Summary
Polimerización por precipitación no agitada proporciona un enfoque de prototipado rápido, reproducible para la síntesis de los estímulos sensibles al poli (N -isopropylacrylamide) microgeles de estrecha distribución de tamaños. En esta síntesis protocolo, la caracterización de dispersión de luz y fluorescencia de seguimiento de partículas individuales de estos microgeles en una configuración de la microscopía de campo amplio se demuestran.
Abstract
Los estímulos sensibles poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgeles tienen diversas aplicaciones prácticas potenciales y usos en la investigación fundamental. En este trabajo, utilizamos solo rastreo de partículas microgeles de PNIPAM marcados con fluorescencia como un escaparate para el tamaño de sintonía microgel por un procedimiento de polimerización por precipitación no agitada rápida. Este enfoque es muy adecuado para la creación de prototipos nuevas composiciones y condiciones de reacción o para aplicaciones que no requieren grandes cantidades de producto. la síntesis de microgel, tamaño de partícula y la determinación de la estructura mediante dispersión de luz dinámica y estática se detallan en el protocolo. Se muestra que la adición de comonómeros funcionales puede tener una gran influencia sobre la nucleación y la estructura de las partículas. rastreo de partículas Single de campo amplio microscopía de fluorescencia permite una investigación de la difusión de microgeles trazador marcado en una matriz concentrada de microgeles no etiquetados, un sistema que no fue investigado por la facilidadotros métodos tales como dispersión de luz dinámica.
Introduction
Los estímulos sensibles poli (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgeles 1,2 han atraído el interés continuo en las últimas dos décadas debido a su potencial en diversas aplicaciones inteligentes. Casos de uso demostradas incluyen estabilizadores de emulsión conmutables 3-8, microlentes 9, sustratos de cultivo celular para facilitar la recolección de células, 10,11 y portadores inteligentes para compuestos de bajo peso molecular y otros usos biomédicos 12. Desde un punto de vista de investigación fundamental estas partículas se han demostrado ser útiles para la investigación de temas tales como las interacciones coloidales 13-15 y las interacciones de polímero-disolvente 16-18.
El uso exitoso de microgeles de PNIPAM y sus derivados en cualquier aplicación dada normalmente requiere el conocimiento del tamaño de partícula medio y la anchura de la distribución del tamaño de partícula. Para la correcta interpretación de los resultados experimentales implica PNIPAM microgeles, la estructura de las partículas, que puede ser afectada por comonómeros funcionales, tiene que ser conocida. dispersión de luz dinámica y estática (DLS y SLS, respectivamente) son especialmente adecuado para la adquisición de esta información debido a que estos métodos son rápidos y relativamente fácil de usar; y sondean las propiedades de las partículas de forma no invasiva en su ambiente nativo (dispersión). DLS y SLS también recogen datos de gran número de partículas evitando el sesgo derivado de tamaños de muestra pequeños, típicos de métodos de microscopía. Por lo tanto, el primer objetivo de este trabajo es dar a conocer las buenas prácticas en relación con la dispersión de luz de los nuevos practicantes de la caracterización coloidal.
Típicamente, la polimerización por precipitación se lleva a cabo a escala de laboratorio y encontrando las condiciones de reacción adecuadas para propiedades de las partículas específicas puede ser laborioso y requiere muchas repeticiones de la síntesis. En contraste con la síntesis de lotes grandes, polimerización no agitada precipitación 19,20 es arAPID procedimiento en el que los lotes de diferente composición de reactivo puede ser polimerizado partículas simultáneamente rendimiento de estrecha distribución de tamaños. polimerización simultánea minimiza la variación experimental y salida grande significa que las condiciones de reacción adecuadas se pueden encontrar rápida ampliación de la escala de la reacción. Por lo tanto, nuestro segundo objetivo es demostrar la utilidad de la polimerización no se agita la precipitación en la creación de prototipos y en aplicaciones que no requieren una gran cantidad de producto.
