Summary
Nicht gerührt Fällungspolymerisation liefert eine schnelle, reproduzierbare Prototyping Ansatz zur Synthese von Stimuli empfindlichen Poly (N Isopropylacrylamid) Mikrogele mit enger Größenverteilung. In diesem Protokoll Synthese, Charakterisierung Lichtstreuung und Einzelpartikelfluoreszenz-Tracking dieser Mikrogele in einem Weitfeldmikroskopie Einrichtung demonstriert.
Abstract
Stimuli-sensitive Poly (N Isopropylacrylamid) (PNIPAM) Mikrogele haben verschiedene potenzielle praktische Anwendungen und nutzt in der Grundlagenforschung. In dieser Arbeit verwenden wir einzelne Partikel von fluoreszenzmarkierten PNIPAM-Mikrogele als Schaufenster für Tuning Mikrogel Größe durch eine schnelle nicht gerührten Fällungspolymerisation Verfahren zu verfolgen. Dieser Ansatz eignet sich für das Prototyping neuer Reaktionszusammensetzungen und Bedingungen oder für Anwendungen, die keine großen Mengen des Produkts benötigen. Microgel Synthese, Partikelgröße und Strukturbestimmung durch dynamische und statische Lichtstreuung sind im Protokoll aufgeführt. Es wird gezeigt, dass die Zugabe von funktionellen Comonomeren einen großen Einfluß auf die Kornkeimbildung und Struktur haben kann. Einzelpartikel Tracking von Weitfeldfluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine Untersuchung der Diffusion von markiertem Tracer-Mikrogele in einer konzentrierten Matrix von nicht-markiertem Mikrogele, ein System nicht leicht untersucht durchandere Verfahren, wie beispielsweise dynamische Lichtstreuung.
Introduction
Stimuli-sensitive Poly (N Isopropylacrylamid) (PNIPAM) Mikrogele 1,2 haben kontinuierliche Interesse in den vergangenen zwei Jahrzehnten angezogen aufgrund ihres Potenzials in den verschiedenen intelligenten Anwendungen. Nachgewiesene Anwendungsfälle sind schaltbare Emulsionsstabilisatoren 3-8, Mikrolinsen 9, Zellkultur - Substrate für die einfache Zellernte 10,11 und intelligente Träger für niedermolekulare Verbindungen und anderen biomedizinischen 12 verwendet. Aus einer Grundlagenforschung Sicht haben diese Teilchen erwiesen für die Untersuchung Themen wie kolloidale Wechselwirkungen 13-15 und Polymer-Lösungsmittel - Wechselwirkungen 16-18 nützlich.
Erfolgreiche Verwendung von PNIPAM-Mikrogele und ihre Derivate in einer gegebenen Anwendung benötigt typischerweise Wissen über die mittlere Partikelgröße und die Breite der Teilchengrößenverteilung. Für die korrekte Interpretation der experimentellen Ergebnisse Beteiligung PNIPAM MikroGele, die Kornstruktur, die durch funktionelle Comonomere beeinflußt werden kann, muß bekannt sein. Dynamische und statische Lichtstreuung (DLS und SLS sind) sind in einzigartiger Weise geeignet, diese Informationen für den Erwerb, weil diese Methoden sind schnell und relativ einfach zu bedienen; und sie untersuchen die Partikeleigenschaften nicht-invasiv in ihrer natürlichen Umgebung (Dispersion). auch DLS und SLS sammeln Daten aus großen Anzahl von Teilchen, die die Vorspannung die sich aus kleinen Probengrößen, die typisch für Mikroskopieverfahren zu vermeiden. Daher ist das erste Ziel dieser Arbeit für die Praxis gute Praxis in Bezug auf die Lichtstreuung zur Einführung neuer kolloidale Charakterisierung.
Typischerweise wird die Fällungspolymerisation in Labormaßstab durchgeführt und das Finden der richtigen Reaktionsbedingungen für bestimmte Partikeleigenschaften aufwendig und viele Wiederholungen der Synthese erforderlich sein kann. Im Gegensatz zu großen Batch - Synthese, nicht gerührte Fällungspolymerisation 19,20 ist arapid Verfahren, bei dem Chargen unterschiedlicher Reaktionszusammensetzung können gleichzeitig ertragreiche Teilchen mit enger Größenverteilung polymerisiert werden. Die gleichzeitige Polymerisation minimiert experimentelle Variation und große Leistung bedeutet, dass richtige Reaktionsbedingungen schnell gefunden werden kann, um die Reaktion für Upscaling. Daher ist unser zweites Ziel, den Nutzen von nicht gerührten Fällungspolymerisation in Prototyping und in Anwendungen zu zeigen, dass nicht eine große Menge an Produkt erfordern.
Verschiedene Aspekte der Synthese und Charakterisierung kommen zusammen in dem Beispiel der Anwendung der fluoreszenzmarkierten PNIPAM-Mikrogele in kolloidalen Wechselwirkung Forschung. Hier verwenden wir eine hochgenaue Einzelpartikelverfolgung, die Diffusion von markierten Tracers Mikrogele in Dispersion von nicht-markierten Matrix Mikrogele über einen weiten Konzentrationsbereich Matrix zu untersuchen und den Käfig-Effekt in konzentrierter kolloidalen Dispersion lösen. Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie ist gut geeignet, for diesen Zweck, da sie kann unter einer großen Anzahl von potentiell unterschiedlichen Matrixspezies das spezifische Verhalten von einigen Tracermoleküle zu charakterisieren. Dies steht im Gegensatz zu Techniken wie DLS, SLS und Rheologie, die die Gesamtdurchschnittseigenschaften von Systemen messen und daher nicht das Verhalten von kleinen Anzahl von Sonden Teilchen in einem großen System auflösen kann. Weiterhin kann in diesem speziellen Beispiel herkömmlichen Lichtstreuungsverfahren nicht auch aufgrund der hohen Partikelkonzentration verwendet werden, die starke Mehrfachstreuung führt jede Standardanalyse ungültig gemacht. Die Verwendung von automatischen Datenverarbeitung und statistischen Methoden ermöglichen die Analyse von Gesamtsystemverhalten auch für Einzelpartikelverfolgung, wenn über große Probengrößen gemittelt.
