Introduction
Метилирование цитозина в ДНК (5mC) представляет собой крупный эпигенетическую знак найденный в геномах позвоночных животных , связанных с транскрипционных глушителей 1. 5mC внедряется и поддерживается метилтрансферазам ДНК 2-5, и было показано , играют важную роль в ряде биологических процессов , в том числе геномного импринтинга, инактивации Х-хромосомы, клеточной дифференцировки и развития 3, 6. Следовательно, разрушение 5Mc геномные паттерны ассоциируется с целым рядом заболеваний , 7, 8-11. Несмотря на прогресс в понимании 5mC роль в развитии и болезни, она до сих пор остаются в значительной степени неизвестно, каким образом эта метка удаляется в разработке и тканях взрослого организма. Несколько потенциальных механизмов деметилирования ДНК недавно были предложены включая активные и пассивные механизмы деметилирования 12, 13, 14, 15. Обнаружение продуктов последовательного окисления 5mC , опосредованных десяти одиннадцать транслокации ЭнзимES (tet1 / 2/3) , такие , как 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) и 5-carboxylcytosine (5caC) в эукариотических ДНК 16, 17, 18, 19 предложено домыслы могут ли они быть использованы в качестве промежуточных продуктов процессы деметилирования ДНК или действуют как стабильные эпигенетические маркеры в их собственном праве 13. В то время как демонстрация того, что компонент базовой эксцизионной репарации, тимин-ДНК гликозилаза (TDG) могут связывать и удалять как 5FC и 5caC из ДНК 19, 20 указывают на роль модифицированных производных 5mC в качестве активного деметилирования ДНК. Последние данные показывают , что 5FC / 5caC может модулировать скорость точек процессивности РНК II с потенциальным вовлечением этих марок в регуляции транскрипции 29. Из - за этой потенциальной биологической важности окисленных форм 5mC, ряд биохимических и антител на основе методов были использованы для изучения их геномного распределения и глобального содержания 16, 19-24.
Учитывая, что большинство тон позвоночным органы состоят из различных типов клеток , и что распределение модифицированных оснований цитозина тканей и клеток типа конкретных 16-18, 20, 23, 25-27, определяют пространственное распределение окисленных производных 5Mc в различных тканях становится важным экспериментальным задачу, необходимую для открытия их биологические функции. Большинство биохимических и антител на основе подходов не обеспечивают какой-либо пространственной информации о распределении модифицированных форм 5Mc в различных тканей и типов клеток. В отличие от этого , иммунохимии на основе методики могут обеспечить быстрый инструмент для оценки пространственного распределения и ядерной локализации 5Mc 28 и его окисленных производных 20. Об этом сказано, сообщили очень низкое обилие 5FC (20 в каждые 10 6 цитозин) и 5caC (3 в каждые 10 6 цитозина) в геноме мыши 18 представляет собой серьезную проблему для стандартного иммунохимии.
Вот,мы опишем высокочувствительный иммунохимического метод, который обеспечивает надежную и быстрое обнаружение окисленной формы цитозина в ткани головного мозга млекопитающих. Включив, конъюгированных с пероксидазой вторичных антител в сочетании со стадией амплификации сигнала, этот метод обходит проблемы обнаружения очень малых количеств 5FC и 5caC. Кроме того, этот метод может быть использован для совместного выявления модифицированные формы цитозина с линиеспецифический маркеров, эффективно дополняя другие подходы в выяснении биологические функции этих эпигенетических.
Protocol
Все процедуры на животных-участие были проведены в соответствии с университетом Ноттингема этической комиссии по рассмотрению.
1. Выбор соответствующей подготовки ткани для Иммуноокрашивание
- Генерировать залитых парафином участок дикого типа эмбрионов мыши CD1 и тканей мозга взрослого человека , как описано выше 25. Использование срезов ткани мозга фиксировали либо 4% формальдегида (FA) или 4% параформальдегида (PFA) для метода 25 иммунным.
Примечание: Использование парафином срезов тканей требует от депиляции до маркировки антител. Поскольку лечение с 2 - 4 М соляной кислоты (HCl), используемого в протоколе для денатурации ДНК не совместим с большинством стратегий извлечения антигена, мы рекомендуем использовать либо крио или микротомных секций для совместного обнаружения производных окисления 5mC с белком маркеры.
2. депарафинизации парафином ткани Разделы < / Р>
- В кабинете безопасности работает класс II, промойте парафином ткани в Коплин банку, заполненную ксилол, 2 раза в течение 10 мин каждый раз при комнатной температуре.