Diferentes aspectos de la síntesis y caracterización se unen en el ejemplo de aplicación de la etiqueta fluorescente microgeles de PNIPAM en la investigación de la interacción coloidal. Aquí se utiliza el seguimiento de partícula de gran precisión para investigar la difusión de microgeles trazador marcado en dispersión de microgeles de matriz no marcados en un amplio intervalo de concentración de la matriz y resolver el efecto jaula en dispersión coloidal concentrada. microscopía de fluorescencia de campo amplio es muy adecuado for este propósito, ya que puede caracterizar el comportamiento específico de unas pocas moléculas de trazador entre un gran número de especies potencialmente diferentes de la matriz. Esto está en contraste con las técnicas tales como DLS, SLS y reología, que miden las propiedades medias conjunto de sistemas y por lo tanto no puede resolver el comportamiento de pequeño número de partículas de la sonda en un sistema grande. Además, en este ejemplo específico métodos de dispersión de luz convencionales no pueden ser utilizados también debido a la alta concentración de partículas, lo que conduce a una fuerte dispersión múltiple invalidar cualquier análisis estándar. El uso de tratamiento automatizado de datos y métodos estadísticos permiten el análisis del comportamiento del sistema en general también para el rastreo de partículas individuales, promediada sobre muestras de gran tamaño.
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Protocol
1. Síntesis microgel
NOTA: -isopropylacrylamide N (NIPAM) se recristalizó en n-hexano. Otros reactivos se utilizaron tal como se recibieron.
- Síntesis de lotes convencional de poli (NIPAM) microgeles Matrix
- Disolver 1,8 g de NIPAM y 24 mg de N, N '-bisacrylamide (BIS) en 245 ml filtrados (0,2 micras de celulosa regenerada (RC) filtro de membrana) agua doblemente destilada en un 500 ml de tres bocas matraz de fondo redondo equipado con un condensador de reflujo, un agitador y un tabique de caucho.
- Insertar un termómetro y una aguja 120 mm para la entrada de nitrógeno a través del septum.
- Calentar la solución a 60 ° C, mientras se agita. Desoxigenar la solución de una purga con nitrógeno durante 40 min.
- Simultáneamente preparar una solución de iniciador de 155 mg persulfato de potasio (KPS) en 5 ml filtrados agua bidestilada y la burbuja de la solución con nitrógeno para eliminar el oxígeno.
- La transferencia de los completos 5 ml s KPSolución en una jeringa de nitrógeno-lavado equipada con una aguja de 120 mm.
- Elevar la aguja de nitrógeno por encima del nivel de la solución en el matraz de tres bocas y añadir la solución KPS rápidamente a través del tabique de caucho en el reactor.
- Deje que la polimerización transcurra durante 1 hora bajo flujo de nitrógeno y agitación lenta a 60 ° C.
- Use un embudo Buchner y filtro de papel para filtrar la solución de reacción caliente con el fin de desprenderse de grandes agregados. Deje que la dispersión se enfríe.
- Centrifugar y redispersar la dispersión tres veces durante 40 minutos a 257.000 xg y finalmente redispersar el sedimento en una cantidad viable mínima de agua bidestilada. Típicamente, esto es de 2-4 ml.
- Liofilizar la dispersión para el almacenamiento.
- No agitada Síntesis de microgeles (NIPAM) marcado con fluorescencia Poly
- Pesar 257,7 mg NIPAM, 3,5 mg BIS, y 1,5 mg metacriloxietil tiocarbamoılo rodamina B (colorante) en el recipiente de vidrio y añadir 10 ml de doble destile filtradaagua ed.
- Ultrasonicate la solución de tinte-monómero durante 15 min para disolver el colorante en agua.
- Preparar la misma solución sin el colorante en un recipiente de vidrio por separado.
- Preparar varias diluciones de la solución de monómero con el colorante usando la solución de monómero sin el colorante para obtener una serie de concentraciones con diversas concentraciones de colorante. En este trabajo, el uso de tinte en el rango de concentración de 0,02-0,1 mmol / L.
- Disolver 8,4 mg KPS en 10 ml de agua bidestilada se filtra con el fin de obtener la solución de iniciador.
- Transferir 0,5 ml de la serie de concentraciones y 0,5 ml de la solución de KPS a tubos de ensayo con 10 mm de diámetro para obtener las soluciones de reacción finales y sellarlos con septos de goma.
- Precalentar un baño de aceite en un recipiente de doble pared de vidrio conectado a un circulador de calefacción a 63 ° C.
- Deoxygenize las soluciones de reacción mediante purga con nitrógeno a través de 120 agujas mm para 20 min.
