Summary
Não agitada polimerização precipitação fornece uma abordagem de prototipagem rápida, reprodutível para a síntese de estímulos-Sensitive poli (N -isopropylacrylamide) microgéis de distribuição de tamanhos estreita. Nesta síntese protocolo, luz caracterização dispersão e rastreamento de partículas de fluorescência única dessas microg�s em uma configuração de microscopia de campo amplo são demonstrados.
Abstract
Estímulos sensíveis poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microg�s têm várias aplicações práticas potenciais e usa na investigação fundamental. Neste trabalho, usamos única partícula de rastreamento microg�s PNIPAM de fluorescente etiquetado como uma vitrine para ajustar o tamanho da microgel por um procedimento de precipitação rápida polimerização não se mexeu. Esta abordagem é adequada para prototipagem novas composições e condições de reacção ou para aplicações que não necessitam de grandes quantidades de produto. síntese do microgel, tamanho de partícula e a determinação da estrutura por difusão de luz dinâmica e estática são detalhados no protocolo. Mostra-se que a adição de comonómeros funcionais pode ter uma grande influência sobre a nucleação e a estrutura das partículas. acompanhamento de uma única partícula por microscopia de fluorescência de campo amplo permite uma investigação sobre a difusão de microgéis tracer rotulados de uma matriz concentrada de microgéis não marcado, um sistema que não é facilmente investigado pelaoutros métodos, tais como dispersão de luz dinâmica.
Introduction
Estímulos sensíveis poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microg�s 1,2 têm atraído o interesse contínuo sobre as últimas duas décadas devido ao seu potencial em várias aplicações inteligentes. Casos de uso demonstrados incluem estabilizadores comutáveis emulsão 3-8, microlentes 9, substratos de cultura de células para facilitar a colheita de células 10,11 e transportadores inteligentes para compostos de baixo peso molecular e outros biomédica utiliza 12. De um ponto de pesquisa fundamental de vista estas partículas têm provado ser útil para investigar temas como interações coloidais 13-15 e interações polímero-solvente 16-18.
O uso bem sucedido de microgéis PNIPAM e seus derivados em qualquer dada aplicação, tipicamente requer o conhecimento sobre o tamanho de partícula médio e a largura da distribuição de tamanho de partícula. Para a correta interpretação dos resultados experimentais envolvendo PNIPAM microgeles, a estrutura da partícula, que pode ser afectada por comonómeros funcionais, tem de ser conhecida. Estática e dinâmica de espalhamento de luz (DLS e SLS, respectivamente) são excepcionalmente adequado para adquirir esta informação porque esses métodos são rápidos e relativamente fácil de usar; e eles sondar as propriedades de partícula de forma não invasiva no seu ambiente nativo (dispersão). DLS e SLS também coletar dados de grande número de partículas evitando o viés decorrente de pequenos tamanhos de amostra, típicos para métodos de microscopia. Portanto, o primeiro objetivo deste trabalho é apresentar boas práticas em matéria de dispersão de luz para os profissionais novos para a caracterização coloidal.
Tipicamente, a precipitação a polimerização é realizada em escala laboratorial e encontrando as condições de reacção adequadas para as propriedades específicas de partículas pode ser trabalhoso e requerem muitas repetições de síntese. Em contraste com a síntese do lote grande, a polimerização não é agitada precipitação 19,20 ARAPID procedimento no qual os lotes de composição reagente diferente pode ser polimerizado simultaneamente partículas rendimento de distribuição estreita de tamanhos. polimerização simultânea minimiza a variação experimental e grande produção significa que as condições de reação adequadas podem ser encontradas rápida para upscaling a reação. Por isso, o nosso objectivo é a segunda demonstrar a utilidade da polimerização não-precipitação agitada em prototipagem e em aplicações que não requerem uma grande quantidade de produto.
Diferentes aspectos da síntese e caracterização se reúnem no exemplo de aplicação da marcação fluorescente microgéis PNIPAM em investigação interacção coloidal. Aqui usamos rastreamento única partícula de alta precisão para investigar a difusão de microgéis tracer rotulados na dispersão de microgéis de matriz não marcados em uma ampla faixa de concentração da matriz e resolver o efeito gaiola em dispersão coloidal concentrado. microscopia de fluorescência de campo amplo é bem adequado for este propósito, uma vez que pode caracterizar o comportamento específico de algumas moléculas marcadoras entre um grande número de diferentes espécies potencialmente matriz. Isto está em contraste com técnicas tais como DLS, SLS e reologia, que medem as propriedades média do conjunto de sistemas e, portanto, não é possível resolver o comportamento de pequeno número de partículas de sonda num sistema de grande. Além disso, neste exemplo específico métodos de dispersão de luz convencionais não podem ser utilizados também, devido à alta concentração de partículas, o que leva a uma forte dispersão múltipla invalidando a análise standard. Uso de tratamento automatizado de dados e métodos estatísticos permitem a análise do comportamento do sistema geral também para rastreamento de uma única partícula, quando a média ao longo de grandes tamanhos de amostra.
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Protocol
1. Microgel Síntese
NOTA: -isopropylacrylamide N (NiPAM) foi recristalizado a partir de n-hexano. Outros reagentes foram utilizados como recebidos.