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Protocol
1. Microgel Synthese
HINWEIS: N Isopropylacrylamid (NIPAM) wurde aus n-Hexan umkristallisiert. Andere Reagenzien wurden wie erhalten verwendet.
- Herkömmlichen Batch Synthese von Poly (NIPAM) Matrix Mikrogele
- Man löst 1,8 g NIPAM und 24 mg N, N '-bisacrylamide (BIS) in 245 ml filtriert (0,2 & mgr; m regenerierter Cellulose (RC) Membranfilter) doppelt destilliertem Wasser in einem 500 ml Dreihalsrundkolben , der mit einem Rückflußkühler ausgestattet ist , einem Rührer und einem Gummiseptum.
- Legen Sie ein Thermometer und ein 120-mm-Nadel für den Stickstoffeintrag durch das Septum.
- Die Lösung wird auf 60 ° C unter Rühren. Desoxygenieren die Lösung von 40 min mit Stickstoff gespült.
- Gleichzeitig bereiten die Lösung eine Initiatorlösung von 155 mg Kaliumpersulfat (KPS) in 5 ml gefiltert doppelt destilliertem Wasser und Blase mit Stickstoff Sauerstoff zu entfernen.
- Übertragen Sie die komplette 5 ml KPS solution in einer Spritze Stickstoff-washed mit einem 120-mm-Nadel ausgestattet.
- Heben Sie die Stickstoff-Nadel über der Lösungsebene im Dreihalskolben und fügen Sie die KPS-Lösung schnell durch das Gummiseptum in den Reaktor.
- Ließ die Polymerisation für 1 Stunde unter einem Stickstoffstrom und langsamen Rühren bei 60 ° C stattfindet.
- Verwenden Sie einen Büchner-Trichter und Filterpapier die heiße Reaktionslösung zu filtern, um große Aggregate zu verwerfen. Lassen Sie die Dispersion abkühlen.
- Zentrifuge und Redispersion der Dispersion dreimal 40 min lang bei 257.000 xg und schließlich das Sediment in einem minimalen praktikable Menge an doppelt destilliertem Wasser redispergieren. Typischerweise ist dies 2-4 ml.
- Lyophilisieren der Dispersion zum Speichern.
- Nicht gerührt Synthese von fluoreszenzmarkierten Poly (NIPAM) Mikrogele
- Wiegen 257,7 mg NIPAM, 3,5 mg BIS und 1,5 mg Methacryloxyethylgruppe Thiocarbamoyl Rhodamin B (Farbstoff) in Glasgefäß und 10 ml gefiltertes Doppel destillierened Wasser.
- Ultrasonicate der Farbstoff-Monomer-Lösung 15 min um den Farbstoff in Wasser zu lösen.
- Bereiten Sie die gleiche Lösung ohne Farbstoff in einen separaten Glasgefäß.
- Bereiten verschiedener Verdünnungen der Monomerlösung mit dem Farbstoff der Monomerlösung ohne den Farbstoff unter Verwendung einer Konzentrationsreihe mit verschiedenen Farbstoffkonzentrationen zu erhalten. In dieser Arbeit verwenden Farbstoff in einem Konzentrationsbereich von 0,02 bis 0,1 mmol / L.
- Man löst 8,4 mg KPS in 10 ml filtriert doppelt destilliertem Wasser, um die Initiatorlösung zu erhalten.
- Übertragung von 0,5 ml der Konzentrationsreihe und 0,5 ml der KPS-Lösung Röhrchen mit 10 mm Durchmesser zu testen, um die endgültigen Reaktionslösungen zu erhalten, und abdichten sie mit Gummimembranen.
- Vorwärmen ein Ölbad in einem doppelwandigen Glasbehälter mit einem Heizungs Zirkulators verbunden bis 63 ° C.
- Deoxygenize die Reaktionslösungen durch 20 min mit Stickstoff durch 120 mm Nadeln gespült wurde.
- Legen Sie die Rohre in afloating Plattform und die Plattform in den vorgeheizten Ölbad getaucht werden. Die Temperatur auf 60 ° C. Anfänglich höhere Temperatur im Bad ist notwendig, da die Raumtemperatur-Lösungen das Bad abkühlen. Für hohe Präzision Teilchengrösse tuning hat die Temperatursteuerung während der anfänglichen Reaktion streng sein, typischerweise ± 0,1 ° C.
- Ließ die Reaktion für eine angemessene Zeit fortzufahren. Typischerweise 1 Stunde ist genug.
- Übertragen die Reaktionsrohre schnell in einen Ofen bei 60 ° C und stellte einen Tropfen der heißen Dispersion auf 10 ml gefiltertes doppelt destilliertem Wasser vorgewärmt über PNIPAM Volumenphasenübergangstemperatur (VPTT, 32 -34 ° C) 1 für DLS Charakterisierung in der zusammengeklappten Zustand.
- Lassen Sie den Rest der Dispersionen auf Raumtemperatur abkühlen und übertragen sie in Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Lösung dreimal für 40 min bei 257.000 xg und verdünnen die Mikrogele schließlich in 2 ml filtriert doppelt destilliertem Wasser for die Verwendung als Tracer-Partikel.
2. Light Scattering Charakterisierung
- Hydrodynamischen Radius Bestimmung in zusammengeklappten Zustand durch Dynamic Light Scattering
- Waschen Sie Küvetten und mit Acetondampf Glas.
- Wärme 10 ml filtriert (zB 200 nm oder kleiner RC - Filter) doppelt destilliertem Wasser über PNIPAM VPTT.
- Übertragen einer Tropfen Heiß Dispersion auf das gefilterte Wasser, das eine vorgewärmte Nadel (0,9 x 40 mm) und die Spritze (1 ml).
- Mildern des DLS Goniometer Indexanpassung Bad auf 50 ° C und übertragen Sie die Probe auf das Gerät, ohne dass es abkühlen.
- Finden Sie die größte Streuwinkel, wo die Streuintensität ausreicht, um eine Korrelogramm zu erwerben, die von Testmessungen durchführen.