- Inserte los tubos en afloating plataforma y sumergir a la plataforma en el baño de aceite precalentado. Ajuste la temperatura a 60 ° C. Inicialmente mayor temperatura en el baño es necesario ya que las soluciones a temperatura ambiente se enfríe el baño. Para una alta tuning tamaño de partícula precisión el control de la temperatura durante la reacción inicial tiene que ser riguroso, típicamente ± 0,1 ° C.
- Deje que la reacción continúe durante un tiempo apropiado. Por lo general 1 hora es suficiente.
- La transferencia de los tubos de reacción rápidamente a un horno a 60 ° C y poner una gota de la dispersión caliente a 10 ml de agua bidestilada se filtra precalentado sobre el volumen PNIPAM temperatura de transición de fase (VPTT, 32 -34 ° C) 1, para la caracterización en el DLS estado colapsado.
- Dejar que el resto de las dispersiones se enfríe a temperatura ambiente y transferirlos en tubos de centrífuga.
- Centrifugar la solución tres veces durante 40 minutos a 257.000 xg y diluir los microgeles finalmente en 2 ml de agua bidestilada se filtra for uso como partículas trazadoras.
2. Dispersión de Luz Caracterización
- Determinación hidrodinámico Radio en estado colapsado por Dynamic Light Scattering
- Lávese las cubetas y cristalería con vapor de acetona.
- Heat 10 ml de agua destilada doble filtrada (por ejemplo, 200 nm o más pequeño filtro RC) más de PNIPAM VPTT.
- Transferir una gota de la dispersión caliente para el agua filtrada utilizando una aguja pre-calentado (0,9 x 40 mm) y la jeringa (1 ml).
- Templar el DLS goniómetro baño partido índice a 50 ° C y transferir la muestra al instrumento sin dejar que se enfríe.
- Encontrar el mayor ángulo de dispersión, donde la intensidad dispersada es suficiente para adquirir una correlogram mediante la realización de mediciones de prueba.
- Introducir la cubeta de muestra (tubo de vidrio de diámetro 10 mm con 1 ml de la dispersión de partículas). Mover el brazo detector de ángulo de dispersión pequeño (en este caso 30 °).
- Compruebe el perfil del haz for dispersión múltiple: sin resplandor alrededor de la viga principal, sin dispersión múltiple, etc. Compruebe que la gama de títulos es adecuado para la medición en el ángulo de dispersión más baja (aproximadamente entre 30 y 600 kHz; esquina superior derecha de la ventana del software.).
- Mover el brazo del goniómetro de ángulo de dispersión más alta (120 ° elegir aquí). Compruebe que la tasa de recuento es todavía lo suficientemente alta para la medición (entre 30 y 600 kHz). Si la intensidad es demasiado baja, mover el brazo para reducir el ángulo de dispersión.
- Compruebe visualmente el haz a través del cristal del baño tolueno en el ángulo de dispersión más bajo, si resplandor alrededor del haz incidente se observa una dispersión múltiple se lleva a cabo. En este caso, reducir la intensidad del láser o utilizar una dilución mayor.
- Adquirir 20 correlograms entre el mínimo y el ángulo de dispersión máximo (por ejemplo, 30 ° - 140 °) con el mínimo tiempo de adquisición de 60 seg. Aumentar el tiempo de adquisición para grandes ángulos de dispersión de intensidad débilsi necesario.
- Análisis de Datos 37
- Calcular la dispersión de las magnitudes vectoriales para el ángulo de dispersión de acuerdo con la
, Donde n es el índice de refracción de la dispersión, 
la longitud de onda del láser en vacío y 
el ángulo de dispersión. - En el caso de que el software de medición proporciona la función de correlación de intensidad
, Transformarla en función de correlación de campo eléctrico 
de acuerdo a 
. Parámetro 
es un parámetro decisivo poco interesante en relación con el grado de coherencia espacial de la luz dispersada over el área del detector. - Realizar análisis acumulativo en correlograms, es decir, adaptarse polinomio de segundo orden al logaritmo de cada función de correlación de campo eléctrico
por mínimos cuadrados lineales. aparece como la intersección de la forma y su valor exacto no es importante en relación con el análisis de datos. Restringir el ajuste a un valor τ tiempo de retraso significativo, por ejemplo, de modo que la amplitud de correlación es 10 a 20% de la amplitud máxima. El coeficiente del término de primer orden es la velocidad de disminución media de la función de correlación, 
. - Encontrar el valor más probable para el coeficiente de difusión media
de las partículas por mínimos cuadrados lineales caber en 
. Si en contra 
no parece lineal y pasar por el origen dentro del error, la distribución del tamaño de partícula es amplia y radio hidrodinámico será mal definido. - Calcular el radio hidrodinámico medio de la relación de Stokes-Einstein
, donde 
es el coeficiente de Boltzmann, 
la temperatura absoluta y 
la viscosidad de la dispersión a . Propagar la desviación estándar de a 
. - Estructura de partículas Determinación por dispersión de luz estática
- Lávese las cubetas y cristalería con vapor de acetona. Utilice 20 mm de diámetro o más grandes cubetas para minimizar el efecto de lente cilíndrica.