- Síntese descontínuos convencionais de poli (NiPAM) microgéis Matrix
- Dissolve-se 1,8 g de NiPAM e 24 mg de N, N '-bisacrylamide (BIS) em 245 ml de filtrado (0,2 um de celulose regenerada (RC) de filtro de membrana) de água bi-destilada em um 500 ml de três tubuladuras equipado balão de fundo redondo com um condensador de refluxo, um agitador e um septo de borracha.
- Inserir um termómetro e uma agulha 120 mm na entrada de azoto, através do septo.
- Aquece-se a solução a 60 ° C, enquanto se agitava. Desoxigena-se a solução por purga com azoto durante 40 min.
- Simultaneamente preparar uma solução de iniciador de persulfato de potássio 155 mg (KPS) em 5 ml de água filtrada bidestilada e bolha a solução com azoto para remover o oxigénio.
- Transfira os completos 5 ml KPS solução em uma seringa de azoto lavada equipada com uma agulha de 120 mm.
- Levantar a agulha de azoto acima do nível da solução no balão de três tubuladuras e adicionar a solução KPS rapidamente através do septo de borracha para dentro do reactor.
- Deixe a polimerização prosseguir durante 1 hora sob fluxo de azoto e agitação lenta a 60 ° C.
- Utilizando um funil de Buchner e o filtro de papel de filtrar a solução reaccional quente, a fim de desfazer agregados grandes. Deixe a dispersão arrefeça.
- Centrifugar a dispersão e redispersar três vezes durante 40 minutos a 257000 x g e finalmente redispersar o sedimento em uma quantidade mínima viável de água destilada duas vezes. Tipicamente, isto é 2-4 ml.
- Liofilizar a dispersão para o armazenamento.
- Não agitada Síntese de poli (NiPAM) microgéis marcado fluorescentemente
- Pesar 257,7 mg Nipam, 3,5 mg BIS, e 1,5 mg metacriloxietil tiocarbamo�o rodamina B (corante) em recipiente de vidro e adicione 10 ml de destilar dupla filtradaágua ed.
- Ultrasonicate a solução de corante-monómero durante 15 min para dissolver o corante na água.
- Preparar a mesma solução sem o corante para um recipiente de vidro separada.
- Prepare a várias diluições da solução de monómero com o corante utilizando a solução de monómero, sem o corante para se obter uma série de concentrações com várias concentrações de corantes. Neste trabalho, usar corante na gama de concentrações de 0,02-0,1 mmol / L.
- Dissolver 8,4 mg KPS em 10 ml de água filtrada duas vezes destilada, a fim de obter a solução de iniciador.
- Transferir 0,5 ml da série de concentrações e 0,5 ml da solução KPS a tubos de ensaio com 10 mm de diâmetro para obter as soluções de reacção finais e selá-los com septos de borracha.
- Pré-aqueça num banho de óleo num recipiente de vidro de parede dupla ligada a um circulador de aquecimento a 63 ° C.
- Deoxygenize as soluções de reacção por purga com azoto através de agulhas de 120 mm por 20 min.
- Inserir os tubos em afloating plataforma e mergulhe a plataforma para o banho de óleo pré-aquecido. Ajustar a temperatura para 60 ° C. Inicialmente, a temperatura mais elevada no banho é necessário que as soluções à temperatura ambiente arrefecer o banho. Para uma alta precisão de partícula tamanho de sintonia o controlo da temperatura durante a reacção inicial tem de ser rigorosa, tipicamente ± 0,1 ° C.
- Deixe que a reacção prossiga durante um tempo apropriado. Tipicamente 1 hora é suficiente.
- Transferir os tubos de reacção rápida para uma estufa a 60 ° C e colocar uma gota da dispersão quente para 10 ml de água destilada filtrada dupla pré-aquecido sobre o volume PNIPAM temperatura de transição de fase (VPTT, 32 -34 ° C) 1, para a caracterização de DLS na estado colapsado.
- Deixe o resto das dispersões de arrefecer até à temperatura ambiente e transferi-los para dentro de tubos de centrífuga.
- Centrifugar a solução três vezes durante 40 minutos a 257000 x g e diluir os microgéis, finalmente, em 2 ml de água destilada filtrada dupla foR utilização como partículas marcadoras.
2. Dispersão de Luz Caracterização
- Hidrodinâmica Radius Determinação no estado recolhido pela Dynamic dispersão de luz
- Lave cuvetes e copos com vapor de acetona.
- Calor 10 ml de água filtrada duas vezes destilada (por exemplo, 200 nm ou menor filtro RC) mais PNIPAM VPTT.
- Transferir uma gota de dispersão quente para a água filtrada usando uma agulha pré-aquecida (0,9 x 40 mm) e a seringa (1 ml).
- Temperar o DLS goniometer banho índice de jogo a 50 ° C e transferir a amostra para o aparelho sem deixá-lo esfriar.
- Encontrar o maior ângulo de dispersão onde a intensidade dispersa é suficiente para adquirir um correlogramas através da realização de medições de teste.
