Summary
Введение препаратов для восстановления функции почек требует контроля локализации и распределения терапевтического соединения. Здесь мы опишем подробно простую технику для внутрипочечной доставки лекарственных средств у крыс. Эта процедура может быть легко выполнена без каких-либо смертности и высокой воспроизводимостью.
Protocol
Эксперименты проводились на самках крыс Sprague-Dawley, весом 250-300 г. Все процедуры на животных соответствуют стандартам, изложенным в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных животных ресурсов, Национальной академии наук, Bethesda, MD, США) и были одобрены Mayo Clinic Медицинского колледжа Уходу за животными и использование комитета (IACUC).
1. Подготовка
- Автоклав все хирургические инструменты, перед хирургическим вмешательством. Если несколько операций на различных крыс планируются в тот же день, промойте инструменты после каждой процедуры животного, а затем стерилизовать с помощью горячего шарика стерилизатор.
- Обезболить крыса с 4% изофлуран в 1 л / мин O 2.
- Передача крысе контролируемой грелку, чтобы сохранить температуру тела при 37 ° C. Поддержание анестезии с 1-2% изофлуран в 1 л / мин O 2.
- Администрирование анальгетик (бупренорфин с пролонгированным высвобождением 0,6 мг / кг) суbcutaneously.
- Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание во время процедуры.
- Для того, чтобы компенсировать потерю жидкости в организме из-за лапаротомии, важно вводить 10 мл / кг 0,9% нормального солевого раствора подкожно перед операцией.
- Бритье области живота и очистить кожу с повидон-йода и 70% этанола колодками.
2. Хирургические процедуры
- Убедитесь, что глубина седации адекватна путем мониторинга физических рефлексов, таких, как выход из пальца пинч, пальпебрального рефлекса, челюсть тон, и частота дыхания / схеме.
- Выполните лапаротомии через небольшой разрез (срединный 2-2,5 см в длину) с помощью хирургического скальпеля лезвия № 10.
- Извлеките кишечник и толстый кишечник с правой стороны живота с помощью ватного тампона и накрыть их стерильной марлей, смоченной в 0,9% физиологического раствора, чтобы поддерживать органы во влажном состоянии.
- Аккуратно убирается вверх селезенки, печени, желудка и поджелудочной железы подвергать AORта и левая артерии почки.
- С помощью хирургического микроскопа, тщательно отделить брюшную аорту выше и ниже левой почки и левой почечной артерии из вен, жир и окружающей соединительной ткани с тупыми Препарировальный изогнутый пинцет и стерильным ватным тампоном.
- С помощью пинцета с повторным открываемого-закрываемого движения (отслаивания) вдоль длины сосудов для удаления соединительной ткани и ватные тампоны с движением боковой прокатки, чтобы удалить жир.
ПРИМЕЧАНИЕ: рассечение пери-аортального области является очень деликатным шагом, как нервы и лимфатические сосуды могут быть повреждены. Убедитесь в том, чтобы держать артерии влажным физиологическим раствором во время процедуры вскрытия.
- С помощью пинцета с повторным открываемого-закрываемого движения (отслаивания) вдоль длины сосудов для удаления соединительной ткани и ватные тампоны с движением боковой прокатки, чтобы удалить жир.
- Поместите 4-0 шелковый шов под аортой.
- Используя микрососудистых зажимы, зажим аорту выше (чуть ниже верхней брыжеечной артерии) и ниже раздвоения почечной артерии.
- Прокол аорты на уровне левого kidnEY бифуркация артерии с 24 G внутривенный катетер и продвигать катетер в почечную артерию.
Примечание: это очень важный шаг, как прокол через почечной артерии может произойти. - Подключение шприц, заполненный лекарственным раствором или физиологическим раствором (до 500 мкл) в катетер и перфузии почек.
- Сразу после перфузии, зажать левой почечной вены и левого мочеточника с микрососудистой клипа и удалить катетер. Затем поместите кусок рассасывающиеся кровоостанавливающего желатиновой губки, с небольшим капли клея ткани, над проколотой области аорты и осторожно применять давление с помощью ватного тампона.
- В то же время, освободить зажим из брюшной аорты, ниже развилки левой почечной артерии. Через 5 минут, снимите зажим с почечной вены и мочеточника.
- Осторожно снимите зажим с аорты, над бифуркацией левой почечной артерии, а также позволяют почечной реперфузии. нет Общая почечная ишемия должна длиться не более 7 мин.
- Закройте брюшной разрез в два слоя (мышц и кожи), используя 4-0 рассасывающиеся нити и непрерывный рисунок, чтобы предотвратить инфекцию. В дополнение к непрерывной технике картины шовного, другой вариант должен был бы использовать простой, прерванный метод, особенно для закрытия стенки тела, чтобы предотвратить расхождение краев.
- Применяют мази с антибиотиком по области надреза для предотвращения инфекции.
- Перенесите крысу в постельных свободной клетке наблюдения на теплом площадку до полного выздоровления с диапазоном температур, установленной при 35-37 ° С. Сыпучие постельные принадлежности должны быть покрыты (например , с помощью драпировки или бумажным полотенцем) или удалены из клетки , пока животные не будут полностью восстановлены , чтобы предотвратить удушье или аспирации постельных принадлежностей.