- Filter (filtro RC 200 nm o menor) de aproximadamente 20 ml de agua doblemente destilada a un vial de vidrio y transferir una gota de dispersión purificado al vial. Lavar el filtro con 10 ml de agua antes de usarla para la preparación de muestras para eliminar las impurezas que quedan del proceso de fabricación.
- Compruebe muestra en contra de cualquier fuente de luz ambiente. Si se observa un color azul, la muestra es probable que sea demasiado concentrada. Diluir en consecuencia.
- Preparar la muestra de agua de fondo por el lavado de la cubeta varias veces con agua filtrada y luego llenar hasta el volumen apropiado de la muestra, dependiendo de la cubeta y la posición del láser en el instrumento. El láser debe pasar a través de la muestra sin ser refractada desde el menisco.
- Calibrar el instrument usando una muestra de tolueno.
- Medir la dispersión de agua (de fondo) en todo el rango angular disponible.
- Medir la intensidad de la dispersión de la muestra a lo largo del rango angular disponible preferentemente en varias longitudes de onda. El patrón de Dispersión Normalizada a la intensidad de dispersión hacia adelante se conoce como el factor de forma.
- Si la estructura de las partículas se conoce, utilice la expresión modelo apropiado para el cálculo de ajuste global de los conjuntos de datos medidos en diferentes longitudes de onda.
- Para uso desconocido estructura de partículas regularizado directa (como FitIt! 33) o una inversa indirecta más general transformada de Fourier 21,22 rutina conjuntamente con la deconvolución de la función de distribución de par distancia (sólo para partículas esféricas) 23,24 para la clasificación aproximada de partícula tipo.
- En caso de que la rutina de ajuste o inversión proporciona una estimación de la función de distribución radio de la partícula, calcular la polidispersidadíndice (desviación estándar de la distribución dividida por su media).
3. Seguimiento de partículas por microscopía de fluorescencia de campo amplio
NOTA: Tracer y de la matriz de partículas de 465 ± 7 nm y 405 nm ± 7 radios hidrodinámicos a 20 ° C, respectivamente, fueron utilizados para el rastreo de partículas.
- Preparación de la muestra
- Preparar dispersión matriz microgel concentrado por redispersión cantidad conocida de microgel no marcado se liofilizó para cantidad conocida de agua bidestilada. Añadir una pequeña cantidad de partículas de trazador marcado.
- Confirmar la concentración del marcador microgel apropiada en el microscopio. La concentración óptima es un compromiso entre adquisiciones simultáneas de número máximo de pistas, al tiempo que la concentración de marcador lo suficientemente bajo como para que la probabilidad de que las pistas de partículas de trazador se cruzan durante la adquisición es insignificante.
- Preparar dispersiones concentradas por evaporaciónde agua en un horno. Determinar la concentración de peso comparando el peso de la dispersión al peso original de la muestra antes de la evaporación.
- Adquisición y análisis de datos
- Utilizar una lente de objetivo apropiado de la ampliación deseada y la abertura para la excitación de los trazadores y la recogida de la fluorescencia de la muestra simultánea. En este trabajo, use un 100X / 1.3 NA aceite de inmersión, lente del objetivo.
- Coloque la cámara de humedad sobre una mesa xyz-piezo, que encaja en un microscopio comercial.
- Para evitar que la muestra de secado, colocar una hoja de cubierta plasma limpiado en la cámara de humedad y la pipeta 10 l de poli (NIPAM) dispersión de la concentración deseada en el deslizamiento.