- Inserir a cuvete de amostra (tubo de vidro de 10 mm de diâmetro com 1 ml de dispersão de partículas). Mover o braço detector de ângulo de espalhamento pequeno (aqui 30 °).
- Verifique o perfil do feixe for espalhamento múltiplo: no brilho em torno do feixe primário, sem espalhamento múltiplo, etc. Verifique se a faixa de contagem é apropriado para a medição no ângulo de espalhamento menor (aproximadamente entre 30 e 600 kHz; canto superior direito da janela do software.).
- Mover o braço do goniômetro para o maior ângulo de espalhamento (escolher 120 ° aqui). Verificar que a taxa de contagem é ainda suficientemente elevada para a medição (entre 30 e 600 kHz). Se a intensidade é muito baixa, mover o braço para diminuir o ângulo de espalhamento.
- Verifique o feixe visualmente através do vidro banho de tolueno no ângulo de espalhamento menor, se brilho ao redor do feixe incidente é observado espalhamento múltiplo ocorre. Neste caso, reduzir a intensidade do laser ou usar uma maior diluição.
- Adquirir 20 correlogramas entre o ângulo de espalhamento mínimo e máximo (por exemplo, 30 ° - 140 °), com tempo mínimo de aquisição de 60 seg. Aumentar o tempo de aquisição de fraca intensidade grandes ângulos de espalhamentose necessário.
- Análise de Dados 37
- Calcular espalhamento magnitudes vector para o ângulo de dispersão de acordo com a
, Onde n é o índice de refracção da dispersão, 
o comprimento de onda do laser e no vácuo 
o ângulo de espalhamento. - No caso de o software de medição proporciona a função de correlação de intensidade
, Transformá-lo em função de correlação campo elétrico 
de acordo com 
. Parâmetro 
é um parâmetro fundamental desinteressante relacionada com o grau de coerência espacial da luz dispersa over área do detector. - Realizar análise cumulant em correlogramas, ou seja, se encaixam polinômio de segunda ordem ao logaritmo de cada função de correlação campo elétrico
por mínimos quadrados lineares. aparece como a intercepção da forma e seu valor exato não é importante no que diz respeito à análise de dados. Restringir o ajuste de um valor τ tempo de atraso significativo, por exemplo, de modo que a amplitude de correlação é de 10 - 20% da amplitude máxima. O coeficiente do primeiro termo de ordem é a taxa de decaimento médio da função de correlação, 
. - Encontre o valor mais provável para o coeficiente de difusão médio
das partículas por mínimos quadrados lineares caber em 
. E se contra 
não parece linear e percorrer a origem dentro do erro, a distribuição de tamanho de partícula é amplo e hidrodinâmico raio será mal definida. - Calcular o raio hidrodinâmico de a relação de Stokes-Einstein
, onde 
é o coeficiente de Boltzmann, 
a temperatura absoluta e 
a viscosidade da dispersão em . Propagar o desvio padrão de para 
. - Determinação Estrutura de partículas por dispersão de luz estática
- Lave cuvetes e copos com vapor de acetona. Use 20 mm de diâmetro ou maiores cuvetes para minimizar o efeito da lente cilíndrica.
- Filtro (200 nm, filtro RC ou menor) a cerca de 20 ml de água duplamente destilada para um frasco de vidro e transferir uma gota de dispersão purificado ao frasco. Lavar o filtro com 10 ml de água antes de o utilizar para a preparação da amostra para remover impurezas restantes do processo de fabrico.
- Verifique amostra contra qualquer fonte de luz ambiente. Se for observado azul de matiz, a amostra é susceptível de ser demasiado concentrada. Dilui-se em conformidade.
- Prepare a amostra de água de lavagem do fundo da cuvete várias vezes com água e filtrou-se em seguida encher-se o volume adequado da amostra, dependendo da cuvete e a posição do laser no instrumento. O laser tem de passar através da amostra sem ser refractada do menisco.
- Calibrar o instrument utilizando uma amostra de tolueno.
- Medir a dispersão de água (fundo) em toda a gama angular disponível.
- Medir a intensidade de dispersão da amostra em toda a gama angular disponível em vários comprimentos de onda de um modo preferido. O padrão de dispersão normalizados para a intensidade de dispersão para a frente é conhecido como o factor de forma.
- Se a estrutura da partícula é conhecido, use a expressão modelo adequado para calcular o ajuste global sobre os conjuntos de dados medidos em diferentes comprimentos de onda.
- Para uso estrutura da partícula desconhecida regularizada direta (como FitIt! 33) ou um inversa indireta mais geral transformada de Fourier 21,22 rotina em conjunto com deconvolução da função de distribuição par distância (apenas para partículas esféricas) 23,24 para a classificação aproximada de partículas digitar.
- No caso de a rotina de ajuste ou inversão fornece uma estimativa da função de distribuição de raio de partícula, calcular a polidispersidadeíndice (desvio-padrão da distribuição dividido por sua média).
3. Rastreamento de Partículas pelo Largo-campo microscopia de fluorescência
NOTA: Tracer e matriz de partículas de 465 ± 7 nm e 405 ± 7 nm raio hidrodinâmico a 20 ° C, respectivamente, foram usados para o rastreamento de partícula.
