Introduction
Metilação de bases de citosina no DNA (5mC) representa uma importante marca epigenética encontrado em vertebrados genomas associadas a transcrição silenciamento 1. 5mC está a ser introduzido e mantido pela ADN metiltransferases 2-5, e tem sido demonstrado que desempenham papéis importantes numa série de processos biológicos incluindo imprinting genômico, inactivação do cromossoma X, a diferenciação celular, e desenvolvimento de 3, 6. Em consequência, a interrupção de padrões de 5mC genómicas está associada com um número de doenças 7, 8-11. Apesar dos progressos na compreensão papel 5mC no desenvolvimento e na doença, ainda é permanecem largamente desconhecidos como esta marca está sendo removido no desenvolvimento e tecidos adultos. Vários mecanismos potenciais de desmetilação de ADN foram recentemente propostas incluindo mecanismos ativos e passivos desmetilação 12, 13, 14, 15. Descoberta dos produtos de 5mC oxidação sequencial mediadas por 1011 translocação enzymES (tet1 / 2/3), tais como 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), e 5-carboxylcytosine (5caC) em eucariótica de ADN 16, 17, 18, 19 solicitado especulações se eles podem servir como intermediários de processos desmetilação de ADN ou marcas epigenéticas agir como estáveis em seu próprio direito 13. Enquanto a demonstração de que o componente de base de reparo de excisão, glicosilase-DNA timina (TDG) pode ligar e remover tanto 5FC e 5caC de DNA 19, 20 sugere um papel para os derivados 5mC modificados numa desmetilação DNA ativo. Evidências recentes mostram que 5FC / 5caC pode modular a taxa de pontos de processabilidade RNA II para o potencial envolvimento destas marcas na regulação da transcrição 29. Devido a este potencial importância biológica das formas oxidadas de 5mC, uma variedade de técnicas bioquímicas e de anticorpos com base têm sido utilizados para estudar a sua distribuição genómico e conteúdo global 16, 19-24.
Dado que a maioria de Tele vertebrado órgãos consistem em diferentes tipos de células e que a distribuição das bases de citosina modificadas é o tecido e tipo celular específico 16-18, 20, 23, 25-27, determinar a distribuição espacial dos derivados oxidados 5mC em diferentes tecidos torna-se um importante experimental tarefa necessária para revelar as suas funções biológicas. A maioria das abordagens bioquímicas e de anticorpos com base não fornecem qualquer informação espacial em relação à distribuição das formas modificadas de 5mC no tecido diferente e tipos de células. Em contraste, técnicas de imunoquímica base pode proporcionar uma ferramenta para a avaliação rápida da distribuição espacial e localização nuclear de 5mC 28 e os seus derivados oxidados 20. O que é dito, o relatado muito baixa abundância de 5FC (20 em cada 10 6 citosina) e 5caC (3 em cada 10 6 citosina) no genoma do rato 18 representa um desafio significativo para imunoquímica padrão.
Aqui,descrevemos um método imunoquímico altamente sensível que proporciona robusta e uma rápida detecção da forma oxidada de citosina no tecido cerebral de mamífero. Com a incorporação de anticorpos secundários conjugados com peroxidase acoplada com um passo de amplificação de sinal, este método evita os desafios de detectar a quantidades muito baixas de 5FC e 5caC. Além disso, esta técnica pode ser utilizada para co-detectar as formas modificadas de citosina com marcadores específicos de linhagem, que complementa eficazmente outras abordagens em elucidar as funções biológicas destas marcas epigenética.
Protocol
Todos os procedimentos envolvidos em animais foram realizados de acordo com o comitê de ética da Universidade de Nottingham de.
1. Seleção de preparação do tecido apropriado para imunocoloração
- Gerar secção embebidos em parafina de embriões de tipo selvagem de ratinho CD1 e tecidos do cérebro adulto, conforme descrito anteriormente 25. Usar secções de tecido do cérebro fixadas com formaldeído a 4%, quer (FA) ou paraformaldeído a 4% (PFA) para o método de imunocoloração 25.
NOTA: O uso de cortes de tecido embebidos em parafina requer de-depilação antes da marcação de anticorpos. Uma vez que o tratamento com 2-4 M de ácido clorídrico (HCl) empregada no protocolo para a desnaturação do DNA não é compatível com a maioria das estratégias de recuperação antigênica, recomendamos o uso de qualquer seções cryo- ou micrótomo para co-detecção de derivados de oxidação 5mC com proteína marcadores.
2. Desparafinação parafina tecido embebido secções < / P>
- Em uma cabine de segurança classe running II, lavar a parafina secções de tecido embebidas numa jarra de Coplin cheio com xileno, 2 vezes para 10 minutos cada em temperatura ambiente.