- Dependiendo de la excitación y espectros de emisión del colorante fluorescente, utilizar un láser adecuado para la excitación y ajustar la potencia del láser apropiadamente. La intensidad debe ser suficientemente bajo para evitar photobleaching rápido de los tintes, pero alal mismo tiempo lo suficientemente fuerte para el posicionamiento exacto sola partícula (véase más adelante). En este trabajo, use un bombeado por diodos láser de estado sólido de 561 nm y mantener constante la potencia del láser a los 16 mW (ca. 0,5 kW cm-2 en la muestra) para todas las mediciones.
- Para obtener una iluminación homogénea de la muestra, utilice la configuración de iluminación crítica se describe aquí. Para ello, par el láser en una fibra multimodo (NA 0,22 ± 0,02, 0,6 mm de diámetro del núcleo), agitar la fibra utilizando un vórtice temporal con el fin de promediar motas láser, y se proyecta la fibra de extremo en el plano de la muestra.
- Calibrar la distancia z de la reflexión posterior de la hoja de la cubierta y se centran varios micrómetros en la muestra moviendo el objetivo ligeramente hacia arriba y fijar la posición z usando un z-compensador. Esto evita cualquier efecto de interfaz con el cubreobjetos.
- Ajuste los parámetros del detector, tales como tiempo de exposición, a la fuerza de la señal de fluorescencia. En este caso, utilizar una cámara EMCCDcon el tiempo de exposición de 0,1 segundos, el modo de electrones y la ganancia de 50 multiplicando.
- Adquirir varias películas con el número apropiado de tramas para obtener tiempo de retraso adecuado para calcular el desplazamiento cuadrático medio de los microgeles en diferentes regiones de la muestra. En este trabajo, utilice los números de fotograma de adquisición de 500 o 1.000 marcos.
- Analizar los datos mediante la colocación de las partículas en cada cuadro con el mecanismo de Gauss 25 y utilizar un algoritmo de seguimiento de partícula apropiado 26 para obtener el desplazamiento cuadrático medio. 27 Calcular los valores medios y desviación estándar promediando sobre todas las pistas de todas las películas. Calcular los coeficientes de difusión de largo tiempo de retraso por regresión lineal a partir de
, dónde 
es el desplazamiento cuadrático medio, D el coeficiente de difusión media y la tau el tiempo de retraso. - Estimate el parámetro γ anomalía de la ecuación de difusión anómala
mediante la transformación de los datos en escala logarítmica, produciendo 
. El parámetro anomalía 
está dada por la derivada de la trama. El derivado puede ser estimado por las diferencias finitas de los puntos de datos, o el montaje de los puntos de datos por funciones polinómicas y diferenciar analíticamente. Determinar el grado suficiente de las funciones de ajuste polinómico por el trazado de los residuos de ajuste y norma residual para incrementar el fin polinomio. - Repetir el mismo procedimiento con diferentes concentraciones de las matrices de microgel.
- Calcular la dispersión de las magnitudes vectoriales para el ángulo de dispersión de acuerdo con la
, Donde n es el índice de refracción de la dispersión, 
la longitud de onda del láser en vacío y 
el ángulo de dispersión. 
, Transformarla en función de correlación de campo eléctrico 
de acuerdo a 
. Parámetro 
es un parámetro decisivo poco interesante en relación con el grado de coherencia espacial de la luz dispersada over el área del detector. 
por mínimos cuadrados lineales. 
. 
de las partículas por mínimos cuadrados lineales caber en 
. Si
no parece lineal y pasar por el origen dentro del error, la distribución del tamaño de partícula es amplia y radio hidrodinámico será mal definido. 
, donde 
es el coeficiente de Boltzmann, 
la temperatura absoluta y 
la viscosidad de la dispersión a 
. 
, dónde 
es el desplazamiento cuadrático medio, D el coeficiente de difusión media y la tau el tiempo de retraso. 
mediante la transformación de los datos en escala logarítmica, produciendo 
. El parámetro anomalía 
está dada por la derivada de la trama. El derivado puede ser estimado por las diferencias finitas de los puntos de datos, o el montaje de los puntos de datos por funciones polinómicas y diferenciar analíticamente. Determinar el grado suficiente de las funciones de ajuste polinómico por el trazado de los residuos de ajuste y norma residual para incrementar el fin polinomio. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El número de partículas de microgel de PNIPAM en el lote, y por tanto el volumen de la partícula final, se determina temprano en la reacción durante la fase de nucleación 20 hidrófoba metacriloxietil colorante co-monómero tiocarbamoil rodamina B influye en la nucleación mediante la reducción de la densidad del número de partículas en el lote. La disminución de la concentración de partículas para dos concentraciones de NIPAM iniciales diferentes puede ser visto como aumento en el volumen final de partícula medio en el estado plegado con el aumento de concentración de colorante, que se muestra en la Figura 1. El aumento de volumen se puede atribuir a que el colorante de comonómero hidrófobo, que promueve la agregación microgel núcleos en los tiempos de reacción temprana, la disminución de la concentración de partículas y aumentando el volumen de partícula final.
