Introduction
Methylering af cytosin baser i DNA (5mC) er en stor epigenetisk mærke findes i hvirveldyr genomer forbundet med transkriptionel lyddæmpning 1. 5mC bliver introduceret og vedligeholdes af DNA methyltransferaser 2-5, og er blevet vist at spille en vigtig rolle i en række biologiske processer, herunder genomisk prægning, X-kromosom inaktivering, cellulær differentiering og udvikling 3, 6. Følgelig afbrydelse af 5mC genomiske mønstre er forbundet med en række sygdomme 7, 8-11. På trods af fremskridt i forståelsen 5mC rolle i udviklingen og sygdom, er det stadig stort set ukendt, hvordan dette mærke bliver fjernet i at udvikle og voksne væv. Flere potentielle mekanismer DNA demethylering er for nylig blevet foreslået, herunder aktive og passive demethylering mekanismer 12, 13, 14, 15. Discovery af produkterne af 5mC sekventiel oxidation medieret af 10-11 translokation enzymes (TET1 / 2/3), såsom 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), og 5-carboxylcytosine (5caC) i eukaryotisk DNA 16, 17, 18, 19 bedt spekulationer om de kan tjene som mellemprodukter med DNA demethylering processer eller fungere som stabile epigenetiske mærker i deres egen ret 13. Mens demonstrationen, at komponenten af base excision reparation, kan thymin-DNA glycosylase (TDG) binde og fjerne både 5FC og 5caC fra DNA 19, 20 foreslår en rolle for de modificerede 5mC derivater i en aktiv DNA demethylering. De seneste oplysninger viser, at 5FC / 5caC kan modulere hastigheden af RNA II bearbejdelighed peger på potentielle inddragelse af disse mærker i transkriptionel regulering 29. På grund af denne potentielle biologiske betydning af oxiderede former af 5mC, har en række biokemiske og antistofbaserede teknikker blevet anvendt til at studere deres genomiske fordeling og global indhold 16, 19-24.
Da de fleste af than hvirveldyr organer består af forskellige celletyper, og at fordelingen af modificerede cytosinbaser er væv og celletypespecifik 16-18, 20, 23, 25-27, bestemme den rumlige fordeling af oxiderede 5mC derivater i forskellige væv bliver en vigtig eksperimentel opgave nødvendige for afsløret deres biologiske funktioner. De fleste af de biokemiske og antistof tilgange giver ikke nogen geografisk information om fordelingen af de modificerede former af 5mC i forskellige væv og celletyper. I modsætning hertil kan immunkemiske teknikker giver en hurtig redskab til at vurdere den rumlige fordeling og nuklear lokalisering af 5mC 28 og dets oxiderede derivater 20. Det er sagt, rapporteret meget lav overflod af 5FC (20 i hver 10 6 cytosin) og 5caC (3 i hver 10 6 cytosin) i mus genom 18 udgør en væsentlig udfordring for standard immunkemi.
Her,beskriver vi en meget følsom immunokemisk metode, der giver robust og en hurtig påvisning af oxideret form af cytosin i pattedyrs hjernevæv. Ved at indarbejde peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer koblet med et signal forstærkning skridt, denne metode omgår de udfordringer, detektering af de meget små mængder 5FC og 5caC. Derudover kan denne teknik anvendes til at co-detekterer modificerede former af cytosin med linjespecifikke markører, effektivt supplement til andre tilgange i belysningen af de biologiske funktioner af disse epigenetiske mærker.
Protocol
Alle dyr-involveret procedurer blev udført i overensstemmelse med University of Nottingham etiske Review Board.
1. Valg Egnet Tissue Forberedelse til Immunfarvning
- Generere paraffinindlejret snit af vildtype-CD1 museembryoer og voksent hjernevæv som tidligere 25 beskrevet. Brug hjernen vævssnit fikseret med enten 4% formaldehyd (FA) eller 4% paraformaldehyd (PFA) til immunfarvning metode 25.
BEMÆRK: Brugen af paraffin vævssnit kræver de-voksning før antistof mærkning. Da behandlingen med 2 - 4 M saltsyre (HCI) ansat i protokollen for DNA denaturering er ikke kompatibel med de fleste antigen hentning strategier, anbefaler vi brug af enten cryo eller mikrotomknive sektioner for co-detektion af 5mC oxidation derivater med protein markører.
2. afvoksning Paraffin vævssnit < / P>
- I et kørende klasse II sikkerhedsskab, vaske paraffin indlejrede vævssnit i en Coplin krukke fyldt med xylen, 2 gange i 10 min hver ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge frisk xylen som ufuldstændig paraffin fjernelse kan føre til manglende farvede mønstre. - Efter de-voksning, hurtigt rehydrere vævssnit ved vask efter hinanden i 95, 75, og 50% ethanol i 10 min hver ved stuetemperatur.
