-5, en is aangetoond dat het een belangrijke rol spelen bij een aantal biologische processen, waaronder genomische imprinting, X-chromosoom inactivatie, cellulaire differentiatie en ontwikkeling 3, 6. Bijgevolg verstoring van 5MC genomische patronen wordt geassocieerd met een aantal ziekten 7, 8-11. Ondanks de vooruitgang in het begrijpen 5MC rol bij ontwikkeling en ziekte, is het nog altijd grotendeels onbekend hoe deze markering wordt verwijderd ontwikkelen en volwassen weefsels. Verschillende mogelijke mechanismen van DNA demethylering onlangs voorgesteld de actieve en passieve mechanismen demethylering 12, 13, 14, 15. Ontdekking van de producten van de sequentiële oxidatie 5MC gemedieerd door 10-11 translocatie enzymes (tet1 / 2/3), zoals 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) in eukaryotische DNA 16, 17, 18, 19 gevraagd speculaties of zij als tussenproducten kunnen dienen DNA demethylering processen of fungeren als stabiel epigenetische merken in hun eigen recht 13. Terwijl de demonstratie dat het onderdeel van de base excisie reparatie, thymine-DNA glycosylase (TDG) kan binden en verwijder beide 5fC en 5caC uit DNA 19, 20 suggereert een rol voor de gewijzigde 5MC derivaten in een actieve DNA demethylering. Recent bewijs dat 5fC / 5caC de snelheid van RNA II processivity punten kunnen moduleren op mogelijke betrokkenheid van deze merken in gentranscriptieregulatie 29. Vanwege deze potentiële biologische belang van geoxideerde vormen van 5MC hebben verschillende biochemische en antilichaam-gebaseerde technieken toegepast voor het bestuderen van hun genomische distributie en wereldwijde content 16, 19-24.
Aangezien de meeste tHij vertebrate organen bestaan uit verschillende celtypes en dat de verdeling van gemodificeerde basen cytosine is weefsel en celtype-specifieke 16-18, 20, 23, 25-27, het bepalen van de ruimtelijke verdeling van geoxideerde 5MC derivaten in verschillende weefsels wordt een belangrijke experimentele taak die nodig zijn voor het onthullen van hun biologische functies. De meeste biochemische en antilichaam-gebaseerde benaderingen geven geen ruimtelijke informatie over de verdeling van de gemodificeerde vormen van 5MC in verschillende weefsels en celtypen. Daarentegen kan immunochemie gebaseerde technieken een snelle beoordeling mogelijk maakt de ruimtelijke verdeling en nucleaire lokalisatie van 5MC 28 en geoxideerde derivaten 20 te verschaffen. Dat wordt gezegd, de gerapporteerde zeer lage overvloed aan 5fC (20 op de 10 6 cytosine) en 5caC (3 op de 10 6 cytosine) in de muis genoom 18 is een belangrijke uitdaging voor de standaard immunochemische.
Hier,We beschrijven een zeer gevoelige methode die immunochemische robuust en levert een snelle detectie van geoxideerde vorm van cytosine in zoogdieren hersenweefsel. Door de integratie peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen gekoppeld aan een signaal amplificatiestap, deze methode omzeilt de problemen van het detecteren van de zeer kleine hoeveelheden in 5fC en 5caC. Daarnaast kan deze techniek gebruikt worden om samen detecteren gemodificeerde vormen van cytosine met lijnspecifieke markers, effectief aanvulling op andere benaderingen in het ophelderen van de biologische functies van deze epigenetische markeringen.
Protocol
Alle dieren betrokken procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Universiteit van Nottingham ethische toetsing boord.
1. selecteren van geschikte Tissue Voorbereiding voor Immunokleuring
- Genereren van in paraffine ingebedde deel van wildtype CD1 mouse embryo en volwassen hersenweefsel zoals hiervoor 25 beschreven. Gebruik hersenen met ofwel 4% formaldehyde (FA) of 4% paraformaldehyde (PFA) voor immunokleuring methode 25 vaste weefselsecties.
Opmerking: Het gebruik van paraffine ingebedde weefselsecties vereist de-waxen vóór antilichaam labeling. Omdat de behandeling met 2-4 M zoutzuur (HCl) die werkzaam zijn in het protocol voor DNA denaturering is niet compatibel met de meeste antigen herstel strategieën, adviseren wij het gebruik van een van beide cryo- of microtoom secties voor co-detectie van 5MC oxidatie derivaten met eiwit markers.
2. ontwassen paraffine ingebedde weefselcoupes < / P>
- In een lopende klasse II veiligheidskabinet, was de paraffine ingebedde weefselcoupes in een Coplin pot gevuld met xyleen, 2 keer voor 10 minuten elk bij RT.