Los resultados de un exitoso MEDICIÓN DLSTS se muestran en la Figura 2. Para los seis lotes más pequeños volumen final de partícula dependencia lineal de la tasa de atenuación media Γ 2 en la q 2 y cero intersección y dentro del error indican que las distribuciones de tamaño de partícula de estos lotes son relativamente estrechas y un pozo estimación -definido por el coeficiente de difusión media puede obtenerse a partir de la pendiente del ajuste lineal. la figura 3 muestra un resultado más complicado de los dos lotes de volumen más grande, donde Γ 2 se desvía del comportamiento lineal en el rango q intermedia. La no linealidad se origina en el mínimo factor de forma (patrón de dispersión angular) que coincide con estos valores de q. 28 El fenómeno en cuestión se puede observar para partículas con dimensiones comparables a la longitud de onda de la radiación láser incidente e incluso una distribución de tamaño de partícula moderada anchura. Determinación del coeficiente de difusión en este q figura 3, Γ 2 refleja el comportamiento medio de nuevo a alta q, donde todas las fracciones de tamaño de partículas contribuyen de manera más uniforme a la intensidad total dispersada. Una manera sencilla de obtener una estimación razonable para el coeficiente medio de difusión es para excluir los intermedios Γ 2 valores a partir del ajuste lineal. Si se sabe que el factor de forma de las partículas, un método de ajuste más elaborado se puede utilizar 28.
Determinar el volumen hidrodinámico en el estado plegado sin dejar que las muestras se enfríen por debajo de la PNIPAM VPTT asegura que la fracción sol no gelificada no se ha separado de las partículas. Por lo tanto el volumen en el estado plegado refleja la masa y el número de las partículas durante la polimerización, lo cual es importante si el fundamentales propiedades de la polimerización por precipitación se están investigando 20. El volumen en el estado plegado también proporciona una buena cantidad para la comparación de diferentes parámetros de reacción, ya que es independiente de las propiedades de hinchamiento y la fracción de polímero no gelificada en las partículas reguladas por la cantidad de reticulante en la mezcla de monómeros. Menor tamaño y mayor contraste de dispersión en el estado plegado también facilitan la caracterización DLS.
Los datos de luz estática de dispersión medidos en dos longitudes de onda de 642 nm y 404 nm para las partículas de la matriz y de trazadores se muestran en la Figura 4 La inspección visual de los patrones de dispersión angular revela que las partículas están bien definidos:. Oscilaciones distinguidos múltiples típicos para partículas esféricas de todo la q indica polidispersidad estrecha, en este caso 7% y 6% para los microgeles de trazadores y de la matriz, respectivamente. lisa behavior a baja q indica que las muestras son suficientemente diluidos y sin agregación de partículas significativa está presente. El aumento de la intensidad dispersada en extrema q puede ser atribuido a la dispersión debida a la parte posterior del haz reflejado desde la pared de la cubeta interior. La inversión de los factores de forma de las partículas de la matriz confirmar la estructura típica de microgel 29 con núcleo denso y perfil de densidad radialmente en descomposición que resulta de la cinética de copolimerización de entrecruzamiento 30 (véase el recuadro). La línea discontinua muestra el factor de forma de la esfera duro de referencia con el mismo radio medio de giro como las partículas de la matriz. El factor de forma experimental se descompone más rápido con q que el factor de forma de esferas rígidas, que es típico de las partículas con la superficie difusa. En contraste, las partículas trazadoras exhiben estructura microgel no convencional. Esto puede ser visto también desde el disco de factor de forma esfera de referencia, lo que demuestra que el factor de forma experimental no lo hace inicialmentedecaer más rápido que el de referencia. Este resultado muestra que las moléculas de colorante que incorporan a microgeles pueden afectar a su estructura, que debe tenerse en cuenta en la interpretación de los resultados.