3. Fiksering og Permeabilisering af cryo og Mikrotom Sektioner
- Fastgør rehydrerede vævssnit ved at placere dem i enten iskold 4% PFA eller 4% FA i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern overskydende fiksativ ved vask sektionerne i PBS (phosphatpuffersaltopløsning) i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Permeabilisere vævssnit ved anbringelse i en Coplin krukke fyldt med PBX (0,5% Triton X-100 i PBS) i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern overskydende PBX ved vask sektionerne kort i PBT (0,01% Tween 20 i PBS).
- Placer permeabiliserede-sektioner i 2 N HCI i 60 minutter ved stuetemperatur i depurinering af DNA'et.
BEMÆRK: Selvom højere koncentrationer af HCI (f.eks 4 N) føre til en mere effektiv DNA denaturering, de ikke er kompatible til co-detektion af oxi-MCs med DAPI. - Placer de afsnit på 10 mM Tris-HCI (pH 8,5) i 30 minutter ved stuetemperatur for at neutralisere HCI. Alternativt vaskes sektionerne tre gange i 5 min hver i PBS. Inkuber de afsnit på PBT i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt væsken fra området omkring vævssnittet uden at lade vævssnit tørre helt på ethvert trin ved forsigtigt at ryste objektglasset. Brug en hydrofob barriere pen at omringe sektionen uden at røre sektion.
BEMÆRK: Den hydrofobe barriere pen reducerer mængden af antistof, der kræves til at farve vævet og kan tillade flere sektioner skal farves med different antistoffer på samme glas. - Inkuber sektioner i 100 pi blokeringsopløsning (10% bovint serumalbumin i PBS) i 1 time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer.
BEMÆRK: Springer dette skridt ville ikke påvirke effektiviteten af farvning af modificerede cytosin baser. - Inkubér vævssnit i 100 pi af en 1: 5000 fortynding af monoklonalt muse-anti-5hmC og 1: 1.000 fortynding af kanin-polyklonalt anti-5caC primære antistoffer i blokeringsopløsning i 1 time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Alternativt udføre inkubationen natten over ved 4 ° C, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Sektioner behandlet uden primære antistoffer kan tjene som egnede negative kontroller til farvning procedure. De 12,5 dage efter coitum murine embryonale hjernesnit beriget med 5caC, 5FC og 5hmC 20 kan anvendes som positiv kontrol. - Fjern overskydende antistoffer ved at vaske sektionerne i en Coplin krukke fyldt med PBT tre gange i 5 min hver i en Coplin krukke ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Øge mængden af vaske-løsninger kan reducere baggrunden farvning. - Fjern overskydende PBT og om nødvendigt, omringe sektionerne igen med den hydrofobe barriere pen som PBT indeholder detergent, der kan svække den hydrofobe barriere.
- Lav en 1: 400 fortynding af gede-anti-kanin-HRP-konjugeret antistof og en 1: 400 fortynding af æsel-anti-muse 555-konjugeret antistof i blokeringsopløsning.
- Inkubér vævssnit i 100 pi sekundært antistof blandingen fra trin 4.9 i 1 time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer.
- Vask vævssnit i en Coplin krukke fyldt med PBT tre gange i 5 min hver ved stuetemperatur.
- Placer vævssnit i 100 pi af en 1: 200 fortynding af tyramid i tyramid signalforstaerkning puffer i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Straks, fjerne overskydende tyramid opløsning ved vask af objektglassene tre gange i 5 min hver i PBT.
- carefully fjerne overskydende PBT og dækkes omgående sektionerne med en dråbe af en Mounting Medium (se Materialer List).
- Anbring forsigtigt et dækglas på vævssnit og straks forsegle dækglasset med neglelak.
- Opbevar vævssnit ved 4 ° C i flere timer, før mikroskopisk undersøgelse. Undersøg under et fluorescerende mikroskop ved 405, 488 og / eller 555 nm (10 - 40X forstørrelse).
Representative Results
For at bestemme fordelingen af 5hmC i hjernen vævssnit, udførte vi co-detektion af denne epigenetiske modifikation med en markør for post-mitotiske neuroner, NeuN, der anvender kommercielt anti-5hmC antistof, som specifikt interagerer med dette varemærke, men ikke med andre former for modificeret cytosin 20, 25. Immunhistokemisk analyse af 5hmC og 5caC distributioner i den voksne hjerne viste, at mens den fremtrædende 5hmC farvning co-lokaliseres med Neun positive celler, NeuN-negative gliaceller besidder lavere niveauer af genomisk 5hmC (figur 1) 20.