- Analysenküvette einsetzen (10 mm Durchmesser Glasrohr mit 1 ml der Partikeldispersion). Bewegen Sie den Detektor Arm zu kleinen Streuwinkel (hier 30 °).
- Schauen Sie sich die Strahlprofil for Mehrfachstreuung: kein Glühen um den Primärstrahl, keine Mehrfachstreuung usw. Überprüfen Sie, ob der Zählerbereich für die Messung bei der niedrigsten Streuwinkel geeignet ist (ca. zwischen 30 und 600 kHz; oberen rechten Ecke des Software - Fensters..)
- Bewegen Sie den Goniometerarm auf höchste Streuwinkel (120 ° wählen hier). Überprüfen Sie, ob die Zählrate noch hoch genug für die Messung ist (zwischen 30 und 600 kHz). Wenn die Intensität zu niedrig ist, bewegen Sie den Arm zu senken Winkelstreuung.
- Überprüfen Sie den Strahl visuell durch das Toluolbad Glas auf dem niedrigsten Streuwinkel, wenn Glühen um den einfallenden Strahl Mehrfachstreuung erfolgt beobachtet wird. In diesem Fall reduzieren die Laserintensität oder einer höheren Verdünnung verwenden.
- Erwerben 20 Korrelogramme zwischen dem minimalen und maximalen Streuungswinkel (zB 30 ° - 140 °) mit minimaler Erfassungszeit von 60 sec. Erhöhen Sie die Erfassungszeit für schwache Intensität große StreuwinkelFalls benötigt.
- Datenanalyse 37
- Berechnen Vektorgrößen für den Streuwinkelstreuung gemäß
Ist , wobei n der Brechungsindex der Dispersion, 
die Wellenlänge des Lasers im Vakuum und 
der Streuwinkel. - Im Fall stellt die Messtechnik-Software, die Intensität Korrelationsfunktion
, Wandeln es in elektrische Feld Korrelationsfunktion 
gemäß 
. Parameter 
ist ein uninteressant instrumental Parameter auf den Grad der räumlichen Kohärenz des gestreuten Lichts Ove bezogenenr der Detektorfläche. - Führen Sie Kumulantenanalyse auf Korrelogramme, also passen Polynom zweiter Ordnung zum Logarithmus jedes elektrischen Feldkorrelationsfunktion
durch lineare kleinsten Quadrate. erscheint als der Achsenabschnitt der Passung und der genaue Wert wird in Bezug auf die Datenanalyse ohne Bedeutung. Beschränken die Passform zu einem sinnvollen Wert τ Verzögerungszeit, beispielsweise so , dass die Korrelationsamplitude von 10 bis 20% der maximalen Amplitude. Der Koeffizient der Term erster Ordnung ist die mittlere Abnahmerate der Korrelationsfunktion, 
. - Finden Sie den wahrscheinlichsten Wert für die mittlere Diffusionskoeffizient
der Partikel durch linear kleinsten Quadrate auf 
. Ob gegen 
nicht linear erscheinen und den Ursprung innerhalb des Fehlers durchlaufen, ist die Partikelgrößenverteilung breit und hydrodynamischen Radius wird schlecht definiert werden. - Berechnen Sie den mittleren hydrodynamischen Radius von der Stokes-Einstein-Beziehung
gegebenen 
die Boltzmann-Koeffizient, 
die absolute Temperatur und 
die Viskosität der Dispersion bei . Propagieren der Standardabweichung nach 
. - Partikelstrukturbestimmung durch statische Lichtstreuung
- Waschen Sie Küvetten und mit Acetondampf Glas. Verwenden 20 mm Durchmesser oder größer Küvetten die zylindrische Linseneffekt zu minimieren.
- Filter (200 nm RC-Filter oder kleiner) in etwa 20 ml doppelt destilliertem Wasser auf einem Glasfläschchen und übertragen einen Tropfen gereinigt Dispersion in das Fläschchen. Das Filter wird mit 10 ml Wasser, bevor es für die Probenvorbereitung zur Entfernung von Verunreinigungen aus dem Herstellungsverfahren zurückbleibt.
- Überprüfen Probe gegen jede Umgebungslichtquelle. Wenn blauen Farbton beobachtet wird, wird die Probe wahrscheinlich zu konzentrieren. Verdünnte entsprechend.
- Bereiten Sie Hintergrund Wasserprobe durch die Küvette mehrmals mit gefiltertem Wasser gespült und dann füllen, um geeignete Probenvolumen in Abhängigkeit von der Küvette und der Laserposition im Gerät. Der Laser muss durch die Probe passieren, ohne von dem Meniskus gebrochen wird.
- Kalibrieren Sie den instrument unter Verwendung einer Toluol Probe.
- Messen Sie Wasser-Streuung (Hintergrund) in der gesamten verfügbaren Winkelbereich.
- Messen Sie die Streuintensität von der Probe während des gesamten verfügbaren Winkelbereich vorzugsweise bei mehreren Wellenlängen. Das Streumuster auf der vorderen Streuintensität normalisiert wird als Formfaktor bekannt.
- Wenn Partikelstruktur bekannt ist, verwenden Sie die entsprechende Modellausdruck globale Anpassung an den Datensätzen bei verschiedenen Wellenlängen gemessen zu berechnen.
- Für unbekannte Verwendung Partikelstruktur regularisiert direkt (wie FitIt! 33) oder eine allgemeinere indirekte inversen Fourier 21,22 Routine in Verbindung mit Entfaltungs des Paares Abstand Verteilungsfunktion (nur für kugelförmige Teilchen) 23,24 , um ungefähre Klassifizierung der Partikel verwandeln Art.
- Im Fall liefert die Armatur oder Inversionsroutine eine Schätzung der Partikelradius Verteilungsfunktion, die Berechnung der PolydispersitätIndex (Standardabweichung der Verteilung von seinem Mittelwert geteilt).
3. Partikelverfolgung durch Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie
HINWEIS: Tracer und Matrixteilchen von 465 ± 7 nm und 405 ± 7 nm hydrodynamischen Radien bei 20 ° C wurden jeweils für die Partikelverfolgung verwendet.
