Introduction
DNA (5MC) sitozin bazlarının metilasyon transkripsiyonel 1 susturulması ile ilişkili omurgalıların genomları bulunan önemli bir epigenetik işareti temsil eder. 5MC tanıttı ve DNA methyltransferases 2-5 muhafaza ve genomik imprinting, X kromozomu inaktivasyonu, hücresel farklılaşma ve gelişme 3, 6. Sonuç olarak, bozulma dahil biyolojik süreçlerin bir dizi önemli rol oynamaktadır gösterilmiştir ediliyor 5MC genomik desenler hastalıklar 7, 8-11 bir dizi ile ilişkilidir. geliştirme ve hastalık 5MC rolünü anlamak ilerlemeye rağmen, hala bu işareti gelişmekte olan ve erişkin dokular çıkarıldı ediliyor ne ölçüde bilinmemektedir olduğunu. DNA, demetilasyon birçok potansiyel mekanizma en son aktif ve pasif demetilasyon mekanizmaları 12, 13, 14, 15 dahil olmak üzere, önerilmiştir. Discovery 1011 translokasyon enzim aracılı 5MC sıralı oksidasyon ürünleriES (tet1 / 2/3) gibi bunların ara maddeleri olarak hizmet edebilir olup 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) ve DNA 16, 17, 18, 19 spekülasyonlar istendiğinde ökariyotik 5-carboxylcytosine (5caC) halinde kendi başlarına 13 DNA demetilasyon süreçleri ya da hareket olarak stabil epigenetik işaretler. Baz eksizyon onarım bileşeni, timin DNA glikozilaz (TDG) bağlamak ve DNA 19 den 5FC ve 5caC hem kaldırabilirsiniz gösteri, 20 aktif DNA demetilasyon modifiye 5MC türevleri bir rolü olduğunu iken. 5FC / 5caC transkripsiyonel düzenleme 29 bu markaların potansiyel tutulumu RNA II processivity noktalarının oranını modüle gösteren son kanıtlar. Nedeniyle 5MC oksitlenmiş formları bu potansiyel biyolojik önemi, biyokimyasal ve antikor bazlı tekniklerin bir dizi kendi genomik dağılımı ve küresel içerik 16, 19-24 çalışmak için istihdam edilmiştir.
Verilen t en eminO 16-18, 20, 23, 25-27, farklı dokularda okside 5MC türevlerinin uzamsal dağılımını belirlemek deney önemli hale organlar, farklı hücre tiplerini içermektedir ve tadil edilmiş sitosin bazlar dağılımı dokusu ve hücre tipine özel düzenlenmiş olduğu omurgalı onların biyolojik fonksiyonları açıklanması için gerekli görev. Biyokimyasal ve antikor bazlı yaklaşımların çoğu farklı doku ve hücre tiplerinde 5MC biçimlerinin değiştirilmiş biçimleriyle dağıtımı ile ilgili bir mekansal bilgi sağlamaz. Buna karşılık, immunokimya tabanlı teknikler 5MC 28 ve oksitlenmiş türevleri 20 mekansal dağılımı ve nükleer lokalizasyonu değerlendirmek için hızlı bir araç sağlayabilir. Bu fare genomuna 18 (her 10 6 sitozin 3) bildirilen çok düşük 5FC bolluk (20 her 10 6 sitozin olarak) ve 5caC standart immünokimyanın için önemli bir sorun teşkil etmektedir, söylenir.
İşte,Bu sağlam sağlayan son derece hassas immünokimyasal yöntem ve Memeli beyin dokusundaki sitozinin oksitlenmiş biçimde bir hızlı algılama tarif eder. Bir sinyal amplifikasyon aşaması ile birleştirilmiş peroksidaz-konjuge sekonder antikor ilave ederek, bu yöntem 5FC ve 5caC çok düşük miktarlarda tespit zorlukları aşılmaktadır. Buna ek olarak, bu teknik etkili bu epigenetik işaretlerin biyolojik fonksiyonları durulaştırmada diğer yaklaşımları tamamlayan, soy özel işaretleri ile sitozin birlikte tespit modifiye formları kullanılabilir.