- Preparação de amostra
- Prepare dispersão microgel matriz concentrada por redispersão quantidade conhecida de microgel sem rótulo liofilizado a quantidade conhecida de água bidestilada. Adicionar um volume pequeno de partículas marcadoras marcadas.
- Confirmar a concentração do traçador microgel apropriada no microscópio. A concentração óptima é um compromisso entre as aquisições simultâneas de número máximo de faixas, ao mesmo tempo que a concentração do traçador suficientemente baixo de modo que a probabilidade de que as faixas de traçador de partículas cruzada durante a aquisição é negligenciável.
- Preparar dispersões concentradas por evaporaçãoágua num forno. Determinar a concentração de peso por comparação ao peso da dispersão para o peso original da amostra antes da evaporação.
- Aquisição de Dados e Análise
- Usar uma lente objectiva adequado da ampliação desejada e a abertura para a excitação dos marcadores de fluorescência simultânea e recolha da amostra. Neste trabalho, use uma 100X / 1.3 NA imersão em óleo lente objetiva.
- Coloque a câmara de umidade sobre uma mesa xyz-piezo, que se encaixa em um microscópio comercial.
- Para evitar que a amostra de secagem, coloque um plasma limpo lamela de cobertura para dentro da câmara de humidade e pipeta de 10 uL de poli (NiPAM) dispersão da concentração desejada para o deslizamento.
- Dependendo da excitação e emissão de espectros de o corante fluorescente, utilizar um laser adequado para excitação e ajustar a potência de laser de forma adequada. A intensidade deve ser suficientemente baixa para evitar a fotodegradação rápida dos corantes, mas aao mesmo tempo forte o suficiente para o posicionamento preciso única partícula (ver abaixo). Neste trabalho, utilizar um laser de estado sólido bombeado-diodo 561 nm e manter constante a potência do laser a 16 mW (cerca de 0,5 kW cm-2 no exemplo) para todas as medições.
- Para obter a iluminação da amostra homogénea, utilize a configuração de iluminação crítica descrita aqui. Para isso, par o laser em uma fibra multimodo (NA 0,22 ± 0,02, 0,6 mm de diâmetro do núcleo), agitar a fibra utilizando um agitador, a fim de temporalmente médios para fora manchas de laser, e projetar a fibra termina no plano da amostra.
- Calibrar a distância z a partir da reflexão de trás da lâmina de cobertura e se concentrar vários micrômetros na amostra movendo o objetivo ligeiramente para cima e corrigir o z-position usando um z-compensador. Isto evita quaisquer efeitos de interface com a lamela.
- Ajustar os parâmetros do detector, tais como o tempo de exposição, com a força do sinal de fluorescência. Neste caso, usar uma câmera EMCCDcom tempo de exposição de 0,1 segundos, o elétron de modo e ganho de 50 multiplicando.
- Adquirir vários filmes com o número apropriado de quadros para obter intervalo de tempo adequado para calcular o deslocamento quadrático médio dos microgéis em diferentes regiões da amostra. Neste trabalho, use aquisição números de quadro de 500 ou 1.000 quadros.
- Analisar os dados posicionando as partículas em cada quadro usando encaixe Gaussian 25 e usar um algoritmo de rastreamento de partícula apropriado 26 para obter o deslocamento quadrático médio. 27 Calcular os valores médios e desvio padrão pela média sobre todas as faixas em todos os filmes. Calcule as longas coeficientes de difusão tempo de atraso por meio de regressão linear de
, Onde 
é o deslocamento quadrático médio, D o coeficiente de difusão média e τ o tempo de atraso. - HusaImate o γ parâmetro anomalia da equação de difusão anômala
por transformação dos dados para escala logarítmica, obtendo-se 
. O parâmetro anomalia 
é dada pela derivada da trama. O derivado pode ser estimado pelas diferenças finitas dos pontos de dados, ou ajustando os pontos de dados por funções polinomiais e diferenciar analiticamente. Determinar o grau suficiente de as funções de ajuste polinomial plotando os resíduos em forma e norma residual para o aumento da ordem polinomial. - Repetir o mesmo procedimento para as diferentes concentrações de matrizes de microgel.
- Calcular espalhamento magnitudes vector para o ângulo de dispersão de acordo com a
, Onde n é o índice de refracção da dispersão, 
o comprimento de onda do laser e no vácuo 
o ângulo de espalhamento. 
, Transformá-lo em função de correlação campo elétrico 
de acordo com 
. Parâmetro 
é um parâmetro fundamental desinteressante relacionada com o grau de coerência espacial da luz dispersa over área do detector. 
por mínimos quadrados lineares. 
. 
das partículas por mínimos quadrados lineares caber em 
. E se
não parece linear e percorrer a origem dentro do erro, a distribuição de tamanho de partícula é amplo e hidrodinâmico raio será mal definida. 
, onde 
é o coeficiente de Boltzmann, 
a temperatura absoluta e 
a viscosidade da dispersão em 
. 