LET OP: Het is belangrijk om verse xyleen gebruiken als onvolledig paraffine verwijdering kan leiden tot inconsistent kleurpatronen. - Na de-harsen, snel hydrateren de weefselcoupes door wassen achtereenvolgens in 95, 75 en 50% ethanol gedurende 10 min elk bij kamertemperatuur.
3. Fixatie en permeabilisatie van Cryo-en Microtoom Secties
- Bevestig de gerehydrateerd weefselcoupes door ze in ofwel ijskoude 4% PFA of 4% FA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Overtollig fixatief door het wassen van de secties in PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Permeabilize de weefselcoupes door in een Coplin pot gevuld met PBX (0,5% Triton X-100 in PBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder overtollige PBX door het wassen van de afdelingen binnenkort in PBT (0,01% Tween 20 in PBS).
- Plaats de gepermeabiliseerd secties in 2 N HCl gedurende 60 min bij KT depurinering van het DNA.
Opmerking Hoewel hogere concentraties HCl (bijvoorbeeld, 4 N) leiden tot een efficiëntere DNA denaturering, zijn ze niet geschikt voor co-detectie van oxi-mcs met DAPI. - Plaats de secties in 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) gedurende 30 min bij RT om het HCl te neutraliseren. Alternatief driemaal wassen secties voor 5 min elk in PBS. Incubeer de secties in PBT gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig de vloeistof uit de omgeving van het gedeelte weefsel zonder dat het gedeelte weefsel volledig drogen op elk stap door voorzichtig schudden van de glijbaan. Gebruik een hydrofobe barrière pen om het gedeelte omringen zonder het aan te raken.
NB: De hydrofobe barrière pen vermindert het volume van antilichaam die nodig is om het weefsel vlekken en kan toestaan dat meerdere secties te worden gemerkt met different antilichamen op dezelfde dia. - Incubeer secties in 100 pl blokkeeroplossing (10% runderserumalbumine in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
LET OP: Het overslaan van deze stap zou geen invloed op de efficiëntie van het kleuren van de gemodificeerde cytosine bases. - Incubeer de weefselcoupes in 100 ui van een 1: 5000 verdunning van monoklonaal anti-5hmC en een 1: 1000 verdunning van konijnen polyklonaal anti-5caC primaire antilichamen in blokkeeroplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Als alternatief voert de incubatie overnacht bij 4 ° C indien nodig.
OPMERKING: Secties verwerkt zonder primaire antilichamen kunnen als geschikte negatieve controles dienen voor de kleuring procedure. De 12,5 dagen na coïtus muriene embryonale hersensecties verrijkt 5caC, 5fC en 5hmC 20 kan worden gebruikt als positieve controle. - Verwijder het teveel aan antilichamen door het wassen van de secties in een Coplin pot gevuld met PBT driemaal gedurende 5 minuten elk in een Coplin pot bij kamertemperatuur.
OPMERKING: verhoging van wasoplossingen kunnen achtergrondkleuring te verminderen. - Verwijder overtollig PBT en, indien nodig, omringen de afdelingen opnieuw met de hydrofobe barrière pen als PBT detergent dat de hydrofobe barrière kan verzwakken bevatten.
- Maak een 1: 400 verdunning van geit anti-konijn HRP geconjugeerd antilichaam en een 1: 400 verdunning van ezel-anti-muizen-555-geconjugeerd antilichaam in blokkeeroplossing.
- Incubeer de weefselcoupes in 100 pi secondair antilichaam mengsel van stap 4,9 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
- Was de weefselcoupes in een Coplin pot gevuld met PBT driemaal gedurende 5 minuten elk bij kamertemperatuur.
- Plaats de weefselcoupes in 100 ui van een 1: 200 verdunning van tyramide in het tyramide signaalversterking buffer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Onmiddellijk verwijderen overtollige tyramide oplossing door het wassen van de dia's drie keer gedurende 5 minuten elk in PBT.
- carefully verwijderen overtollige PBT en direct betrekking hebben op de secties met een daling van een Mounting Medium (zie Materials List).
- Plaats voorzichtig een dekglaasje op het weefsel secties en onmiddellijk sluit de dekglaasje met nagellak.
- Bewaar de weefselcoupes bij 4 ° C gedurende enkele uren vóór microscopisch onderzoek. Onderzoek onder een fluorescentiemicroscoop bij 405, 488 en / of 555 nm (10 - 40x vergroting).
Representative Results
De verdeling van 5hmC in hersenweefsel secties bepalen, voerden wij co-detectie van deze epigenetische modificatie met een marker voor post-mitotische neuronen, NeuN, gebruik commerciële anti-5hmC antilichaam dat specifiek interageert met dit merkteken maar niet met andere vormen van gemodificeerd cytosine 20, 25. Immunohistochemische analyse van 5hmC en 5caC verdelingen in de volwassen hersenen bleek dat dat de prominente 5hmC kleuring co-lokaliseert met NeuN positieve cellen, NeuN-negatieve gliacellen bezitten lagere genomisch 5hmC (figuur 1) 20.