Protocol
Tüm hayvan-ilgili prosedürler Üniversitesi'nin Nottingham etik inceleme kurulu ile uygun olarak yapıldı.
1. immün için uygundur Doku Hazırlama seçilmesi
- Daha önce tarif edildiği gibi, 25 vahşi tip CD1 fare embriyoları ve yetişkin beyin dokularının parafine gömülü bölümü oluşturur. % 4 formaldehit (FA) veya yöntemi 25 immün süreyle% 4'lük paraformaldehit (PFA) ile ya tespit edilmiş olan beyin doku bölümleri kullanın.
NOT: parafin doku kesitlerinin kullanılması antikor etiketleme önce de-ağda gerektirir. 2 ile tedavi, -, DNA'nın denatüre edilmesi için protokol kullanılır 4 M hidroklorik asit (HCI) çoğu antijen alma stratejileri ile uyumlu değildir, Protein ile 5MC oksidasyon türevlerinin eş saptanması için kriyo-mikrotom veya bir kısmından kullanılmasını tavsiye belirteçler.
2. Mum Parafin Gömülü Doku Bölümler < / P>
- Çalışan bir sınıf II güvenlik kabininde, ksilen, oda sıcaklığında 10 dakika için 2 defa her biri ile dolu bir Coplin kavanoz parafine gömülü doku kesitleri yıkayın.
NOT: Eksik parafin giderme tutarsız boyanma yol açabilir gibi taze ksilen kullanmak önemlidir. - de-ağda sonra hızlı bir şekilde art arda 95, 75 yıkanarak doku bölümleri rehidrate, ve oda sıcaklığında 10 dakika her biri% 50 etanol.
3. Sabitleme ve kriyo ve Mikroskobik Bölümler Permeabilization
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca buz gibi soğuk% 4 PFA ya da 4% F ya yerleştirilerek rehidre doku bölümleri düzeltildi.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde bölümler (Fosfat tampon salin) yıkanarak fazla Fiksatif çıkarın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (PBS içinde% 0.5 Triton X-100) PBX ile doldurulmuş bir Coplin kavanoza yerleştirilmesiyle doku bölümleri geçirgenliği. PBT (PBS içerisinde% 0.01 Tween 20) ile kısa bir süre bölümleri yıkanarak fazla PBX çıkarın.
- DNA depürinasyon oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 2 N HCI içinde geçirgen kesitleri yerleştirin.
NOT: Her ne kadar HCl daha yüksek konsantrasyonlarda (örneğin, 4 H) talebi daha verimli, DNA'nın denatüre edilmesi için, bunlar DAPI ile oksi-MCS eş saptanması için uyumlu değildir. - HCl'yi nötralize etmek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) bölümleri yerleştirin. Alternatif olarak, 5 dakika PBS içinde her seksiyonu üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBT bölümleri inkübe edin.
- Dikkatle hafifçe slayt sallayarak herhangi bir aşamada tamamen kurumasını doku bölümü izin vermeden doku bölümü çevredeki sıvıyı çıkarın. bölüm dokunmadan bölümü kuşatmak için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın.
NOT: hidrofobik bariyer kalem doku leke ve birden çok bölüm ayırıcı ile boyanmış izin verebilirsiniz gerekli antikor hacmini azaltırAynı slaytta t antikorlar. - nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 saat için bloke etme çözeltisi (PBS içinde% 10 sığır serumu albümini) 100 ul bölümleri inkübe edin.
NOT: Bu adımı atlama modifiye sitozin bazları boyama verimini etkilemez olmaz. - Fare monoklonal anti-5hmC 5,000 seyreltme ve 1: nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 saat için bloke etme çözeltisi tavşan poliklonal anti-5caC birincil antikor 1000 seyreltme 1 100 ul doku bölümleri inkübe edin. Gerekirse Alternatif olarak, 4 ° C'de bir gece inkübasyona gerçekleştirin.