, Onde 
é o deslocamento quadrático médio, D o coeficiente de difusão média e τ o tempo de atraso. 
por transformação dos dados para escala logarítmica, obtendo-se 
. O parâmetro anomalia 
é dada pela derivada da trama. O derivado pode ser estimado pelas diferenças finitas dos pontos de dados, ou ajustando os pontos de dados por funções polinomiais e diferenciar analiticamente. Determinar o grau suficiente de as funções de ajuste polinomial plotando os resíduos em forma e norma residual para o aumento da ordem polinomial. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O número de partículas de microgel PNIPAM no lote e, assim, o volume de partículas final, é determinado no início da reacção, durante a fase de nucleação 20 Hidrofóbica metacriloxietil corante de co-monómero tiocarbamoilo rodamina B influencia a nucleação, reduzindo a densidade do número de partículas no lote. A diminuição da concentração de partículas para duas concentrações Nipam iniciais diferentes podem ser vistos como um aumento no volume de partícula médio final no estado recolhido com o aumento da concentração de corante, mostrado na Figura 1. O aumento de volume pode ser atribuído ao corante comonómero hidrófobo, que promove a agregação de microgel núcleos em tempos de reacção iniciais, diminuindo a concentração de partículas e o aumento do volume de partículas final.
Os resultados de uma bem sucedida measuremen DLSTS estão representados na Figura 2. Para a seis pequenos lotes de volume de partícula final de dependência linear da taxa de decaimento significativo Γ 2 na q 2 e intercepto-y zero, dentro do erro indicam que as distribuições de tamanho de partículas para estes lotes são relativamente estreita e um poço -definida estimativa para o coeficiente de difusão médio pode ser obtida a partir do declive do ajustamento linear. a Figura 3 mostra um resultado mais complicada a partir dos dois maiores lotes de volume, onde Γ 2 desvia do comportamento linear no intervalo Q intermediário. A não linearidade origina a partir do mínimo de factor de forma (padrão de espalhamento angular) que coincide com estes valores de q. 28 O fenómeno em questão pode ser observado para as partículas com dimensões comparáveis ao comprimento de onda da radiação laser incidente e ainda uma distribuição de tamanho de partícula moderada largura. Determinação do coeficiente de difusão na presente Q figura 3, Γ 2 reflecte o comportamento significativo novamente em alto Q, em que todas as fracções de tamanho de partícula mais uniforme contribuirá para a intensidade total dispersa. Uma maneira simples de obter uma estimativa razoável para o coeficiente de difusão médio é de excluir os valores intermediários Γ 2 do ajuste linear. Se o factor de forma das partículas são conhecidos, um método de ajuste mais elaborado pode ser utilizado 28.
Determinar o volume hidrodinâmico no estado recolhido sem deixar as amostras arrefecer abaixo da PNIPAM VPTT garante que a fração sol não-gel não separada das partículas. Por conseguinte, o volume no estado colapsado reflecte a massa e o número das partículas durante a polimerização, o que é importante se o FundamPropriedades ental da polimerização de precipitação estão sendo investigados 20. Volume no estado colapsado também fornece uma grande quantidade para comparar diferentes parâmetros de reacção, porque é independente das propriedades de inchamento e a fracção de polímero não gelificada nas partículas regulada pela quantidade de agente de ligação cruzada na mistura de monómeros. tamanho menor e maior contraste dispersão no estado recolhido também facilitar a caracterização DLS.
Os dados estáticos de dispersão de luz medidos em dois comprimentos de onda de 642 nm e 404 nm para as partículas da matriz e traçadores são mostrados na Figura 4 A inspecção visual dos padrões de espalhamento angular revela que as partículas são bem definidas:. Várias oscilações distintos típicos para as partículas esféricas em toda o q indica polidispersibilidade apertada, neste caso de 7% e 6% para os traçadores e microgéis de matriz, respectivamente. lisa behavior em baixa q indica que as amostras são suficientemente diluído e sem agregação das partículas significativo está presente. O aumento da intensidade dispersa no extremo Q pode ser atribuída ao espalhamento devido à volta do feixe reflectida a partir da parede interior da cuvete. Inversão dos fatores de forma das partículas da matriz confirmar estrutura microgel típica 29 com núcleo denso e perfil de densidade radialmente em decomposição resultante de reticulação cinética de copolimerização 30 (ver caixa). A linha tracejada mostra o fator de forma da esfera dura de referência com o mesmo raio médio de rotação como as partículas da matriz. O fator de forma experimental decai mais rapidamente com q do que o disco fator de forma esfera, o que é típico para partículas com superfície difusa. Em contraste, as partículas tracer exibem estrutura microgel convencional. Isto pode também ser visto a partir do disco factor de forma de bola de referência, o que mostra que o factor de forma experimental inicialmente não fazdecair mais rápido do que a referência. Este resultado mostra que as moléculas de corante para que incorporam microgéis podem afectar a sua estrutura, a qual deve ser contabilizadas de interpretação dos resultados.