Примечание: Важно использовать свежий ксилол , как неполное удаление парафина может привести к несогласованности моделей окрашивания. - После того, как де депиляции, быстро регидратации срезах тканей путем промывки последовательно в 95, 75 и 50% этанола в течение 10 мин каждый при комнатной температуре.
3. Закрепление и пермеабилизирующего из крио и микротомных секций
- Закрепить регидрировали срезы ткани, помещая их в любой ледяной 4% PFA или 4% ФА в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Удалите излишки закрепитель промывкой секций в PBS (фосфатный буферный солевой раствор) в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Проницаемыми срезах тканей путем размещения в Коплин банку, заполненную АТС (0,5% Тритон Х-100 в PBS) в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалите излишки АТС путем промывки секций в ближайшее время в PBT (0,01% твин 20 в PBS).
- Поместите проницаемыми сечения в 2 н HCl в течение 60 мин при комнатной температуре депуринизации ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на более высокие концентрации HCl (например, 4 N) приводят к более эффективному денатурации ДНК, они не совместимы для совместного обнаружения OXI-MCS с DAPI. - Поместите секции в 10 мМ Трис-HCl (рН 8,5) в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы нейтрализовать HCl. В качестве альтернативы, мыть секций в три раза в течение 5 минут каждый в PBS. Инкубируйте разделы в PBT в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Осторожно удалите жидкость из области, окружающей участок ткани, не давая срезы ткани полностью высохнуть на любой стадии, осторожно встряхивая слайд. Используйте гидрофобный барьер пера облегать секцию, не касаясь раздела.
Примечание: гидрофобный барьер пера уменьшает объем антитела , необходимое для окрашивания ткани и может позволить несколько разделов , чтобы быть окрашены с дифферет антитела на одном слайде. - Инкубировать срезы в 100 мкл блокирующего раствора (10% бычьего сывороточного альбумина в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере.
Примечание: Пропуск этот шаг не будет влиять на эффективность окрашивания модифицированных оснований цитозина. - Инкубируйте срезов ткани в 100 мкл 1: 5000 разбавлении мышиных моноклональных анти-5hmC и 1: 1000 разведение кроличьи поликлональные анти-5caC первичными антителами в блокирующем растворе в течение 1 часа при комнатной температуре во влажной камере. В качестве альтернативы, выполнять инкубацию в течение ночи при 4 ° С, если это необходимо.
Примечание: Секции обработанные без первичных антител могут служить в качестве отрицательного контроля , подходящие для процедуры окрашивания. 12.5 дней после коитуса мышиные эмбриональные срезы головного мозга , обогащенные 5caC, 5FC и 5hmC 20 может быть использован в качестве положительного контроля. - Удалить избыток антител путем промывки секций в Коплин банку, заполненную PBT три раза в течение 5 мин каждый в Copлин банку при комнатной температуре.
Примечание: Увеличение объема моющих растворов может уменьшить фоновое окрашивание. - Удалите излишки PBT и, при необходимости, облегать секции снова с гидрофобным барьерной пера в качестве ПБТ содержат моющее средство, которое может ослабить гидрофобный барьер.
- Делают разведение 1: 400 козьего анти-кроличьего HRP-конъюгированные антитела и 1: 400 разбавление осла против мышиного 555-конъюгированных антител в блокирующем растворе.
- Инкубируйте срезов ткани в 100 мкл смеси вторичного антитела с шага 4,9 в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере.
- Промыть срезы ткани в Коплин банку, заполненную РВТ три раза в течение 5 минут каждый при комнатной температуре.
- Поместите срезы ткани в 100 мкл 1: 200 разбавлении tyramide в буфере усиления сигнала tyramide в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Немедленно удалите излишки раствора tyramide путем промывки слайды три раза в течение 5 минут каждый в PBT.
- Carefullу удалить избыток PBT и сразу же покрывают участки с каплей монтажным среды (см список материалов).
- Аккуратно поместите покровное на срезах ткани и немедленно запечатать покровное с лаком для ногтей.
- Хранить срезах тканей при 4 ° С в течение нескольких часов до микроскопического исследования. Осмотрите под флуоресцентным микроскопом при 405, 488 и / или 555 нм (10 - 40-кратном увеличении).
Representative Results
Для того, чтобы определить распределение 5hmC в срезах ткани головного мозга, мы провели совместное обнаружение этой эпигенетической модификации с маркером для постмитотических нейронов, NeuN, используя коммерческий анти-5hmC антитело, которое специфически взаимодействует с этим знаком, но не с другими формами модифицированного цитозин 20, 25. иммуногистохимический анализ распределений 5hmC и 5caC во взрослом мозге показало , что в то время как известный 5hmC окрашивание совместно локализуется с Neun позитивными клетками, NeuN-отрицательные глиальные клетки обладают более низкие уровни геномной 5hmC (рис 1) 20.