NOT: Primer antikor olmadan işlenen Bölümler boyama işlemi için uygun olarak negatif kontroller hizmet edebilir. 12.5 gün pozitif kontrol olarak kullanılabilir 5caC, 5FC ve 5hmC 20 zenginleştirilmiş coitum murin embriyonik beyin kesitlere. - Bir Cop içinde 5 dakika boyunca PBT ile dolu bir Coplin kavanoza her üç kez bölümleri yıkanarak fazla antikorlarıRT'de lin kavanoz.
NOT: yıkama solüsyonlarının hacmini arttırmak arka plan boyama azaltabilir. - Fazla PBT çıkarın ve gerekirse PBT hidrofobik bariyer zayıflatabilir deterjan ihtiva gibi hidrofobik bariyer kalem ile tekrar bölümleri kuşatmak.
- Keçi anti-tavşan HRP ile konjüge edilmiş antikor 400 seyreltme ve 1: çözümü engelleme eşek anti-fare 555 bağlı antikor 400 seyreltme 1 sağlayın.
- Nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 saat Aşama 4.9 ikincil antikor karışımı, 100 ul doku bölümleri inkübe edin.
- Oda sıcaklığında her biri 5 dakika PBT ile üç kez dolu bir Coplin kavanoz doku bölümleri yıkayın.
- Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tiramid sinyal amplifikasyonu tamponunda tiramid 200 seyreltme: 1 100 ul doku bölümleri yerleştirin.
- Hemen PBT 5 dakika boyunca slaytlar her üç kez yıkanarak fazla tiramid çözüm kaldırmak.
- dikkatliy aşırı PBT çıkarın ve hemen kapak bölümleri bir Montaj Orta bir damla (Malzeme Listesine bakınız).
- Yavaşça doku kesitlerinde bir lamel yerleştirin ve hemen oje ile lamel mühür.
- Mikroskopik incelemede önce birkaç saat 4 ° C'de doku bölümleri saklayın. (- 40X büyütme 10) 405, 488 ve / veya 555 nm'de floresan mikroskop altında inceleyin.
Representative Results
Beyin dokusu bölümlerinde 5hmC dağılımını belirlemek için, özellikle bu işareti ile etkileşir, ancak ticari anti-5hmC antikoru kullanılarak, post-mitotik nöronlar, neun için bir marker ile epigenetik modifikasyon eş algılama gerçekleştirilmez değiştirilmiş formları ile sitosin 20, 25., yetişkin beyinde 5hmC ve 5caC dağılımları immünohistokimyasal analizi, önemli 5hmC boyama NeuN pozitif hücrelerle birlikte lokalize ise NeuN negatif glial hücreler genomik 5hmC (Şekil 1), 20 daha düşük seviyelerde sahip olduğunu ortaya koydu.
Son zamanlarda Tet bağımlı 5MC oksidasyonu nöral kök hücre (NSC'lerde) 20 soy tarifnamede esnasında etkin olduğunu göstermiştir. NSC'lerde immünokimyasal belirlenemeyen olmasına rağmen, 5FC ve 5caC nöronal a doğru NSC'lerde farklılaşma erken aşamalarında belirgin immün sergilemek nd glial soy. Her iki işaretleri geçici erken nöronal ve glial farklılaşma 20 belirteçlerinin görünümü ile eş zamanlı olarak birikir. Bu glial farklılaşmanın başlaması için 3 gün NSC'lerde sabit bir kültür glial markör GFAP ile işareti ko-lekeleme gerçekleştirildi NSCs ayırt 5caC dağılımını belirlemek. NSC'lerde veya erişkin astrositlerin farklı olarak (veriler gösterilmemiştir), bu kültürlerde GFAP eksprese eden hücreler (Şekil 2), 20 nispeten büyük oranda güçlü 5caC sinyal görülmüştür.