A alta uniformidade das partículas sintetizado é de grande interesse para os estudos da sua difusão a fracções de volume em torno da temperatura de transição de vidro, a fim de determinar com precisão o comportamento evolução neste regime de 13, e compará-la com partículas duras 31. Por conseguinte, uma baixa fracção de microgéis marcadas foram misturadas com microgel não marcado de tamanho comparável. Os espectros de excitação e de emissão das moléculas de corante incorporado-microgel, juntamente com o comprimento de onda de excitação e de configuração do filtro usado no caminho de emissão são apresentados na Figura 5. Absorvância e máximos de emissão de metacriloxietil tiocarbamoilo rodamina B está perto de comprimento de onda de excitação e da recolha de fluorescência,respectivamente, permitindo alta eficiência de coleta na configuração do controlo de partículas. A evolução no tempo de deslocamento quadrático médio para microgéis de marcador nos várias concentrações de matriz de microgel não marcado são mostrados na Figura 6 e Figura 7 na escala linear e logarítmico, respectivamente. Em concentrações baixas de matriz de microgel as partículas marcadoras difundem-se rapidamente. Mesmo que eles são visíveis apenas para um número limitado de quadros antes de se mudar para fora do plano de foco, a boa estimativa dos seus deslocamentos quadrados médios é possível. O aumento linear do deslocamento quadrático médio com tempo indica um comportamento normal de difusão para todos os tempos de atraso medidos. No entanto, para as concentrações de microgel perto da transição de vidro coloidal, ou seja, 29-36 mg / ml, a evolução temporal dos deslocamentos quadrados médios torna-se não linear (ver Figura 7). O comportamento se assemelha a uma das partículas de PMMA tamanho micrométrico coloidais como descRiBED por semanas e Weitz 31 e pode ser relacionado com o efeito gaiola. Como se mostra esquematicamente na Figura 10, um microgel marcado numa matriz densa pode difundir bastante livremente dentro da gaiola. Por esse motivo, o deslocamento médio quadrático aumenta linearmente nos primeiros poucos milésimos de segundo. No entanto, uma vez que as partículas estão presos em gaiolas transientes formados por seus vizinhos, um rearranjo colectiva dos microgéis circundantes é necessário para microg�s para avançar. Este efeito gaiola se expressa em um declive bastante superficial na segunda faixa da Figura 7, e também pode ser confirmado por inspecionar as trilhas de partícula na Figura 9. Às vezes lag curtas as partículas jiggle em suas gaiolas, a partir do qual eles escapam apenas para obter preso novamente. Ao longos prazos, o comportamento de difusão linear é recuperado. efeitos de gaiola podem ser analisados usando modelos de difusão anômala em que a evolução temporal do (bidimensionalmente detectado) significam d quadradoisplacement é expressa por uma lei de potência no tempo: 
ou, na forma logarítmica 
com o parâmetro anomalia 
32. Para a difusão normal, o parâmetro anomalia é igual a 1, subdifusão é representada por valores abaixo de 1. A Figura 8 apresenta a evolução temporal do parâmetro anomalia directamente determinada a partir do declive do log-log-trama Figura 7. Para as concentrações mais baixas de microg�s em nosso estudo, o parâmetro anomalia equivale basicamente a 1. Por vezes lag 
no intervalo de alguns segundos, o factor desvia-se uma em valores mais baixos. Este comportamento é um artefato devido ao fato de que o axial (z) Faixa de observação em microscopia de campo amplo é limitado a apenas alguns micrômetros. O z- estreitagama polariza a análise por difusão rápida em intervalos de tempo longos para difundir rapidamente marcadores em baixas concentrações de matriz. Ao aumentar a concentração de microgel, descobrimos que o mínimo do parâmetro anomalia torna-se muito mais pronunciada e a transição para a difusão normal ( 
) Aparece mais tarde. Esta é uma indicação clara do efeito gaiola aparecendo para sistemas microg�s densas quando se aproxima o seu regime de transição vítrea.
Figura 1:. De volume de partículas Individual em estado recolhido com concentração de corante inicial no lote, foram utilizadas duas concentrações Nipam iniciais diferentes, 57,5 mmol dm-3 (círculos pretos) e 28,8 mmol dm -3 (retângulos cinzentos). foi utilizada uma% molar de agente de reticulação. concentração inicial KPS era a mesma em todo o batches em 1,56 mmol dm-3. As barras de erro indicam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Taxa de degradação com o quadrado da magnitude dispersão do vetor para os quatro menores lotes de volume microgel dependência linear de. 