Недавно мы показали , что Tet-зависимого окисления 5mC действует в течение клонального спецификации нейрональных стволовых клеток (NSC , ) 20. Несмотря на то что иммунохимически незаметного в NSCs, 5FC и 5caC проявляют заметную иммунное окрашивание на ранних стадиях дифференцировки NSC, по отношению к нейрональной а й глиальные линий. Обе эти марки скоротечно накапливаются одновременно с появлением маркеров ранних нейронов и глии дифференциации 20. Для того, чтобы определить распределение 5caC в дифференциации NSCs мы провели совместное окрашивание этой марки с глиальных маркера GFAP на фиксированных культурах NSCs на 3 дня индукции глиальной дифференцировки. В отличие от NSC , или зрелых астроцитов (данные не показаны), мы наблюдали сильный сигнал 5caC в относительно большом количестве клеток , экспрессирующих GFAP в этих культурах (рисунок 2) 20.
Рисунок 1. Со-иммунное 5hmC (зеленый) с NeuN (красный) в ткани мозга взрослого человека контрастно с DAPI (синий). Отдельные каналы и объединенном зрения показаны. Шкала баров 25 мкм.пустым "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Со-иммунное 5caC с GFAP в культуре НСК на 3 -й день глиальных дифференциацию. Отдельные каналы и слитый вид показаны. Шкала баров 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Хотя сообщалось низкое содержание производных окисления 5Mc, 5FC и 5caC в некоторых тканях представит существенные ограничения для стандартного протокола иммунохимии, включение пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами позволяет детектировать эти модификации цитозина в фиксированных тканей и клеток (рисунок 2) , Тем не менее, оптимальное время инкубации с раствором tyramide должны быть экспериментально оптимизированы для каждой отдельной партии tyramide комплекта усиления сигнала , где наблюдается линейная зависимость между интенсивностью сигнала и длительности на основе усиления сигнала tyramide, для получения подробной информации см Алмейда и др. 2012 26 , Кроме того, отношение сигнал / фон может быть значительно повышена путем проведения промывок в банку Коплин, чтобы обеспечить эффективное удаление избытка антител. После инкубации с раствором tyramide, важно немедленно прекратить реакцию путем промывки в растворе PBT к гecrease фоновое окрашивание. Крайне важно не допустить, чтобы секции сохнуть в любой момент во время процедуры.
Эффективность депуринизации ДНК может быть улучшена путем проведения реакции депуринизации при 37 ° С. В то время как с помощью 4 N HCl вместо 2 N увеличивает окрашивание модифицированных форм 5Mc с использованием 4 N HCl в течение депуринизации ДНК не позволило бы совместным окрашиванием DAPI, как он взаимодействует исключительно с двухцепочечной ДНК.
Хотя этот метод может обеспечить надежную полуколичественный оценку модифицированных форм цитозина где обнаруживается, оно не может быть использовано для оценки абсолютных уровней 5Mc или его производных окисления. Поэтому мы рекомендуем использовать взаимодополняющие , но количественные подходы 16, 19 -24. С момента открытия производных окисления 5mC в геномах млекопитающих, несколько подходов были разработаны с целью изучить их биологические роли 16, 19-24. Хотя эти approaчес может быть ценным при определении абсолютных уровней производных окисления 5mC, они не предоставляют информацию относительно их пространственного распределения 20, 26. Мы успешно использовали метод , описанный здесь , чтобы отобразить пространственное распределение и локализацию производных окисления 5mC в различных типах клеток Проявочной и взрослого мозга 20
Раскрывая их пространственное распределение 20, этот метод может иметь решающее значение для понимания биологических последствий и судьбы окисленных производных 5mC в различных биологических контекстах , где эти модифицированные производные 5mC могут быть обнаружены в том числе клеточной дифференцировки, развития и болезни. Кроме того, метод, который мы описываем здесь могут дать полу-количественные оценки окисленных производных 5Mc в различных тканях путем оценки кинетики пероксидазной реакции (которая пропорциональна интенсивности окрашивания) в разное время инкубации с tyramiде - 26.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50% in PBS |
| 0.01% Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | pH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22 x 32 mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
- Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
- Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
- Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
- Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
- Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
- Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
- Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
- Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
- Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
- Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).
- Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
- Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).