5hmC DAPI (mavi) ile zıt Yetişkin Beyin Doku Neun (kırmızı) ile (yeşil). Bireysel kanalları ve birleştirilmiş görünümü Şekil 1. Eş-immün gösterilmektedir. Ölçek çubukları 25 mikron bulunmaktadır."Blank> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Glial Farklılaşma Gün 3 de MGK Kültür GFAP ile 5caC 2. Eş-immün. Bireysel kanalları ve birleştirilmiş görünümü gösterilmektedir. Ölçek çubukları 20 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Bazı dokularda 5MC oksitleme türevleri 5FC ve 5caC bildirilen düşük bolluk standart İmmünokimya protokolü için önemli sınırlamalar mevcut olsa da, peroksidaz-konjuge sekonder antikor dahil sabit doku ve hücrelerin bu sitozin modifikasyonların saptanmasına olanak (Şekil 2) . Ancak, tiramid çözümü ile optimum inkübasyon süresi sinyal yoğunluğu ve tiramid tabanlı sinyal amplifikasyon süresi arasında doğrusal bir ilişki ayrıntılar için, gözlenen tiramid sinyal amplifikasyon kiti her parti için deneysel optimize edilmelidir Almeida ve ark bakın. 2012 26 . Buna ek olarak, sinyal / arka plan oranı önemli ölçüde aşırı antikorların etkin şekilde çıkarılmasını sağlamak için bir Coplin kavanoza yıkama yaparak arttırılabilir. tiramid çözeltisi ile inkübasyondan sonra, hemen d PBT çözeltisi içinde yıkanarak reaksiyonu durdurmak önemlidirecrease plan boyaması. Bölümler işlem sırasında herhangi bir noktada kurumasına izin vermemek önemlidir.
DNA, depürinasyon etkinliği 37 ° C sıcaklıkta depürinasyon reaksiyonun gerçekleştirilmesi ile geliştirilebilir. Bu çift sarmallı DNA ile özel olarak etkileşim edildiği gibi 4 N HCI kullanılarak yerine 2 birlikte, N, DAPI ile birlikte boyama izin değil, DNA depürinasyon 4 N HCI kullanılarak 5MC biçimlerinin değiştirilmiş biçimleriyle lekelenmesini artırır.
Bu teknik, sitosin bazlar burada tespit modifiye formlarının güçlü bir yarı kantitatif bir değerlendirmesini sağlamak için birlikte, 5MC veya oksitleme türevleri mutlak düzeylerini değerlendirmek için kullanılamaz. Bu nedenle, diğer tamamlayıcı kullanılmasını öneririz ama niceliksel 16, 19 -24 yaklaşır. Memeli genomlarında 5MC oksitleme türevlerinin keşfinden beri çeşitli yaklaşımlar biyolojik rolleri 16, 19-24 çalışma geliştirilmiştir. Bu arayışlara rağmenches 5MC oksidasyon türevlerinin mutlak seviyelerini belirlemede değerli olabilir, onların uzaysal dağılımı 20, 26 ile ilgili bilgi vermemektedir. Biz başarıyla farklı hücre tiplerinde 5MC oksidasyon türevlerinin mekansal dağılımını ve yerelleştirme harita Burada anlatılan yöntemi kullandık gelişmekte olan ve yetişkin beynin 20
Mekansal dağılımı 20 ortaya çıkararak, bu teknik, biyolojik etkileri ve 5MC bu değiştirilmiş türevleri hücresel farklılaşma, geliştirme ve hastalık dahil tespit edilebilir çeşitli biyolojik bağlamlarda 5MC oksitlenmiş türevleri kaderini anlamak için önemli olabilir. Buna ek olarak, burada tarif yöntemi tyrami farklı inkübasyon sürelerindeki (boyama yoğunluğuna orantılı) peroksidaz reaksiyon kinetiği değerlendirerek farklı dokularda 5MC oksitlenmiş türevleri yarı-kantitatif değerlendirmeler verebilirDE 26.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50% in PBS |
| 0.01% Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | pH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22 x 32 mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
- Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
- Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
- Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
- Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
- Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
- Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
- Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
- Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
- Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
- Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).
- Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
- Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).