em q 2 e com intercepção no zero indicam distribuição de tamanho de partículas estreita e indica que a estimativa bem definida do coeficiente de difusão médio pode ser calculado a partir do declive do ajuste linear. Concentrações Nipam foram 57,5 mmol dm-3 (quadrados vermelhos e laranja triângulos invertidos) e 28,8 mmol dm -3 (resto dos símbolos). As concentrações de corante foram 0,044 mmol dm -3 (quadrados vermelhos), 0,022 mmol dm-3 (triângulos invertidos laranja), 0,088 mmol dm-3 (triângulos verdes), 0,066 mmol dm-3 (rhombuses ciano), 0,044 mmol dm-3 (triângulos azuis escuros), e 0,022 mmol dm -3 (círculos rosa). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Taxa de degradação com o quadrado da magnitude espalhamento vector para as duas maiores lotes de volume comportamento não-linear do Γ 2 com Q 2 na gama q central é causada pelas mudanças na ponderação da intensidade do sinal por fracções de tamanhos diferentes na vizinhança do mínimo factor de forma. concentração Nipam nos lotes ambos eram 57,5 mmol dm-3, As concentrações de corante foram 0,088 mmol dm-3 (círculos pretos) e 0,066 mmol dm -3 (triângulos vermelhos). Símbolos desbotados foram excluídos do ajuste linear. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: fatores de forma do marcador marcado e partículas da matriz não marcados tanto para partículas o fator de forma foi medida em dois comprimentos de onda, 642 nm (luz pontos de dados azul e vermelho) e 404 nm (verde e escuras pontos de dados azuis).. As linhas sólidas são ajustes globais para o 642 nm e 404 nm conjuntos de dados. As linhas tracejadas mostram fatores de forma de partículas de referência esfera rígidos com a mesma raios de giro como partículas da matriz e marcador (laranja e verde linhas tracejadas, respectivamente.) inserções mostram partícula normalizadaperfis de densidade a partir do núcleo para a superfície calculada, por exemplo, FitIt! Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Espectros de excitação e emissão de fluorescência de partículas de microgel marcado linha azul indica o espectro de emissão de excitação e a linha vermelha. linha vertical sólida é o comprimento de onda de excitação. Área sombreada indica a faixa de comprimento de onda coleta de fluorescência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A média de disp quadradolacement com intervalo de tempo para que as partículas marcadoras. concentrações de microgel de matriz não marcado foram 15,56 mg / ml (esquerda), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml e 35,35 mg / ml. Pontos e barras de erro denotam valores experimentais e desvio padrão, respectivamente. As linhas sólidas são ajustes lineares para os pontos de dados. Inserção mostra uma fluorescência micrografia de campo amplo de microgéis tracer em 35,35 mg / concentração matriz ml. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7:. A média de deslocamento quadrado com intervalo de tempo para que as partículas marcadoras em escala logarítmica, as concentrações de microgel de matriz não marcado foram 15,56 mg / ml (esquerda), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / mL e 35,3 5 mg / ml. Pontos e barras de erro denotam valores experimentais e desvio padrão, respectivamente. As linhas sólidas são ajustes polinomiais para os pontos de dados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8:. Parâmetros Anomalia com intervalo de tempo para partículas marcadoras concentrações de microgel de matriz não marcado foram 15,56 mg / ml (esquerda), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml e 35,35 mg / mL. Os pontos representam derivados estimados por diferenças finitas e linhas sólidas analiticamente calculados derivados dos ajustes polinomiais na Figura 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9:.. Faixas de partículas para 12 microg�s tracer em dispersão com 35,35 mg / concentração matriz ml Clustering de faixas para distintivas resultados gotas de partículas do tracer sendo presos em gaiolas transientes formados por seus vizinhos não marcados Por favor, clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
Figura 10:. Ilustração esquemática da difusão tracer microgel em dispersão microgel matriz não marcado concentrado trajetória Red denota rápida difusão dos marcadores dentro das gaiolas transitórios (linha tracejada azul) formada pelas partículas vizinhas. trajectória azul denota longa ti lagme difusão habilitado pelo rearranjo coletiva das gaiolas transitórios. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11:. Coeficientes de difusão tempo de latência longos com concentração microgel de matriz não marcado a baixa concentração de matriz a difusão dos microgéis de traçador não seja afectado pelas partículas da matriz. Com o aumento da concentração de microgel matriz de difusão muito tempo desacelera ordens de grandeza, porque a difusão requer rearranjo coletiva das gaiolas transitórios, em que os marcadores estão presos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A adição de pequenas quantidades de co-monómero funcional pode ter um efeito significativo sobre o tamanho das partículas e da estrutura dos microgéis PNIPAM derivado. Simultânea em pequena escala tubo de ensaio de polimerização é um bom método para contabilizar tais mudanças, e ajuda a localizar rapidamente as composições de reagentes adequados para o tamanho de partícula alvo para redimensionar o reacção conforme necessário. A massa das partículas é de aproximadamente exponencialmente dependente da temperatura de polimerização quando a decomposição térmica do iniciador, tal como a KPS, é utilizado 20, e, por conseguinte, é necessário para estabelecer o controlo de temperatura estável e preciso no interior do reactor para uma boa reprodutibilidade. volume de partículas finais de reacção lote convencional e a reacção agitada não são tipicamente em boa concordância se uma síntese minimiza perturbações relacionadas lote, tais como agitação demasiado violento da mistura de reacção para even fora gradientes de temperatura no grande reactor, ou utilizando uma quantidade excessiva de solução de iniciador de modo a que as mudanças de temperatura de reacção durante o período de iniciação.
