Introduction
Metylering av cytosin baser i DNA (5mC) utgör en stor epigenetisk märke finns i ryggradsdjur genom i samband med transkriptions tysta en. 5mC införs och underhålls av DNA-metyltransferaser 2-5, och har visat sig spela en viktig roll i ett antal biologiska processer, inklusive genetisk prägling, X-kromosominaktivering, celldifferentiering, och utveckling 3, 6. Följaktligen avbrott i 5mC iska mönster är associerad med ett antal sjukdomar 7, 8-11. Trots de framsteg i förståelsen 5mC roll i utveckling och sjukdom, är det fortfarande till stor del okänt hur detta märke tas bort för att utveckla och vuxna vävnader. Flera potentiella mekanismer för DNA-demetylering har nyligen föreslagit att aktiva och passiva demetylering mekanismer 12, 13, 14, 15. Upptäckten av produkterna från 5mC sekventiell oxidation förmedlade av 1011 sloka enzymes (tet1 / 2/3), såsom 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), och 5-carboxylcytosine (5caC) i eukaryot DNA 16, 17, 18, 19 uppmanas spekulationer om de kan tjäna som mellanprodukter med DNA-demetylering processer eller fungera som stabila epigenetiska märken i sin egen rätt 13. Medan demonstrationen att den del av basen excision reparation kan tymin-DNA-glykosylas (TDG) binda och avlägsna både 5FC och 5caC från DNA 19, antyder 20 en roll för de modifierade 5mC derivat i en aktiv DNA demetylering. Senaste bevis som visar att 5FC / 5caC kan modulera graden av RNA II processivitet pekar på potentiell inblandning av dessa märken i transkriptionsreglering 29. På grund av denna potential biologiska betydelsen av oxiderade former av 5mC har en rad biokemiska och antikroppsbaserade tekniker använts för att studera deras genomisk distribution och globalt innehåll 16, 19-24.
Med tanke på att de flesta av than ryggradsdjur organ består av olika celltyper och att fördelningen av modifierade cytosin baser är vävnad och celltyp specifik 16-18, 20, 23, 25-27, bestämma den geografiska fördelningen av oxiderade 5mC derivat i olika vävnader blir en viktig experimentell uppgiften är nödvändig för att avslöja sina biologiska funktioner. De flesta av de biokemiska och antikroppsbaserade metoder ger inte någon spatial information beträffande fördelningen av de modifierade formerna av 5mC i olika vävnader och celltyper. Däremot kan immunbaserade tekniker ger en snabb verktyg för att bedöma den rumsliga fördelningen och nukleär lokalisering av 5mC 28 och dess oxiderade derivat 20. Som sagt, rapporterade mycket låg förekomst av 5FC (20 i varje 10 6 cytosin) och 5caC (3 i varje 10 6 cytosin) i musgenomet 18 utgör en betydande utmaning för standardimmun.
Här,beskriver vi en mycket känslig immunokemisk metod som ger robust och en snabb upptäckt av oxiderad form av cytosin i däggdjurshjärnvävnad. Genom att införliva peroxidaskonjugerade sekundära antikroppar kopplade med en signal amplifieringssteg, kringgår de utmaningar som att detektera mycket små mängder av 5FC och 5caC denna metod. Dessutom kan denna teknik användas för att samtidigt detektera modifierade former av cytosin med härstamning specifika markörer, effektivt komplement till andra metoder i att belysa de biologiska funktionerna hos dessa epigenetiska märken.
Protocol
Alla förfaranden djur inblandade utfördes i enlighet med University of Nottingham etikprövningsnämnd.
1. Val av lämplig vävnad Förberedelse för immunfärgning
- Generera paraffininbäddade sektionen av vild typ CD1 musembryon och vuxna hjärnvävnader som beskrivits tidigare 25. Använd hjärnan vävnadssnitt fixerade med antingen 4% formaldehyd (FA) eller 4% paraformaldehyd (PFA) för immunfärgning metod 25.
OBS: Användning av paraffininbäddade vävnadssnitt kräver de-vaxning innan antikroppsmärkning. Eftersom behandlingen med 2-4 M saltsyra (HCI) som används i protokollet för DNA denaturering inte är kompatibel med de flesta antigenåtervinning strategier, rekommenderar vi användning av antingen cryo- eller mikrotomen sektioner för samtidig detektion av 5mC oxidation derivat med protein markörer.
2. avvaxning Paraffin inbäddade vävnadssnitt < / P>
- I en löpande klass II säkerhetsskåpet, tvätta paraffininbäddade vävnadssnitt i ett Coplin-kärl fyllt med xylen, 2 gånger under 10 min vardera vid RT.
OBS: Det är viktigt att använda färsk xylen som ofullständig paraffin borttagning kan leda till inkonsekventa färgningsmönster. - Efter de-vaxning, snabbt rehydrera sektionerna vävnads genom tvättning efter varandra i 95, 75, och 50% etanol i 10 min vardera vid RT.
