Summary
药物对肾功能恢复的管理需要本地化和治疗化合物的分布控制。在这里，我们详细描述了大鼠肾内药物递送一个简单的技术。这个过程可以与无死亡率和高再现性容易地进行。
Protocol
实验在雌性SD大鼠进行的，体重250〜300克与指南的关怀和实验动物的使用（实验动物资源研究所，国家科学院，贝塞斯达，MD，USA），并在规定的标准符合所有动物的程序是由医学机构动物护理的梅奥诊所医学院批准与使用委员会（IACUC）。
1.准备
- 术前高压灭菌所有的手术器械。如果在不同的大鼠多次手术的同一天计划，冲洗仪器每只动物手术后，然后消毒用热珠灭菌。
- 麻醉，用4％的异氟醚的大鼠以1升/分钟的 O 2。
- 大鼠转移到控制的加热垫在37℃下以保持体温。保持用1-2％异氟烷麻醉在1升/分钟的 O 2。
- 辖止痛药物（丁丙诺啡缓释0.6毫克/千克）苏bcutaneously。
- 适用软膏的眼睛，以防止在手术过程中干燥。
- 为了补偿体液由于剖腹的损失，它辖10毫升/公斤的0.9％的生理盐水皮下注射的术前是重要的。
- 剃腹部区域和清洁用聚维酮碘和70％乙醇垫皮肤。
2.手术过程
- 确保镇静的深度是通过监测物理反射，如退出脚趾捏，眼睑反射，下颌音，呼吸速率/模式足够。
- 执行通过小中线切口使用外科手术刀刀片10号剖腹手术（2-2.5厘米长度）。
- 通过使用棉签拉肠和结肠的腹部右侧，并与在0.9％生理盐水以维持器官湿润浸透无菌纱布覆盖它们。
- 轻轻向上缩回脾，肝，胃和胰腺揭露AORta和左肾动脉。
- 用外科显微镜的帮助下，小心地分离上述和左肾和从静脉，脂肪左肾动脉并用钝解剖弯钳和无菌棉签周围结缔组织以下腹主动脉。
- 使用带有一个反复开闭动作（钝器解剖）沿所述容器的长度钳子去除结缔组织和棉签与横向滚动运动以除去脂肪。
注：围主动脉区的解剖是一个非常微妙的一步，神经和淋巴管可能被损坏。确保解剖过程中，以保持动脉湿润用生理盐水。
- 使用带有一个反复开闭动作（钝器解剖）沿所述容器的长度钳子去除结缔组织和棉签与横向滚动运动以除去脂肪。
- 将4-0丝线缝合主动脉下方。
- 使用微血管剪辑，夹住主动脉上述（正下方肠系膜动脉）并低于肾动脉分叉处。
- 穿刺主动脉在左侧kidn的水平安永动脉分叉处有一个24克静脉导管，推进导管进入肾动脉。
注：这是因为爆胎的关键一步，通过肾动脉可能发生。 - 连接填充有药物溶液或盐水（达500微升）注射器到导管和灌注肾脏。
- 灌注之后立即用镊子左肾静脉和左侧输尿管与微血管剪辑并移除导管。然后将一块可吸收止血剂明胶海绵，与组织粘合剂的一小滴，过主动脉的穿刺区域，并轻轻施加压力用棉签。
- 在同一时间，从腹主动脉松开夹具，左肾动脉分叉下方。 5分钟后，释放来自肾静脉和输尿管钳。
- 小心地从主动脉松开夹具，左肾动脉分叉以上，并允许肾再灌注。总肾缺血应该持续时间不超过7分钟。
- 关闭两层（肌肉和皮肤）的腹部切口，用4-0可吸收缝线和连续模式，以防止感染。除了连续图案缝合技术，另一种选择是使用一个简单的，中断的技术，尤其是对体壁封闭以防止裂开。
- 在切口区域，以防止感染的局部应用抗生素软膏。
- 转移大鼠成无寝具观测笼上的温暖垫直到与设置在35-37℃的温度范围内完全恢复。宽松的床上用品应覆盖（ 如用悬垂或纸巾）或从笼子里删除，直到动物完全恢复，以防止窒息或被褥的愿望。
- 手术后，连续观察动物直至自主呼吸，然后每小时为几个小时。重剂量的镇痛丁丙诺啡SR 72小时以后如果不适的迹象观察，如嗜睡，驼背和邋遢，鬼脸，没有恢复正常活动。
- 所有的研究完成后，安乐死动物二氧化碳过量吸入和收获的肾组织进行体外分析，如组织学和免疫印迹5。
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Representative Results
我们注射两种不同剂量重组大鼠VEGF（rrVEGF，0.17微克/公斤和5微克/ kg）或PBS中。使动物安乐死8小时手术后检查的VEGF途径的活化。与对照相比（ 图1B）时，如图由H＆E染色的外科手术过程没有影响灌注肾脏（ 图1A）的形态。而与对照相比（ 图1D）时天狼红染色没有显示出响应于缺血时间和rrVEGF（ 图1C）的输液中的细胞外基质沉积的任何增加。通过Western印迹分析，我们观察到在参与VEGF途径的蛋白质，如VEGF，FLK1，pAKT蛋白/ AKT，的pERK / ERK（ 图2）的表达的小而显著增加。
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图1：肾组织苏木的组织学染色和曙红的代表图像 （H＆E）肾切片染色显示相比，通过肾内注射假手术组（A）接受VEGF（5微克/千克，B）老鼠没有解剖学上的变化。然而，天狼星红染色显示相比于假手术组（C）接受VEGF（5微克/千克，D）大鼠胶原沉积无显著差异。比例尺为1毫米，放大图像代表400微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：VEGF通路的激活血管内皮生长因子的蛋白质印迹分析，FLK1，phosphoAKT / AKT和phosphoERK / ERK示出了在肾脏VEGF通路的rrVEGF输注后的上调（N = 4）。数据表示为平均值±SEM表示。 * P <0.05与PBS。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Disclosures
这项工作的部分原因是由阿斯利康研究资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
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