Dispersão dinâmica da luz é um método bem estabelecido e rápido para determinar o comportamento de difusão de grande número de partículas in situ. No entanto, é essencial para a aquisição de dados em múltiplos ângulos de espalhamento. medidas de DLS em um ângulo arbitrário, que coincide com um factor de forma mínima ou, no caso da distribuição de tamanho largo, conduzirá a um coeficiente de difusão aparente significativamente diferentes do coeficiente de difusão médio da amostra. Nesses casos, pode ser reconhecido a partir do comportamento não-linear em Γ 2 vs. q 2 trama. Para resolver distribuições de tamanho de partículas grandes ou multimodais, pode-se tentar usar um algoritmo de transformação de Laplace inversa, como CONTIN 34. DLS é no entanto não idealmente adequado para esta finalidade devido ao NAT mal condicionadoure do problema de inversão.
Para tanto a luz dinâmica e estática espalhando as amostras têm de ser suficientemente diluído para evitar a dispersão múltipla, o que invalida a análise dos dados de rotina. Para a determinação de factor de forma por SLS também a diferença de índice de refracção das partículas e solvente tem de ser baixa a fim de evitar a dispersão de Mie, o que impede uma análise factor de forma simples. Esta condição é satisfeita quando 
, Onde 
é o raio médio de partícula e 
a diferença entre os índices de refracção do solvente e partículas. Para microgéis extensivamente inchados com solvente este critério é cumprido, mas em geral, as partículas têm de ser suficientemente contraste combinado com solvente de elevado índice de refracção. Mie espalhamento pode ser reconhecido a partir do manchas de tele formar o factor mínimos, um efeito, que diminui quando a diferença de índice de refração diminui.
métodos de espalhamento de luz proporcionar uma média de conjunto de informações, enquanto que rastreamento de partículas de grande campo pode ser usado para investigar o comportamento de difusão de partículas individuais no espaço real. Em contraste com o rastreamento de partículas com base em dispersão de luz, a elevada sensibilidade da fluorescência permite o acompanhamento das pequenas partículas e, no caso extremo, até mesmo moléculas individuais. Além disso, a proporção de partículas marcadas e não marcadas podem ser adaptados para medir com precisão também em soluções altamente concentradas. Portanto, rastreamento de partículas fornece uma maneira modelo livre para determinar o modo de coeficiente de difusão e difusão de colóides in situ Mesmo tendo em conta uma comparação entre os comportamentos de partículas individuais. precisão de localização dos marcadores individuais é normalmente melhor do que o limite de difracção, mas depende da relação sinal-ruído, o rácio de Si fluorescêncianal de partículas individuais, sob a configuração de campo amplo. Assim, a marcação com corantes que apresentam um elevado rendimento quântico, boa fotoestabilidade e um máximo de absorção próximo ao comprimento de onda de excitação é um pré-requisito para obter bons resultados. concentração do marcador tem de ser mantido baixo, a fim de minimizar a passagem das trajectórias de diferentes partículas perturbem o algoritmo de seguimento. Para dispersões concentradas, a densidade de marcadores fluorescentes pode ser ajustada através da mistura de partículas marcadas e não marcadas. Trabalhos recentes sobre engenharia função de dispersão permite 3D partícula 35,36 rastreamento, o qual pode ser utilizado para investigar a difusão anisotrópica em diferentes direcções do espaço.
Em resumo, caracterização DLS precisas e em pequena escala de polimerização tubo de ensaio fornecer estrutura robusta para ajuste de alta precisão de microgel de volume de partículas final. técnicas de dispersão de luz e de rastreamento de fluorescência de partículas fornecem informações complementares sobre o conjunto ecomportamento de difusão única partícula mais ampla gama de concentração de dispersão. A combinação da síntese de partículas macias bem definidos, com a possibilidade de controlá-los em soluções de diferentes concentrações serão de importância significativa para a investigação da dinâmica de sistemas de partículas moles e uma comparação com sistemas coloidais rígidos bem estudadas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR Chemicals | KRAF13455 | |
| Bisacrylamid | AppliChem | A3636 | |
| n-Hexane | Merck | 104374 | |
| N-Isopropylacrylamide | Fisher Scientific | AC412785000 | recrystallized from n-hexane |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences | 23591 | |
| Potassium peroxodisulfate | Merck | 105091 | |
| Silicone oil 47 V 350 | VWR Chemicals | 83851 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| F12 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9116612 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| XY(Z) Piezo System | Physik Instrumente | P-545.3R7 | |
| 100X Oil immersion objective | Olympus | UPLSAPO | |
| QuadLine Beamsplitter | AHF Analysentechnik | F68-556T | |
| Cobolt Jive 150 laser | Cobolt | 0561-04-01-0150-300 | |
| Multimode Fiber | Thorlabs | UM22-600 | |
| iXON Ultra 897 EMCCD camera | Andor | DU-897U-CS0-BV | |
| Laser goniometer | SLS Systemtechnik | Mark III | |
| CF40 Cryo-compact circulator | Julabo | 9400340 | |
| Laser goniometer system | ALV GmbH | ALV / CGS-8F | |
| Multi-tau corretator | ALV GmbH | ALV-7004 | |
| Light scattering electronics | ALV GmbH | ALV / LSE 5004 | |
| Photon counting module | PerkinElmer | SPCM-CD2969 | 2 units in pseudo cross-correlation mode |
| 633 nm HeNe Laser | JDS Uniphase | 1145P | |
| F32 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9312632 |
References
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