- Probenvorbereitung
- Bereiten Sie konzentrierte Matrix Mikrogeldispersion durch Redispergierung bekannte Menge an gefriergetrockneten unmarkierten Mikrogel bekannte Menge doppelt destilliertem Wasser. Fügen Sie ein kleines Volumen von markierten Tracerpartikel.
- Bestätigen Sie die entsprechende Tracer Mikrogel Konzentration im Mikroskop. Die optimale Konzentration ist ein Kompromiss zwischen gleichzeitigen Erwerb von maximal Anzahl von Spuren, während die niedrig genug Tracer-Konzentration aufweist, so dass die Wahrscheinlichkeit, dass die Tracerpartikel Spuren während der Erfassung überqueren vernachlässigbar ist.
- Bereiten Sie konzentrierten Dispersionen durch VerdampfenWasser in einem Ofen. Bestimmen Gewichtskonzentration durch das Gewicht der Dispersion auf das ursprüngliche Gewicht der Probe vor der Verdampfung zu vergleichen.
- Datenerfassung und Auswertung
- Verwenden Sie eine entsprechende Objektivlinse der gewünschten Vergrößerung und Blende zur Anregung der Tracer und gleichzeitige Fluoreszenz Sammlung aus der Probe. In dieser Arbeit verwenden, um eine 100X / 1.3 NA -Ölimmersionsobjektiv Linse.
- Legen Sie die Feuchtigkeitskammer auf einen xyz-Piezo-Tabelle, die in ein kommerzielles Mikroskop passt.
- Um die Probe vor dem Austrocknen zu verhindern, wird ein Plasma gereinigt Deckglas in die Feuchtigkeitskammer und Pipette 10 ul Poly (NIPAM) Dispersion der gewünschten Konzentration auf den Schlupf.
- In Abhängigkeit von der Anregungs- und Emissionsspektren des Fluoreszenzfarbstoffs, einen geeigneten Laser zur Anregung verwendet werden und die Laserleistung entsprechend einzustellen. Die Intensität sollte ausreichend niedrig sein, schnelle Photobleaching der Farbstoffe zu vermeiden, aber beidie gleichzeitig stark genug für eine genaue Einzelpartikelpositionierung (siehe unten). In dieser Arbeit verwenden , um eine 561 nm diodengepumpten Festkörperlaser und halten Sie die Laserleistung konstant bei 16 mW (ca. 0,5 kW cm -2 bei der Probe) bei allen Messungen.
- Zur Erzielung homogene Probenbeleuchtung, verwenden Sie die kritische Beleuchtung Setup hier beschrieben. Dazu koppeln die Laser in eine Multimode-Faser (NA 0,22 ± 0,02, 0,6 mm Kerndurchmesser), schütteln Sie die Faser mit einem Vortexer um zeitlich Durchschnitt aus Laserspeckles verwenden und projizieren die Faser in der Probenebene zu beenden.
- Kalibrieren Sie die z Abstand von der Rückreflexion des Deckglases und mehreren Mikrometern in die Probe fokussieren, indem das Ziel leicht nach oben bewegen und fixieren Sie die z-Position einen z-Kompensator verwendet wird. Dies vermeidet Grenzflächeneffekte mit dem Deckglas.
- Stellen Sie die Detektorparameter wie Belichtungszeit, zu der Stärke des Fluoreszenzsignals. In diesem Fall verwenden Sie eine EMCCD Kameramit Belichtungszeit von 0,1 sec, Elektronenvervielfachungsmodus und Verstärkung von 50.
- Erwerben mehrere Filme mit der entsprechenden Anzahl von Rahmen eine ausreichende Verzögerungszeit zu erhalten, um den mittleren quadratischen Verschiebung der Mikrogele in verschiedenen Bereichen der Probe zu berechnen. In dieser Arbeit, Erwerb Rahmenzahlen von 500 oder 1.000 Frames verwenden.
- Analysieren Sie die Daten , die durch die Positionierung der Partikel in jedem Rahmen mit Gauß - Angleich 25 und verwenden Sie ein geeignetes Partikel - Tracking - Algorithmus 26 , um die mittlere quadratische Verschiebung erhalten. 27 berechnen Werte Mittelwert und Standardabweichung durch Mittelung über alle Titel in allen Filmen. Berechnen Sie die lange Zeitverzögerung Diffusionskoeffizienten durch lineare Regression aus
, woher 
ist der mittlere quadratische Verschiebung der mittleren Diffusionskoeffizienten D und die Verzögerungszeit & tgr;. - Europäische SommerzeitiMate die Anomalie Parameter γ aus der anomalen Diffusionsgleichung
indem die Daten auf logarithmische Skala Transformation, wodurch man 
. Die Anomalie Parameter 
wird durch die Ableitung der Handlung gegeben. Das Derivat kann durch die Finite-Differenzen der Datenpunkte geschätzt werden, oder die Datenpunkte durch Polynomfunktionen Montage und Differenzierung analytisch. Bestimmen Sie den ausreichenden Grad der Polynomfit Funktionen durch die Anpassungs Residuen und Restnorm Plotten für Polynomordnung erhöhen. - Wiederholen Sie den Vorgang für verschiedene Konzentrationen der Mikrogelteilchen Matrizen.
- Berechnen Vektorgrößen für den Streuwinkelstreuung gemäß
Ist , wobei n der Brechungsindex der Dispersion, 
die Wellenlänge des Lasers im Vakuum und 
der Streuwinkel. 
, Wandeln es in elektrische Feld Korrelationsfunktion 
gemäß 
. Parameter 
ist ein uninteressant instrumental Parameter auf den Grad der räumlichen Kohärenz des gestreuten Lichts Ove bezogenenr der Detektorfläche. 
durch lineare kleinsten Quadrate. 
. 
der Partikel durch linear kleinsten Quadrate auf 
. Ob
nicht linear erscheinen und den Ursprung innerhalb des Fehlers durchlaufen, ist die Partikelgrößenverteilung breit und hydrodynamischen Radius wird schlecht definiert werden. 
gegebenen 
die Boltzmann-Koeffizient, 
die absolute Temperatur und 
die Viskosität der Dispersion bei 
. 