Vi har for nylig viste, at Tet-afhængige 5mC oxidation er operativ i løbet af afstamning specifikation af neurale stamceller (NSC) 20. Trods immunokemisk målbart i NSC, 5FC og 5caC udviser fremtrædende immunfarvning på tidlige stadier af NSC'er differentiering i retning af neuronal en nd gliale slægter. Begge disse mærker forbigående ophobes i takt med fremkomsten af de markører for tidlig neuronal og glia differentiering 20. For at bestemme fordelingen af 5caC i differentierende NSC vi udførte co-farvning af dette mærke med en glial markør GFAP på de faste kulturer af NSC på 3 dages induktion af glia differentiering. I modsætning til i NSC'er eller modne astrocytter (data ikke vist), observerede vi en stærk 5caC signal i forholdsvis stor del af de celler, der udtrykker GFAP i disse kulturer (figur 2) 20.
Figur 1. Co-immunfarvning af 5hmC (grøn) med NeuN (rød) i den voksne hjerne Tissue modfarvet med DAPI (blå). Enkelte kanaler og det fusionerede visning vises. Scale barer er 25 um.blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Co-immunfarvning af 5caC med GFAP i Kultur af NSC på dag 3 i Glial Differentiering. Individuelle kanaler og det fusionerede visning vises. Scale barer er 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Selv den rapporterede lave overflod af 5mC oxidation derivater, 5FC og 5caC i nogle væv vil præsentere betydelige begrænsninger for en standard immunkemi-protokol, inkorporeringen af peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer tillod detektion af disse cytosin ændringer i faste væv og celler (figur 2) . Imidlertid bør det optimale inkuberingstid med tyramid opløsning optimeres eksperimentelt for hvert enkelt parti af tyramid signal amplifikationskittet hvor et lineært forhold mellem signal intensiteten og varigheden af tyramid baseret signalforstærkning observeres, for detaljer se Almeida et al. 2012 26 . Desuden kan signalet / baggrund-forholdet øges betydeligt ved at de vaske i en Coplin-skål for at tillade effektiv fjernelse af overskydende antistoffer. Efter inkubering med tyramid løsning, er det vigtigt at straks afbryde reaktionen ved vask i PBT løsning på decrease baggrundsfarvning. Det er afgørende ikke at tillade afsnittene tørre på noget tidspunkt under proceduren.
Effektiviteten af DNA-depurinering kan forbedres ved at udføre depurinering reaktionen ved 37 ° C. Mens anvendelse af 4 N HCI i stedet for 2 N forbedrer farvningen af de modificerede former af 5mC anvendelse af 4 N HCI i DNA depurinering ville ikke tillade co-farvning med DAPI, da den udelukkende interagerer med dobbeltstrenget DNA.
Selv om denne teknik kan tilvejebringe robust semi-kvantitativ vurdering af de modificerede former af cytosinbaser hvor detekterbar, kan det ikke anvendes til evaluering af absolutte niveauer af 5mC eller dets oxidation derivater. Derfor anbefaler vi at bruge andre komplementære, men kvantitative metoder 16, 19 -24. Siden opdagelsen af 5mC oxidation derivater i mammale genomer, er der udviklet flere metoder til at studere deres biologiske roller 16, 19-24. Selv om disse approaChes kan være værdifulde i fastlæggelse af de absolutte niveauer af 5mC oxidation derivater, de ikke give oplysninger om deres rumlige fordeling 20, 26. Vi har med succes brugt den her beskrevne fremgangsmåde til at kortlægge den rumlige fordeling og lokalisering af 5mC oxidation derivater i forskellige celletyper af udviklingslandene og voksne hjerne 20
Ved at afsløre deres rumlige fordeling 20, kan denne teknik være afgørende for at forstå de biologiske virkninger og skæbne oxiderede derivater af 5mC i forskellige biologiske sammenhænge, hvor der kan påvises disse modificerede derivater af 5mC herunder celledifferentiering, udvikling og sygdom. Derudover kan fremgangsmåden beskrives her giver semi-kvantitative vurderinger af de oxiderede derivater af 5mC i forskellige væv ved at vurdere kinetikken for peroxidase reaktion (som er proportional med farvningsintensitet) ved forskellige inkubationstider med tyramide 26.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50% in PBS |
| 0.01% Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | pH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22 x 32 mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
- Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
- Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
- Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
- Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
- Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
- Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
- Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
- Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
- Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
- Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).
- Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
- Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).