3. Fixering och Permeabilization av Cryo- och mikrotom avsnitten
- Fäst rehydrerade vävnadssnitt genom att placera dem i antingen iskall 4% PFA eller 4% FA under 15 minuter vid rumstemperatur.
- Avlägsna överskott av fixativ genom tvättning sektionerna i PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning) under 5 min vid RT.
- Permeabilisera vävnadssnitt genom att placera i ett Coplin-kärl fyllt med PBX (0,5% Triton X-100 i PBS) under 30 min vid RT. Ta bort överflödig PBX genom att tvätta sektionerna kort i PBT (0,01% Tween 20 i PBS).
- Placera de permeabiliserade snitten i 2 N HCl under 60 min vid RT för depurinering av DNA.
OBS: Även om högre koncentrationer av HCI (t ex 4 N) leder till en mer effektiv DNA denaturering, är de inte kompatibla för samtidig detektion av oxi-MCS med DAPI. - Placera sektionerna i 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) under 30 min vid RT för att neutralisera HCl. Alternativt, tvätta avsnitt tre gånger under 5 minuter vardera i PBS. Inkubera avsnitt i PBT under 5 min vid RT.
- Försiktigt bort vätskan från området som omger vävnadssnittet utan att låta vävnadssnittet torka helt vid varje steg genom att försiktigt skaka sliden. Använda en hydrofob barriär penna för att omsluta sektionen utan att röra sektion.
OBS: Den hydrofoba barriär penna minskar volymen av antikropp som krävs för att färga vävnaden och kan tillåta flera sektioner färgas med different-antikroppar på samma bild. - Inkubera sektioner i 100 pl blockeringslösning (10% bovint serumalbumin i PBS) under 1 h vid RT i en fuktig kammare.
OBS: Hoppa över detta steg skulle inte påverka effektiviteten i färgning av de modifierade cytosinbaser. - Inkubera vävnadssnitt i 100 pl av en 1: 5000-spädning av mus-monoklonal anti-5hmC och en 1: 1000-spädning av kanin-polyklonal anti-5caC primära antikroppar i blockerande lösningen under 1 h vid RT i en fuktig kammare. Alternativt utför inkubation över natten vid 4 ° C om det behövs.
OBS! Sektioner bearbetats utan primära antikroppar kan fungera som lämpliga negativa kontroller för färgningsproceduren. De 12,5 dagar efter coitum murina embryonala hjärnsektioner anrikade på 5caC, 5FC och 5hmC 20 kan användas som positiv kontroll. - Avlägsna överskott av antikroppar genom att tvätta avsnitt i en Coplin burk fylld med PBT tre gånger under 5 minuter vardera i en Coplin burk vid RT.
OBS: Öka volymen av tvättlösningar kan minska bakgrundsfärgning. - Avlägsna överskott av PBT och, om nödvändigt, omsluta sektionerna igen med den hydrofoba barriär pennan som PBT innehåller rengöringsmedel som kan försvaga den hydrofoba barriären.
- Gör en 1: 400 utspädning av get-anti-kanin-HRP-konjugerad antikropp och en 1: 400 utspädning av åsne-anti-mus-555-konjugerad antikropp i blockerande lösningen.
- Inkubera vävnadssnitt i 100 pl av sekundär antikropp blandningen från steg 4,9 under 1 h vid RT i en fuktig kammare.
- Tvätta vävnadssnitt i ett Coplin-kärl fyllt med PBT tre gånger under 5 min vardera vid RT.
- Placera sektionerna vävnads i 100 pl av en 1: 200 utspädning av tyramid i tyramide signalförstärkning buffert under 2 min vid rumstemperatur.
- Omedelbart avlägsna överskott tyramide lösning genom att tvätta bilderna tre gånger i 5 minuter vardera i PBT.
- försiktigy avlägsna överskott PBT och täck omedelbart sektionerna med en droppe av en monteringsmedel (se Materials List).
- Placera försiktigt ett täck på vävnadssnitt och omedelbart försegla täck med nagellack.
- Lagra sektionerna vävnaden vid 4 ° C under flera h före mikroskopisk undersökning. Undersök under ett fluorescerande mikroskop vid 405, 488 och / eller 555 nm (10 - 40X förstoring).
Representative Results
För att bestämma fördelningen av 5hmC i hjärnvävnadssnitt, utförde vi co-detektion av denna epigenetiska modifiering med en markör för post-mitotiska neuroner, Neun, utnyttjar kommersiella anti-5hmC antikropp som specifikt interagerar med detta märke, men inte med andra former av modifierad cytosin 20, 25. Immunohistokemisk analys av 5hmC och 5caC fördelningar i den vuxna hjärnan avslöjade att medan de framträdande 5hmC färgning co-lokaliserar med NeuN positiva celler, NeuN negativa gliaceller besitter lägre nivåer av genomisk 5hmC (figur 1) 20.