, woher 
ist der mittlere quadratische Verschiebung der mittleren Diffusionskoeffizienten D und die Verzögerungszeit & tgr;. 
indem die Daten auf logarithmische Skala Transformation, wodurch man 
. Die Anomalie Parameter 
wird durch die Ableitung der Handlung gegeben. Das Derivat kann durch die Finite-Differenzen der Datenpunkte geschätzt werden, oder die Datenpunkte durch Polynomfunktionen Montage und Differenzierung analytisch. Bestimmen Sie den ausreichenden Grad der Polynomfit Funktionen durch die Anpassungs Residuen und Restnorm Plotten für Polynomordnung erhöhen. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Anzahl der PNIPAM Mikrogelteilchen in der Charge und damit die endgültige Partikelvolumen, wird früh in der Reaktion während der Phase der Keimbildung 20 Thiocarbamoyl Rhodamin B beeinflußt die Keimbildung durch Reduzierung der Teilchendichte in der Charge Hydrophobic Comonomer Farbstoff methacryloxyethyl bestimmt. Die Abnahme der Partikelkonzentration für zwei unterschiedliche Anfangs NIPAM Konzentrationen können in der mittleren endgültige Partikelvolumen im kollabierten Zustand mit zunehmender Farbstoffkonzentration, die in 1 gezeigt. Die Volumenzunahme als Anstieg gesehen werden kann , um das hydrophobe Comonomer Farbstoff zurückgeführt werden, die fördert Mikrogel Kerne Aggregation in einem frühen Reaktionszeiten, die Partikelkonzentration und die Erhöhung der endgültigen Partikelvolumen abnimmt.
Die Ergebnisse einer erfolgreichen DLS Messung!ts sind in 2. Für die sechs kleinsten endgültigen Partikelvolumen Chargen lineare Abhängigkeit der mittleren Abklingrate Γ 2 auf q 2 und Null - y-Schnittpunkt innerhalb des Fehler gezeigt sind, zeigen , dass die Partikelgrößenverteilungen für diese Chargen relativ schmal sind und eine gut -defined Schätzwert für den mittleren Diffusionskoeffizient kann aus der Steigung der linearen Anpassung erhalten werden. 3 zeigt ein komplizierteres ergeben sich aus den beiden größten Volumen Chargen, wobei Γ 2 von dem linearen Verhalten im Zwischen q Bereich abweicht. Die Nichtlinearität stammt aus dem Formfaktor (Winkelstreuungsmuster) mindestens die mit diesen q Werte übereinstimmt. 28 das fragliche Phänomen kann vergleichbar mit der Wellenlänge des einfallenden Laserstrahlung auf Partikel mit Abmessungen beobachtet werden und sogar eine moderate Partikelgrößenverteilung Breite. Bestimmung des Diffusionskoeffizienten in diesem q Figur 3, Γ 2 reflektiert das mittlere Verhalten wieder bei hohen q, wobei alle Kornfraktionen gleichmäßiger auf die gesamte Streuintensität beitragen. Eine einfache Art und Weise eine vernünftige Schätzung für den mittleren Diffusionskoeffizienten zu erhalten , ist die Zwischen Γ 2 Werte aus der linearen Anpassung auszuschließen. Wenn der Formfaktor der Teilchen bekannt sind, eine aufwendigere Anpassungsverfahren kann 28 verwendet werden.
das hydrodynamische Volumen im zusammengeklappten Zustand Bestimmung ohne die Proben unterhalb des PNIPAM VPTT abkühlen lassen wird sichergestellt, dass die nicht-gelierte Solanteil nicht von den Partikeln gelöst hat. Daher das Volumen in der zusammengeklappten Zustand spiegelt die Masse und die Anzahl der Teilchen während der Polymerisation, die bei der fundam wichtig istental Eigenschaften der Fällungspolymerisation sucht 20 werden. Volumen in der zusammengeklappten Zustand stellt auch eine ausreichende Menge für die verschiedenen Reaktionsparameter zu vergleichen, weil es unabhängig von den Quelleigenschaften ist und der Anteil der nicht-gelierte Polymer in den Teilchen durch die Menge an Vernetzer in der Monomermischung geregelt. Kleinere Größe und höhere Streukontrast im zusammengefalteten Zustand erleichtern auch die DLS Charakterisierung.
Statische Lichtstreuungsdaten bei zwei Wellenlängen von 642 nm gemessen , und 404 nm für die Matrix und die Markierungspartikel sind in 4 gezeigt Sichtprüfung der Winkelstreuungsmuster zeigt , daß die Teilchen gut definierten. Multiple unterschieden Schwingungen typisch für kugelförmige Teilchen im ganzen die q zeigt enger Polydispersität, in diesem Fall 7% und 6% für die Tracer und Matrix - Mikrogelen, respectively. Glatte behavior bei niedrigen q gibt an, dass die Proben ausreichend verdünnt werden , und keine signifikante Teilchenaggregationsmuster vorhanden ist. Die Zunahme der Streuintensität bei extremen q kann aufgrund der Rückseite der Streuung zurückzuführen reflektierten Strahls von der inneren Küvettenwand. Inversion der Formfaktoren der Matrixpartikel bestätigen typische Mikrogelstruktur 29 mit dichten Kern und radial abklingende Dichteprofil aus Vernetzer Copolymerisation Kinetik 30 (siehe kleines Bild). Die gestrichelte Linie zeigt den Formfaktor des Referenz harten Kugel mit der gleichen mittleren Radius der Kreisbewegung wie die Matrixpartikel. Die experimentelle Formfaktor zerfällt schneller mit q als den Faktor harten Kugel Form, die für Partikel mit Fuzzy - Oberfläche typisch ist. Im Gegensatz dazu Tracerpartikel zeigen unkonventionelle Mikrogelstruktur. Dies kann auch von dem Referenz harten Kugel-Formfaktor zu sehen, die zeigt, dass die experimentelle Formfaktor tut zunächst nichtzerfallen schneller als die Referenz. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Einbeziehung Farbstoffmoleküle Mikrogele ihre Struktur beeinflussen können, die bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden müssen.