- После операции, не наблюдать за животными непрерывно до тех пор, дышать спонтанно, а затем ежечасно в течение нескольких часов. Повторная доза Обезболивающее Бупренорфин SR 72 чпозже, если признаки дискомфорта наблюдаются, такие как вялость, сгорбленной и неряшливой, гримасы, не возобновлением нормальной деятельности.
- После завершения всех исследований, эвтаназии животных с вдыханием передозировки CO 2 и урожай почечные ткани для ех естественных анализов , таких как гистологии и Вестерн - блоттинга 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы вводили две различные дозы рекомбинантного VEGF у крыс (rrVEGF, 0,17 мкг / кг и 5 мкг / кг) или PBS. Животных умерщвляли 8 ч после операции, чтобы исследовать активации пути VEGF. Хирургическая процедура не влияет на морфологию перфузией почки (рис 1А) по сравнению с контролем (рис 1 , б), как это показано с помощью H & E окрашивания. В то время как Сириус красный окрашивание не показывали какого - либо увеличения внеклеточным отложением матрицы в ответ на ишемическую времени и вливанием rrVEGF (рис 1C) по сравнению с контролем (рис 1D). По вестерн - блот анализа, мы наблюдали небольшое , но значимое увеличение экспрессии белков , вовлеченных в пути VEGF, такие как VEGF, Flk1, PAKT / Akt, Perk / ERK (рисунок 2).
d / 54418 / 54418fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Типичные изображения гистологических Окрашивание ткани почек гематоксилином и эозином (Н & Е) окрашивание срезов почек не показывает никаких анатомических изменений у крыс, получавших VEGF (5 мкг / кг, В) по сравнению с мнимым животных (А) через интраренальной инъекции. Принимая во внимание, Sirius красное окрашивание не показывает никаких существенных различий в отложение коллагена у крыс, получавших VEGF (5 мкг / кг, D) по сравнению с имитацией животных (C). Шкала бар составляет 1 мм и увеличенные изображения представляют 400 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Активация СЭФР Pathway Вестерн - блот - анализ СЭФР, Flk1, phosphoAKТ / Akt и phosphoERK / ЭРК, показывающая повышающую регуляцию VEGF пути после rrVEGF инфузии в почках (п = 4). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. * Р <0,05 по сравнению с PBS. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа выполнена при частичной поддержке исследовательского гранта от Astra Zeneca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Microscope | Leica | M125 | |
| Isoflurane 100 ml | Cardinal Healthcare | PI23238 | Anesthetic |
| Buprenorphine HCL SR LAB 1 mg/ml, 5 ml | ZooPharm Pharmacy | Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hr duration of activity). Liquid is viscous, warming to RT aids in drawing into syringe. Recommended dosage: 1 - 1.2 mg/kg SC. DO NOT DILUTE. | |
| Puralube Vet Ophthalmic Ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | Sterile ocular lubricant |
| Lactated Ringer's Injection, USP, 250 ml VIAFLEX Plastic Container | Baxter Healthcare Corp. | NDC0338-0117-02 | For body fluids replacement |
| Sol Povidone-Iodine Swabstick, 3' | Cardinal Heatlhcare | 23405-010B | |
| Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
| 4-0 silk suture (without needle) | Cardinal Heatlhcare | A183H | |
| Vessel Clip, Straight, 0.75 mm x 4 mm Jaw | World Precision Instruments | 501779-G | |
| I.V. Catheter, Straight Hub, Radiopaque, 24 g x 3/4", FEP Polymer | Jelco | 4053 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010023 | |
| SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge | Cardinal Healthcare | 179082 | |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPER | Ethicon | VCP304H | For muscle layer suturing |
| 4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) UNDYED 18" PC-3 CUTTING | Ethicon | VCP845G | For skin layer suturing |
| Triple antibiotic ointment | Actavis | NDC0472-0179-56 | For topical use on the site of the incision |
| Recombinant Rat VEGF 164 Protein | R&D Sytems | 564-RV | |
| Rabbit monoclonal VEGFA | Abcam | ab46154 | |
| Rabbit monoclonal FLK1 | Cell Signaling | 9698 | |
| Rabbit monoclonal AKT | Cell Signaling | 4691 | |
| Rabbit monoclonal phosphoAKT (Ser 473) | Cell Signaling | 4060 | |
| Rabbit monoclonal p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell Signaling | 4695 | |
| Rabbit monoclonal phospho p44/42 MAPK (Thr202 and Tyr 204) | Cell Signaling | 4370 |
References
- Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36 (4), 752-758 (2000).
- Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1434-1447 (2001).
- Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1448-1457 (2001).
- Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
- Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302 (10), F1342-F1350 (2012).
- Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5 (5), 720-728 (2012).
- Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106 (9), 1165-1171 (2002).
- Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27 (4), 468-480 (2011).
- Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86 (7), 649-657 (2011).
- Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
- Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281 (5), F948-F957 (2001).
- Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177 (2), 632-643 (2010).
- Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122 (3), 462-468 (1986).
