Summary
腎機能の回復のための薬剤の投与は、治療化合物の局在化および分布の制御を必要とします。ここでは、具体的にラットにおける薬物の腎内送達のための簡単な方法を説明します。この手順は容易に死亡し、再現性良く行うことができます。
Protocol
実験は250〜300グラムの重量を量る、雌性Sprague-Dawleyラットで実施しました。実験動物の管理と使用に関するガイドに記載された基準に準拠し、すべての動物の手順は、（実験動物資源、全米科学アカデミーの研究所、ベセスダ、MD、USA）とは、医療施設内動物管理のメイヨークリニックの大学によって承認されました使用委員会（IACUC）。
1.準備
- 手術前に、すべての手術器具をオートクレーブ。別のラットに複数の手術を同じ日に予定されている場合は、それぞれの動物の処置後の器具を洗浄した後、ホットビーズ滅菌器を使用して滅菌します。
- 1リットル/分のO 2の4％イソフルランでラットを麻酔。
- 37℃の体温を維持するために制御された加熱パッドにラットを転送します。 1リットル/分のO 2中で1〜2％イソフルランで麻酔を維持します。
- 鎮痛薬（ブプレノルフィンは、リリース0.6ミリグラム/キログラムを持続）suコマンドを管理しますbcutaneously。
- 手順の間に乾燥を防ぐために、目に軟膏を適用します。
- 開腹への体液の損失を補償するために、術前に、0.9％生理食塩水の皮下は10ml / kgで投与することが重要です。
- 腹部を剃るとポビドンヨードおよび70％エタノールパッドと肌をきれいに。
2.外科的手順
- 鎮静の深さは、このようなつま先のピンチ、眼瞼反射、顎のトーン、および呼吸速度/パターンからの撤退などの物理的な反射神経を、監視することで十分であることを確認してください。
- 手術用メスの刃10号を使用して、小さな正中切開（長さ2〜2.5センチメートル）を介して開腹を行います。
- 綿棒を使って、腹部の右側に腸および結腸を引いて、湿った臓器を維持するために、0.9％の生理食塩水にに浸した滅菌ガーゼでそれらをカバーしています。
- ゆっくりAORを露出するように上向きに脾臓、肝臓、胃や膵臓を撤回TAと左腎動脈。
- 手術用顕微鏡の助けを借りて、慎重に上記と左腎臓や静脈、脂肪から左腎動脈と鈍い解剖湾曲鉗子と滅菌綿棒で周囲の結合組織の下に腹部大動脈を分離します。
- 脂肪を除去するために、横揺れ運動と結合組織と綿棒を除去するために、血管の長さに沿って繰り返し開閉運動（鈍的切開）とピンセットを使用してください。
注：周囲大動脈領域の解剖が破損する可能性があります神経やリンパ管のような非常にデリケートなステップです。解剖の手順の間に生理食塩水で湿った動脈を維持することを確認します。
- 脂肪を除去するために、横揺れ運動と結合組織と綿棒を除去するために、血管の長さに沿って繰り返し開閉運動（鈍的切開）とピンセットを使用してください。
- 大動脈の下に4-0絹縫合糸を配置します。
- 微小血管クリップを使用して、（ちょうど上腸間膜動脈の下）と腎動脈分岐部の下に上記の大動脈をクランプします。
- 左kidnのレベルで大動脈を穿刺24 G静脈内カテーテルとEY動脈分岐部とは、腎動脈にカテーテルを進めます。
注：これが発生する可能性があり、腎動脈を通る穿刺などの重要なステップです。 - カテーテルに（500μLまで）薬物溶液または生理食塩水で満たされた注射器を接続し、腎臓を灌流。
- すぐに灌流した後、微小血管クリップで左腎静脈と左尿管をクランプし、カテーテルを除去します。その後、大動脈のパンクチャー領域にわたって、組織接着剤の小滴で、吸収性止血ゼラチンスポンジのピースを置き、静かに綿棒で圧力をかけます。
- 同時に、左腎動脈分岐部の下に、腹部大動脈からクランプを解放します。 5分後、腎静脈や尿管からのクランプを解除します。
- 慎重に左腎動脈分岐部の上に、大動脈からクランプを解放し、腎臓の再灌流を可能にします。総腎虚血はもはや7分以上持続するべきではありません。
- 感染を防ぐために、4-0吸収性縫合糸と連続パターンを使用して、2層（筋肉や皮膚）で腹部切開を閉じます。連続パターン縫合技術に加えて、別のオプションは、裂開を防止するために、特に、体壁の閉鎖のために、単純な遮断技術を使用することであろう。
- 感染を防ぐために、切開領域にわたって局所抗生物質軟膏を適用します。
- 35-37℃に設定した温度範囲で完全に回復するまで暖かいパッド上の寝具フリー観察ケージにラットを転送します。ルース寝具はカバーされ（ 例えば 、ドレープや紙タオルで）または動物が完全に窒息や布団の誤嚥を防ぐために回収されるまで、ケージから削除する必要があります。
- 手術後、数時間毎時その後、自発的に呼吸するまで継続的に動物を観察します。再用量鎮痛剤ブプレノルフィンSR 72時間後に不快感の兆候は、猫背やだらしない無気力、しかめっ面、通常の活動を再開していないとして、認められた場合。
- すべての研究が完了した後、CO 2の過剰摂取の吸入で動物を安楽死させると、このような組織学およびウエスタンブロッティング5のように分析するex vivoのための腎組織を採取します。
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Representative Results
我々は、組換えラットVEGF（rrVEGF、0.17μgの/キログラムおよび5μg/ kg）またはPBSの二つの異なる投与量を注入しました。動物は、VEGF経路の活性化を調べるために、8時間後に手術を安楽死させました。 H＆E染色によって示されるように、制御（ 図1B）と比較した場合、外科的処置は、灌流腎臓（ 図1A）の形態に影響を及ぼしませんでした。コントロール（ 図1D）と比較した場合、シリウスレッド染色は、虚血性時間とrrVEGF（ 図1C）の注入に応答した細胞外マトリックス沈着の増加を示しませんでした。ウエスタンブロット分析によって、我々はそのようなVEGF、FLK1、のpAkt / AKT、のpERK / ERK（ 図2）として、VEGF経路に関与するタンパク質の発現の小さいが有意な増加を観察しました。
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図1：腎臓切片の腎組織の組織学的染色の代表画像ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色は腎内注射を介して偽動物（A）と比較して、VEGF（5μgの/キロ、B）を受けたラットには解剖学的な変化を示しません。 、シリウスレッド染色は、偽動物（C）と比較して、（5μgの/キロ、D）VEGFを受けたラットにおけるコラーゲン沈着に有意な差を示さないのに対し。スケールバーは1ミリメートルを表し、拡大画像は400ミクロンを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：VEGF経路の活性化 VEGFのウエスタンブロット分析、FLK1、phosphoAK腎臓でrrVEGF注入後VEGF経路の上方制御を示すT / AKTおよびホスホ/ ERKた（n = 4）。データは、平均±SEMとして提示されています。 * p <0.05 の PBS対。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Disclosures
この研究の一部はアストラゼネカからの研究助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
- Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36 (4), 752-758 (2000).
- Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1434-1447 (2001).
- Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1448-1457 (2001).
- Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
- Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302 (10), F1342-F1350 (2012).
- Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5 (5), 720-728 (2012).
- Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106 (9), 1165-1171 (2002).
- Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27 (4), 468-480 (2011).
- Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86 (7), 649-657 (2011).
- Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
- Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281 (5), F948-F957 (2001).
- Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177 (2), 632-643 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122 (3), 462-468 (1986).