Die hohe Gleichmäßigkeit der synthetisierten Partikel ist von hohem Interesse für die Untersuchung der Diffusion bei Volumenanteilen um die Glasübergangstemperatur, um die Entwicklung Verhalten in diesem Regime 13, um genau zu bestimmen , und vergleichen es mit harten Partikeln 31. Daher wurden eine geringen Anteil an markierten Mikrogele mit nicht-markierten Mikrogel vergleichbarer Größe gemischt. Anregungs- und Emissionsspektren von Mikrogel-inkorporiert Farbstoffmoleküle zusammen mit der Anregungswellenlänge und Filterkonfiguration im Emissionspfad verwendet werden , dargestellt in Figur 5. Absorptions- und Emissionsmaxima von methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamin B sind in der Nähe Anregungswellenlänge und Fluoreszenzsammelbereich,jeweils, so dass in der Partikel Tracking-Einrichtung hohe Abscheideleistung. Die zeitliche Entwicklung der mittleren quadratischen Verschiebung für Tracer Mikrogele in verschiedenen nicht-markiertem Mikrogel Matrix Konzentrationen sind in Figur 6 und Figur 7 in linearen und logarithmischen Maßstab gezeigt. Bei niedrigen Mikrogel Matrix Konzentrationen diffundieren die Tracerpartikel schnell. Obwohl sie nur sichtbar für eine begrenzte Anzahl von Rahmen sind, bevor sie aus der Fokusebene bewegt, eine einigermaßen gute Abschätzung ihrer mittleren quadratischen Verschiebung möglich ist. Die lineare Erhöhung der mittleren quadratischen Verschiebung mit der Zeit zeigt normale Diffusionsverhalten für alle Verzögerungszeiten gemessen. Jedoch für Mikrogel Konzentrationen nahe der kolloidalen Glasübergang, dh 29-36 mg / ml, die zeitliche Entwicklung der mittleren quadratischen Verschiebung wird nicht-linear (siehe Abbildung 7). Das Verhalten ähnelt dem von kolloidalen mikrometergroßen PMMA-Teilchen als abribed von Wochen und 31 Weitz und kann mit dem Käfig - Effekt in Beziehung gesetzt werden. Wie schematisch in 10 gezeigt, kann ein markiertes Mikrogel in einer dichten Matrix diffundieren ziemlich frei innerhalb des Käfigs. Aus diesem Grund erhöht sich die mittlere quadratische Verschiebung linear in den ersten wenigen Millisekunden. Da jedoch Partikel in transienten Käfige von ihren Nachbarn gebildet gefangen sind, eine kollektive Umordnung der umliegenden Mikrogele ist notwendig für die Mikrogele weiter zu bewegen. Dieser Käfig - Effekt äußert sich in einem eher flachen Hang in dem zweiten Bereich von 7, und kann auch durch Inspektion der Teilchenspuren in Abbildung 9. Bei kurzen Verzögerungszeiten die Partikel wackeln in ihren Käfigen bestätigt werden, aus denen sie nur entkommen zu bekommen wieder gefangen. Bei langen Verzögerungszeiten wird die lineare Diffusionsverhalten gewonnen. Cage Effekte können mit anomale Diffusion Modelle analysiert werden, wo die zeitliche Entwicklung der (zweidimensional erfasst) Quadrat d bedeutenisplacement wird durch ein Potenzgesetz in Zeit ausgedrückt: 
oder in ihrer logarithmischen Form 
mit dem Parameter Anomalie 
32. Für die normale Diffusion, die Anomalie Parameter gleich 1 ist , Subdiffusion von Werten unterhalb dargestellt ist 1. Abbildung 8 zeigt die zeitliche Entwicklung der Anomalie Parameter direkt aus der Steigung bestimmt in der Log-Log-Plot 7. Für die geringere Konzentrationen an Mikrogele in unserer Studie, die Anomalie Parameter gleich grundsätzlich auf 1. Verzögerungszeiten 
im Bereich von mehreren Sekunden, weicht der Faktor von 1 zu niedrigeren Werten. Dieses Verhalten ist ein Artefakt aufgrund der Tatsache, dass die axiale (z-) Beobachtungsbereich in Weitfeldmikroskopie nur wenige Mikrometer beschränkt ist. Der schmale z-Bereich spannt die Analyse für die schnelle Diffusion in langen Zeitabständen für schnell Tracern bei niedrigen Konzentrationen Matrix diffundieren. Wenn die Mikrogel-Konzentration zunimmt, finden wir, dass das Minimum der Anomalie Parameter viel ausgeprägter und der Übergang in den normalen Diffusions wird ( 
) Erscheint später. Dies ist ein klarer Hinweis auf die Wirkung Käfig für dichte Mikrogele Systeme erscheinen, wenn ihre Glasübergangsregime nähern.
Abb . 1: Einzelpartikelvolumen in zusammengeklappten Zustand mit einer anfänglichen Farbstoffkonzentration in der Charge zwei verschiedene Anfangs NIPAM Konzentrationen verwendet wurden, 57,5 mmol dm -3 (schwarze Kreise) und 28,8 mmol dm -3 (graue Rechtecke). 1 Mol-% Vernetzer verwendet wurde. Initial KPS Konzentration war das gleiche in allen FledermausChes bei 1,56 mmol dm -3. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Zerfallsrate mit dem Quadrat der Streuung Vektorgröße für die vier kleinsten Volumen Mikrogel Chargen lineare Abhängigkeit von. 