NOTA: É importante a utilização de xileno fresco como parafina remoção incompleta pode conduzir a padrões de coloração inconsistentes. - Depois da-cera, re-hidratar rapidamente as secções de tecido por lavagem consecutivamente em 95, 75, e 50% de etanol durante 10 minutos cada à temperatura ambiente.
3. Fixação e permeabilização de Cryo- e secções do micrótomo
- Fixar as secções de tecido re-hidratadas, colocando-os em qualquer gelo frio PFA a 4% ou 4% de FA durante 15 min à TA.
- Remover o excesso de fixador por lavagem das secções em PBS (salina tamponada com fosfato) durante 5 min à TA.
- Permeabilizar as secções de tecido, colocando num frasco Coplin preenchido com o PBX (0,5% de Triton X-100 em PBS) durante 30 min à TA. Retire o excesso de PBX por lavagem das secções em breve em PBT (0,01% de Tween 20 em PBS).
- Coloque as secções permeabilizadas em HCl 2 N durante 60 min à TA durante despurinação do DNA.
Nota: Embora as concentrações mais elevadas de HCl (por exemplo, 4 N) conduz a uma desnaturação do DNA mais eficiente, que não são compatíveis para co-detecção de oxi-MCS com DAPI. - Coloque as secções em Tris-HCl a 10 (pH 8,5) durante 30 min à temperatura ambiente para neutralizar o HCl. Em alternativa, as secções lavar três vezes durante 5 minutos cada em PBS. Incubam-se as secções em PBT durante 5 min à TA.
- Remova cuidadosamente o líquido da área circundante a secção de tecido, sem deixar que a secção de tecido secar completamente em qualquer etapa agitando suavemente o slide. Use uma caneta barreira hidrofóbica para cercar a seção sem tocar na seção.
NOTA: A caneta barreira hidrofóbica reduz o volume de anticorpo necessário para manchar o tecido e pode permitir várias seções de ser marcadas com differenanticorpos t no mesmo slide. - Incubar secções em 100 ul de solução de bloqueio (albumina de soro bovino a 10% em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara húmida.
NOTA: Ignorar este passo não afetaria a eficiência da coloração das bases de citosina modificadas. - Incubam-se as secções de tecido em 100 ul de uma diluição 1: 5000 de anticorpo monoclonal anti-5hmC e uma diluição 1: 1000 de anticorpos primários policlonais de coelho anti-5caC na solução durante 1 h à TA, o bloqueio numa câmara húmida. Alternativamente, realizar a incubação durante a noite a 4 ° C, se necessário.
NOTA: Secções processados sem anticorpos primários podem servir como controlos negativos adequados para o processo de coloração. As secções de 12,5 dias pós-embrionárias de murídeo enriquecidas em coitum cerebrais 5caC, 5FC e 5hmC 20 pode ser usado como controlo positivo. - Remover o excesso de anticorpos por lavagem das secções em um frasco Coplin preenchido com PBT três vezes durante 5 min cada em uma bobinajar lin à temperatura ambiente.
NOTA: O aumento do volume de soluções de lavagem pode reduzir a coloração de fundo. - Remover o excesso de PBT e, se necessário, rodear as secções mais uma vez com a caneta barreira hidrofóbica como PBT conter detergente que pode enfraquecer a barreira hidrofóbica.
- Fazer uma diluição 1: 400 de anticorpo conjugado com HRP de cabra anti-coelho e uma diluição 1: 400 de anticorpo-555 conjugado de burro anti-rato em solução de bloqueio.
- Incubam-se as secções de tecido em 100 ul de mistura de anticorpo secundário a partir do passo 4.9 durante 1 hora à temperatura ambiente numa câmara húmida.
- Lavam-se as secções de tecido em um frasco Coplin preenchido com PBT três vezes durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
- Coloque as secções de tecido em 100 ul de uma diluição 1: 200 de tiramida no tampão de amplificação de sinal de tiramida durante 2 min à temperatura ambiente.
- Imediatamente, remover a solução de tiramida excesso por lavagem das lâminas três vezes durante 5 min cada em PBT.
- carefully remover o excesso de PBT e cobrir imediatamente as seções com uma gota de um meio de montagem (veja Lista de Materiais).
- Delicadamente, coloque uma lamela sobre os cortes de tecido e selar imediatamente a lamela com unha polonês.
- Armazenar as secções de tecidos a 4 ° C durante várias horas antes do exame microscópico. Examinar sob um microscópio de fluorescência a 405, 488 e / ou 555 nm (10 - ampliação de 40X).