Vi visade nyligen att Tet-beroende 5mC oxidation är operativ under härstamning specifikation av neurala stamceller (NSCs) 20. Trots att immun odetekterbara i NSCs, 5FC och 5caC uppvisar framträdande immunfärgning vid tidiga stadier av NSCs differentiering mot neuronal en nd gliaceller linjer. Båda dessa märken transient ackumuleras samtidigt med utseendet på markörer för tidig neuronal och glial differentiering 20. För att bestämma fördelningen av 5caC differentiera NSCs vi utfört tillsammans färgning av detta märke med en gliaceller markör GFAP på de fasta kulturer av NSCs vid 3 dagars induktion av stödjeceller differentiering. Till skillnad från i NSCs eller mogna astrocyter (data ej visade), observerade vi stark 5caC signal i relativt stor andel av de celler som uttrycker GFAP i dessa kulturer (Figur 2) 20.
Figur 1. Samtidig immunfärgning av 5hmC (grön) med Neun (röd) i den vuxna hjärnan Tissue motfärgades med DAPI (blå). Individuella kanaler och den sammanslagna vyn visas. Skala barer är 25 pm.blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Samtidig immunfärgning av 5caC med GFAP i kultur NSC vid dag 3 av stödjeceller differentiering. Individuella kanaler och den sammanslagna vyn visas. Skala barer är 20 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Även om den rapporterade låg förekomst av 5mC oxidation derivat, 5FC och 5caC i vissa vävnader skulle innebära betydande begränsningar för en standardimmunprotokoll, införlivandet av peroxidaskonjugerade sekundära antikroppar tillät detektering av dessa cytosin ändringar i fasta vävnader och celler (Figur 2) . Dock bör den optimala inkubationstiden med tyramide lösning optimeras experimentellt för varje enskilt parti tyramide signalförstärkning kit där ett linjärt samband mellan signalstyrka och varaktighet tyramide baserad signalförstärkning observeras, för mer information se Almeida et al. 2012 26 . Dessutom kan signal / bakgrundsförhållandet förbättras avsevärt genom att utföra de tvättar i ett Coplin-kärl för att medge effektivt avlägsnande av överskott av antikroppar. Efter inkubation med tyramide lösning, är det viktigt att omedelbart stoppa reaktionen genom att tvätta i PBT lösning decrease bakgrundsfärgning. Det är kritiskt att inte tillåta sektionerna torka vid vilken punkt som helst under förfarandet.
Effektiviteten av DNA depurinering kan förbättras genom att utföra depurinering reaktionen vid 37 ° C. Medan användning av 4 N HCl i stället för 2 N förbättrar färgningen av de modifierade formerna av 5mC använder 4 N HCl för DNA depurinering skulle inte tillåta samtidig färgning med DAPI, eftersom det interagerar endast med dubbelsträngat DNA.
Även om denna teknik kan ge robust semi-kvantitativ bedömning av modifierade former av cytosin baser där detekterbara, kan det inte användas för att utvärdera de absoluta nivåerna av 5mC eller dess oxidation derivat. Därför rekommenderar vi att använda andra kompletterande men kvantitativt närmar 16, 19 -24. Sedan upptäckten av 5mC oxidation derivat i däggdjursgenom, har flera metoder utvecklats för att studera deras biologiska roller 16, 19-24. Även om dessa approaches kan vara värdefull för att bestämma de absoluta nivåerna av 5mC oxidation derivat, de inte lämna information om deras rumsliga fördelning 20, 26. Vi har framgångsrikt använt den metod som beskrivs här för att kartlägga den geografiska fördelningen och lokaliseringen av 5mC oxidation derivat i olika celltyper av att utveckla och vuxna hjärnan 20
Genom att avslöja deras rumsliga fördelning 20, kan denna teknik vara avgörande för att förstå de biologiska effekterna och ödet av oxiderade derivat av 5mC i olika biologiska sammanhang där dessa modifierade derivat av 5mC kan detekteras inbegripet celldifferentiering, utveckling och sjukdom. Dessutom kan den metod som vi beskriver här ge halv kvantitativa bedömningar av de oxiderade derivaten av 5mC i olika vävnader genom att bedöma kinetiken av peroxidasreaktion (som är proportionell mot färgningsintensitet) vid olika inkubationstider med tyramide 26.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20 °C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50% in PBS |
| 0.01% Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | pH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22 x 32 mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
References
- Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16, 6-21 (2002).
- Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, 1089-1093 (2001).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet. 33, 245-254 (2003).
- Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
- Okano, M., et al. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
- Cedar, H., Bergman, Y. Programming of DNA methylation patterns. Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Chouliaras, L., et al. Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).
- Jowaed, A., et al. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).
- Reik, W., et al. Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95. J Med Genet. 30, 185-188 (1993).
- Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).
- Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).
- Oswald, J., et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).
- Ooi, S. K., Bestor, T. H. The colorful history of active DNA demethylation. Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, 1300-1303 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
- Wheldon, L. M., et al. Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells. Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, 1368-1380 (2012).
- Lu, X., et al. Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA. J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).
- Globisch, D., et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Szwagierczak, A., et al. Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, e181 (2010).
- Ruzov, A., et al. Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development. Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).
- Almeida, R. D., et al. Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals. Epigenetics. 7, 137-140 (2012).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905 (2013).
- Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. Nuclear reprogramming methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523, 621-625 (2015).