auf q 2 und Null intercept zeigen enge Partikelgrößenverteilung und zeigt an, dass gut definierte Schätzung der mittleren Diffusionskoeffizient kann aus der Steigung der linearen Anpassung berechnet. NIPAM Konzentrationen betrugen 57,5 mmol dm -3 (rote Quadrate und orange invertierten Dreiecke) und 28,8 mmol dm -3 (Rest der Symbole). Farbstoffkonzentrationen waren 0,044 mmol dm -3 (rote Quadrate), 0,022 mmol dm -3 (orange invertierte Dreiecke), 0,088 mmol dm -3 (grüne Dreiecke), 0,066 mmol dm -3 (cyan Rauten), 0,044 mmol dm -3 (dunkelblaue Dreiecke), und 0,022 mmol dm -3 (rosa Kreise). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Decay Rate mit dem Quadrat der Streuung Vektorgröße für die beiden größten Volumen Chargen nicht-lineare Verhalten von Γ 2 mit q 2 im zentralen q Bereich wird durch die Änderungen in der Intensität Gewichtung des Signals durch verschiedene Größenfraktionen verursacht in der Nähe des Formfaktors Minimum. NIPAM-Konzentration in den beiden Chargen wurden 57,5 mmol dm-3, Die Farbstoffkonzentrationen betrugen 0,088 mmol dm -3 (schwarze Kreise) und 0,066 mmol dm -3 (rote Dreiecke). Faded Symbole aus der linearen Anpassung ausgeschlossen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Formfaktoren des markierten Tracers und unmarkierten Matrixpartikel Sowohl der Formfaktor - Teilchen bei zwei Wellenlängen gemessen wurde, 642 nm (hellblau und rot Datenpunkte) und 404 nm (grün und dunkelblau Datenpunkte).. Durchgezogene Linien sind globale Anpassungen an die 642 nm und 404 nm Datensätze. Eine gestrichelte Linien zeigen Formfaktoren von harten Kugel Referenzpartikel mit dem gleichen Trägheitsradien als Matrix und Tracerpartikel (orange und grün gestrichelte Linien dargestellt.) Einschübe zeigen normalisierte PartikelDichteprofile von dem Kern an der Oberfläche berechnet, zB FitIt! Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 5: Anregungs- und Emissionsspektren der Fluoreszenz markierten Mikrogelteilchen Blau Linie zeigt die Anregungs- und Emissionsspektrum rote Linie. Feste vertikale Linie ist die Anregungswellenlänge. Der schraffierte Bereich zeigt den Bereich Fluoreszenz Sammlung Wellenlänge. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: mittlere quadratische displacement mit Verzögerungszeit für die Markierungspartikel. Unlabeled Matrix Mikrogel - Konzentrationen wurden 15,56 mg / ml (links), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml und 35,35 mg / ml. Punkte und Fehlerbalken bezeichnen Erfahrungswerte und Standardabweichung sind. Durchgezogene Linien sind lineare Anpassungen an die Datenpunkte. Inset zeigt eine Weitfeld - Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von Tracer - Mikrogele bei 35,35 mg / ml Matrix - Konzentration. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7:. Die mittlere quadratische Verschiebung mit Verzögerungszeit für die Tracerpartikel in logarithmischen Skala unbeschriftet Matrix Mikrogel - Konzentrationen wurden 15,56 mg / ml (links), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml und 35,3 5 mg / ml. Punkte und Fehlerbalken bezeichnen Erfahrungswerte und Standardabweichung sind. Durchgezogene Linien sind Polynomanpassungen an die Datenpunkte. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig . 8: Anomaly Parameter Verzögerungszeit für Markierungspartikel Unlabeled Matrix Mikrogel Konzentrationen betrugen 15,56 mg / ml (links), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml und 35,35 mg / ml. Punkte repräsentieren Derivate geschätzt durch Finite Differenzen und durchgezogene Linien analytisch - Derivate aus den Polynomanpassungen in Abbildung berechnet 7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 9:. Teilchenspuren für 12 Tracer Mikrogele in Dispersion mit 35,35 mg / ml Matrixkonzentration Clustering von Spuren unverwechselbaren Blobs Ergebnisse aus den Partikeln des Tracers in transienten Käfige durch ihre unmarkierten Nachbarn gebildet gefangen zu sein Bitte klicken Sie hier um eine größere Version zu sehen diese Figur.
Abbildung 10:. Schematische Darstellung der Tracer Mikrogel Diffusion in konzentrierter unmarkierten Matrix Mikrogeldispersion Rote Bahn bezeichnet eine schnelle Diffusion der Tracer innerhalb der transienten Käfige (blau gestrichelte Linie) von den benachbarten Partikeln gebildet. Blaue Bahn bezeichnet lange Verzögerung timich Diffusion durch die kollektive Umordnung der transienten Käfige aktiviert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 11: Langzeitverzögerung Diffusionskoeffizienten mit unmarkierten Matrix Mikrogel Konzentration Bei niedrigen Matrixkonzentration die Diffusion der Tracer Mikrogele wird nicht durch die Matrix - Partikel beeinflusst. Mit zunehmender Matrix Mikrogel Konzentration der lange Zeit Diffusion verlangsamt Größenordnungen , weil Diffusion kollektive Umordnung der transienten Käfigen erfordert, wo die Tracer gefangen sind. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Zugabe von geringen Mengen von funktionellen Comonomer kann eine signifikante Wirkung auf die Partikelgröße und Struktur der PNIPAM abgeleitet Mikrogele. Gleichzeitige kleine Reagenzglas Polymerisation ist eine gute Methode, um solche Änderungen zu berücksichtigen, und hilft, schnell die richtigen Reaktantenzusammensetzungen für Zielpartikelgröße finden für Upscaling der Reaktion nach Bedarf. Die Masse der Teilchen etwa exponentiell abhängig von der Polymerisationstemperatur bei thermischer Initiator zu zersetzen, wie KPS, 20 verwendet, und daher muss eine stabile und genaue Temperaturregelung im Reaktor für eine gute Reproduzierbarkeit herzustellen. Endgültige Partikelmengen aus konventionellen Batchreaktion und nicht-gerührte Reaktions sind typischerweise in guter Übereinstimmung, wenn eine Charge Synthese bezogenen Störungen minimiert, wie beispielsweise zu heftig Rühren des Reaktionsgemisches zu even out Temperaturgradienten in dem großen Reaktor oder übermäßige Menge an Initiatorlösung verwendet, so dass die Reaktionstemperatur ändert sich während der Anfangsperiode.