Representative Results
Para determinar a distribuição de 5hmC em secções de tecido cerebral, foi realizado co-detecção desta modificação epigenética com um marcador para neurónios pós-mitóticos, NeuN, empregando anticorpo-5hmC anti comercial que interage especificamente com esta marca, mas não com outras formas de modificação citosina 20, 25. a análise imuno-histoquímica de distribuições 5hmC e 5caC no cérebro adulto revelou que, enquanto a coloração proeminente 5hmC co-localiza com as células positivas NeuN, células gliais NeuN-negativas possuem níveis mais baixos de 5hmC genómico (Figura 1) 20.
Recentemente, mostrou que a oxidação 5mC Tet-dependente é operatório durante a especificação das linhagens de células-tronco neurais (NCCC) 20. Apesar de ser imunoquimicamente indetectável no NSC, 5FC e 5caC exibem imuno proeminente nas primeiras fases de diferenciação NSC no sentido neuronal uma nd linhagens gliais. Ambas as marcas transitoriamente acumular concorrentemente com a aparência de marcadores de diferenciação neuronal e glial precoce 20. Para determinar a distribuição de 5caC na diferenciação NSC nós realizadas co-coloração deste traço com um marcador glial GFAP sobre as culturas fixadas de NSC aos 3 dias de indução da diferenciação glial. Ao contrário de NSC ou astrócitos maduros (dados não apresentados), observou-se sinal forte em 5caC relativamente grande proporção das células que expressam GFAP nestas culturas (Figura 2) 20.
Figura 1. Co-imunocoramento 5hmC (verde) com NeuN (vermelho) no tecido adulto Cérebro contrastadas com DAPI (azul). Os canais individuais ea exibição mesclada são mostrados. As barras de escala são de 25 uM.blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Co-imunocoramento 5caC com GFAP na cultura do NSC no dia 3 de glial diferenciação. Os canais individuais ea exibição mesclada são mostrados. Barras de escala são 20 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Embora a baixa abundância relatado de derivados de oxidação 5mC, 5FC e 5caC em alguns tecidos iria apresentar limitações significativas para um protocolo imunoquímica standard, a incorporação de anticorpos secundários conjugados com peroxidase permitiu a detecção dessas modificações citosina em tecidos e células fixas (Figura 2) . No entanto, o tempo de incubação óptimo com a solução tiramida devem ser optimizadas experimentalmente para cada lote individual de tiramida kit de amplificação de sinal em que uma relação linear entre a intensidade do sinal e a duração de amplificação de sinal com base tiramida é observada, para indicações referem-se Almeida et ai 2012 26. . Além disso, a relação sinal / fundo pode ser significativamente aumentada através da realização das lavagens em um frasco Coplin para permitir a remoção eficiente do excesso de anticorpos. Após a incubação com uma solução de tiramida, é importante para parar imediatamente a reacção por lavagem em solução de d PBTfundo ecrease coloração. É crítico para não permitir que as secções para secar a qualquer momento durante o procedimento.
A eficiência de despurinação de ADN pode ser melhorada por se realizar a reacção a depurinação a 37 ° C. Enquanto utilizando HCl 4 N em vez de 2 N melhora a coloração das formas modificadas de 5mC utilizando HCl 4 N para a despurinação do DNA não iria permitir a co-coloração com DAPI, à medida que interage exclusivamente com o ADN de cadeia dupla.
Embora esta técnica pode fornecer uma avaliação semi-quantitativa robusta das formas modificadas de bases de citosina onde detectável, ele não pode ser usado para avaliar os níveis absolutos de seus derivados de oxidação ou 5mC. Portanto, recomendamos a utilização de outros complementares, mas quantitativa aproxima 16, 19 -24. Desde a descoberta de derivados de oxidação 5mC em genomas de mamíferos, várias abordagens têm sido desenvolvidas para estudar os seus papéis biológicos 16, 19-24. Embora estes approaches pode ser valiosa na determinação dos níveis absolutos de derivados de oxidação 5mC, eles não fornecem informações relativas à sua distribuição espacial 20, 26. Temos utilizado com sucesso o método descrito aqui para mapear a distribuição espacial e localização de derivados de oxidação 5mC em diferentes tipos de células do desenvolvimento e cérebro adulto 20
Ao revelar sua distribuição espacial 20, esta técnica pode ser crucial para compreender as implicações biológicas e o destino de derivados oxidados de 5mC em vários contextos biológicos onde estes derivados modificados de 5mC podem ser detectados incluindo diferenciação celular, desenvolvimento e doença. Além disso, o método aqui descrito pode dar avaliação semi-quantitativa dos derivados oxidados de 5mC em diferentes tecidos, avaliando a cinética de reacção de peroxidase (que é proporcional à intensidade de coloração) em diferentes tempos de incubação com tyramide 26.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50% in PBS |
| 0.01% Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | pH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22 x 32 mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
- Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
- Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
- Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
- Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
- Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
- Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
- Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
- Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
- Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
- Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).
- Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
- Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).