We hebben onlangs bleek dat Tet-afhankelijke 5MC oxidatie werkzaam is tijdens lineage specificatie van neurale stamcellen (NSCs) 20. Ondanks het feit dat immunochemisch niet op te sporen in NSCs, 5fC en 5caC vertonen prominent immunokleuring in een vroeg stadium van NSCs differentiatie in de richting van een neuronale nd gliale lijnen. Beide merken voorbijgaand accumuleren gelijktijdig met het uiterlijk van de markers van de vroege neuronale en gliacellen differentiatie 20. De verdeling van 5caC te differentiëren NSCs voerden wij co-kleuring van het teken met een gliale marker GFAP op het vaste kweken van NSC op 3 dagen na inductie van gliale differentiatie bepalen. In tegenstelling tot NSCs of rijpe astrocyten (gegevens niet getoond) observeerden we sterk 5caC signaal relatief groot gedeelte van de cellen die GFAP in deze kweken (figuur 2) 20.
Figuur 1. Co-immunokleuring van 5hmC (groen) met Neun (rood) in de Adult Brain Tissue tegengekleurd met DAPI (blauw). Individuele kanalen en de samengevoegde weergave worden getoond. Schaal bars zijn 25 urn.blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Co-immunokleuring van 5caC met GFAP in de cultuur van NSC op dag 3 van Glial Differentiatie. Individuele kanalen en de samengevoegde weergave worden getoond. Schaal bars zijn 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hoewel de gerapporteerde geringe hoeveelheden 5MC oxidatie derivaten 5fC en 5caC in sommige weefsels belangrijke beperkingen zou doen voor een standaard immunochemische protocol, de opname van peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen kon de detectie van deze cytosine wijzigingen gefixeerde weefsels en cellen (figuur 2) . Echter, de optimale incubatietijd met tyramide oplossing experimenteel worden geoptimaliseerd voor elke afzonderlijke partij tyramide signaalamplificatie kit waarin een lineaire relatie tussen de signaalintensiteit en duur van tyramide gebaseerde signaalversterking waargenomen, zie voor details Almeida et al. 2012 26 . Bovendien kan de signaal / achtergrond verhouding significant verbeterd door het uitvoeren van de wassen in een Coplin jar om efficiënte verwijdering van overmaat antilichamen mogelijk. Na incubatie met tyramide oplossing, is het belangrijk de reactie door wassen in PBT oplossing voor d onmiddellijk stoppenaling achtergrond kleuring. Het is essentieel niet om de secties drogen op enig moment tijdens de procedure.
De efficiëntie van DNA depurinering kan worden verbeterd door het uitvoeren van de depurinering reactie bij 37 ° C. Tijdens het gebruik van 4N HCl in plaats van 2 N verbetert de kleuring van de gemodificeerde vormen van 5MC gebruik 4 N HCl DNA depurinering zou niet toestaan co-kleuring met DAPI, omdat deze uitsluitend samenwerkt met dubbelstrengs DNA.
Hoewel deze techniek robuuste semi-kwantitatieve evaluatie van de gemodificeerde vormen van cytosine basen wanneer detecteerbaar kunnen verschaffen, kan het niet worden gebruikt voor het evalueren van de absolute niveaus van 5MC of zijn oxidatie derivaten. Daarom raden wij het gebruik van andere aanvullende maar kwantitatieve benaderingen 16, 19 -24. Sinds de ontdekking van 5MC oxidatie derivaten zoogdieren genomen, zijn verschillende methoden ontwikkeld om de biologische rol 16, 19-24 bestuderen. Hoewel deze approaches kan waardevol zijn bij het bepalen van de absolute niveaus van 5MC oxidatie derivaten zijn, hebben ze geen informatie te verstrekken over hun ruimtelijke verdeling 20, 26. We hebben met succes gebruik gemaakt van de hier beschreven methode om de ruimtelijke verdeling en lokalisatie van 5MC oxidatie derivaten in verschillende celtypen in kaart van de zich ontwikkelende en volwassen hersenen 20
Door de onthulling van hun ruimtelijke verdeling 20 Deze techniek kan cruciaal zijn voor het begrijpen van de biologische gevolgen en het lot van geoxideerde derivaten van 5MC in verschillende biologische contexten waarin deze gemodificeerde derivaten van 5MC kan worden gedetecteerd zoals cellulaire differentiatie, ontwikkeling en ziekte. Bovendien kan de methode hier beschreven semi-kwantitatieve evaluatie van de geoxideerde derivaten van 5MC in verschillende weefsels geven door het bepalen van de kinetiek van peroxidase reactie (die evenredig is met de kleurintensiteit) op verschillende incubatietijden met tyramide 26.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50% in PBS |
| 0.01% Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | pH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22 x 32 mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
- Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
- Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
- Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
- Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
- Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
- Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
- Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
- Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
- Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
- Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).
- Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
- Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).