Dynamische Lichtstreuung ist ein gut etabliertes und schnelle Methode Diffusionsverhalten von großen Anzahl von Teilchen in situ zu bestimmen. Wesentlich ist jedoch, Daten an mehreren Streuwinkeln zu erwerben. DLS-Messungen an einem beliebigen Winkel, mit einem Formfaktor Minimum zusammenfällt, oder im Fall von breiten Größenverteilung, werden Koeffizienten einer scheinbaren Diffusions führen signifikant von der mittleren Diffusionskoeffizienten der Probe unterscheiden. Solche Fälle können von nicht-lineare Verhalten in Γ 2 gegen q 2 Grundstück zu erkennen. Für eine breite oder multimodale Partikelgrößenverteilungen zu lösen, kann man versuchen , eine inverse Laplace - Transformation - Algorithmus wie CONTIN 34 zu verwenden. DLS ist jedoch nicht ideal für diesen Zweck geeignet wegen schlecht konditionierten nature des Inversionsproblem.
Für dynamische und statische Lichtstreuung die Proben ausreichend verdünnt werden müssen, um Mehrfachstreuung, die entkräftet die Routine Datenanalyse zu vermeiden. Für Formfaktor Bestimmung von SLS auch die Brechungsindexdifferenz der Teilchen und Lösungsmittel hat eine geringe sein, um die Mie-Streuung zu vermeiden, die Faktorenanalyse einfache Form verhindert. Diese Bedingung ist erfüllt, wenn 
, woher 
die mittlere Partikelradius und 
der Unterschied zwischen den Brechungsindizes von Lösungsmittel und Partikeln. Für Mikrogele ausgiebig mit geschwollenen Lösungsmittel ist dieses Kriterium erfüllt, aber im Allgemeinen haben die Teilchen, um den Kontrast mit einer ausreichend hohen Brechungsindex Lösungsmittel abgestimmt sein. Mie-Streuung aus dem Verschmieren von t erkannt werdener Faktor Minima bilden, ein Effekt, der abnimmt, wenn die Brechungsindexdifferenz abnimmt.
Lichtstreuungsverfahren bereitzustellen ensemble Informationen gemittelt, während Weitfeldpartikel Tracking verwendet werden kann, um das Diffusionsverhalten der einzelnen Teilchen im realen Raum zu untersuchen. Im Gegensatz Tracking Partikels auf Lichtstreuung basiert, ermöglicht die hohe Empfindlichkeit der Fluoreszenz für die Verfolgung von kleinen Teilchen, und im Extremfall sogar einzelne Moleküle. Zusätzlich kann das Verhältnis von markierten und nicht-markierten Partikeln genau angepasst werden auch Lösungen in hochkonzentriert zu messen. Particle Tracking stellt daher ein Modell frei Art und Weise des Diffusionskoeffizienten und Diffusionsbetrieb von Kolloiden in situ auch für einen Vergleich zwischen dem Verhalten der einzelnen Teilchen ermöglicht zu bestimmen. Lokalisierungsgenauigkeit einzelner Tracer ist in der Regel besser als die Beugungsgrenze, sondern hängt von dem Signal-Rausch-Verhältnis der Fluoreszenz-signal einzelner Teilchen auf der Weitfeld-Setup. Somit Kennzeichnung mit Farbstoffen, die eine hohe Quantenausbeute, gute Lichtbeständigkeit und ein Absorptionsmaximum nahe der Anregungswellenlänge ist eine Voraussetzung für gute Ergebnisse zeigen. Tracer-Konzentration niedrig zu halten, um Durchgang der Flugbahnen von verschiedenen Teilchen zu minimieren Störung des Tracking-Algorithmus. Für konzentrierte Dispersionen, kann die Dichte der fluoreszierenden Tracern durch Mischen von markierten und nicht-markierten Partikeln eingestellt werden. Neuere Arbeiten über Punktverbreiterungsfünktion Engineering ermöglicht 3D - Partikel - Tracking 35,36, die verwendet werden können anisotrope Diffusion in verschiedenen Richtungen des Raumes zu untersuchen.
Zusammengefasst liefern genaue DLS Charakterisierung und kleinen Reagenzglas Polymerisation robusten Rahmen für die hochpräzise Abstimmung von Mikrogel endgültige Partikelvolumen. Die Lichtstreuung und Fluoreszenz-Partikelverfolgungstechniken liefern ergänzende Informationen über das Ensemble undEinzelpartikeldiffusionsverhalten über einen weiten Konzentrationsbereich Dispersion. Die Kombination aus der Synthese von gut definierten weichen Partikel mit der Möglichkeit, sie in Lösungen unterschiedlicher Konzentration zu verfolgen, wird zur Untersuchung der Dynamik von weichen Partikelsysteme und einem Vergleich mit gut untersuchten Festkolloidsysteme von großer Bedeutung sein.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR Chemicals | KRAF13455 | |
| Bisacrylamid | AppliChem | A3636 | |
| n-Hexane | Merck | 104374 | |
| N-Isopropylacrylamide | Fisher Scientific | AC412785000 | recrystallized from n-hexane |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences | 23591 | |
| Potassium peroxodisulfate | Merck | 105091 | |
| Silicone oil 47 V 350 | VWR Chemicals | 83851 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| F12 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9116612 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| XY(Z) Piezo System | Physik Instrumente | P-545.3R7 | |
| 100X Oil immersion objective | Olympus | UPLSAPO | |
| QuadLine Beamsplitter | AHF Analysentechnik | F68-556T | |
| Cobolt Jive 150 laser | Cobolt | 0561-04-01-0150-300 | |
| Multimode Fiber | Thorlabs | UM22-600 | |
| iXON Ultra 897 EMCCD camera | Andor | DU-897U-CS0-BV | |
| Laser goniometer | SLS Systemtechnik | Mark III | |
| CF40 Cryo-compact circulator | Julabo | 9400340 | |
| Laser goniometer system | ALV GmbH | ALV / CGS-8F | |
| Multi-tau corretator | ALV GmbH | ALV-7004 | |
| Light scattering electronics | ALV GmbH | ALV / LSE 5004 | |
| Photon counting module | PerkinElmer | SPCM-CD2969 | 2 units in pseudo cross-correlation mode |
| 633 nm HeNe Laser | JDS Uniphase | 1145P | |
| F32 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9312632 |
References
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