La alta uniformidad de las partículas sintetizadas es de gran interés para el estudio de su difusión en fracciones de volumen alrededor de la temperatura de transición de vidrio con el fin de determinar con precisión el comportamiento de la evolución en este régimen 13, y compararlo con partículas duras 31. Por lo tanto, una baja fracción de microgeles marcadas se mezclaron con microgel no marcado de tamaño comparable. Excitación y espectros de emisión de moléculas de colorante de microgel-incorporada junto con la longitud de onda de excitación y la configuración de filtro utilizado en la trayectoria de emisión se presentan en la Figura 5. Absorbancia y máximos de emisión de metacriloxietil tiocarbamoılo rodamina B están cerca de la longitud de onda de excitación y la gama de recogida de fluorescencia,respectivamente, que permite una alta eficiencia de recolección en la configuración de rastreo de partículas. La evolución en el tiempo de desplazamiento cuadrático medio para microgeles trazadores en varias concentraciones de la matriz de microgel no marcado se muestra en la Figura 6 y la Figura 7 en la escala lineal y logarítmica, respectivamente. A concentraciones bajas de la matriz de microgel las partículas trazadoras se difunden rápidamente. A pesar de que son accesibles solamente a un número limitado de marcos antes de trasladarse fuera del plano de enfoque, una razonablemente buena estimación de sus desplazamientos cuadráticos medios es posible. El aumento lineal del desplazamiento cuadrático medio con el tiempo indica el comportamiento de difusión normal para todos los tiempos de retardo medidos. Sin embargo, para las concentraciones de microgel cerca de la transición vítrea coloidal, es decir, 29 a 36 mg / ml, la evolución temporal de los desplazamientos cuadráticos medios se convierte en no lineal (véase la Figura 7). El comportamiento se asemeja a la de las partículas de tamaño micrométrico PMMA coloidales como descRibed por semanas y Weitz 31 y puede estar relacionado con el efecto jaula. Como se muestra esquemáticamente en la Figura 10, un microgel marcado en una matriz densa puede difundir más bien libremente dentro de la jaula. Por esa razón, el desplazamiento cuadrático medio aumenta linealmente en los primeros milisegundos. Sin embargo, dado que las partículas quedan atrapadas en jaulas transitorios formados por sus vecinos, un reordenamiento colectiva de los microgeles circundantes es necesaria para microgeles se muevan más. Este efecto jaula se expresa en una pendiente poco profunda en el segundo rango de la figura 7, y también se puede confirmarse mediante la inspección de las huellas de las partículas en la Figura 9. En los tiempos de retardo cortos que las partículas se agitan en sus jaulas, de las que escapan sólo para obtener atrapado de nuevo. En tiempos de retardo largos, el comportamiento de difusión lineal se recupera. efectos de la jaula pueden ser analizados usando modelos de difusión anómala donde la evolución temporal de la (en dos dimensiones detectada) Mean Square Displacement se expresa por una ley de potencia en el tiempo: 
o en su forma logarítmica 
con el parámetro anomalía 
32. Para la difusión normal, el parámetro de anomalía es igual a 1, subdiffusion está representado por los valores por debajo de 1. La Figura 8 presenta la evolución temporal del parámetro anomalía determinada directamente a partir de la pendiente en el log-log-trama Figura 7. Para las concentraciones más bajas de microgeles en nuestro estudio, el parámetro anomalía básicamente es igual a 1. para los tiempos de retardo 
en el intervalo de varios segundos, el factor se desvía de 1 hacia valores más bajos. Este comportamiento es un artefacto debido a hecho de que la axial (z) Rango de observación en microscopía de amplio campo está limitado a sólo unos pocos micrómetros. La estrecha Z-gama sesga el análisis para la rápida difusión a intervalos de tiempo largos para difundir rápidamente trazadores en concentraciones bajas de la matriz. Al aumentar la concentración de microgel, encontramos que el mínimo del parámetro anomalía se convierte en mucho más pronunciada y la transición a la difusión normal ( 
) Aparece más tarde. Esta es una clara indicación de que aparece el efecto de jaula para los sistemas de microgeles densos cuando se acerque a su régimen de transición vítrea.
Figura 1:. Volumen de la partícula individual en el estado colapsado con la concentración de colorante inicial en el lote Se utilizaron dos concentraciones iniciales diferentes NIPAM, 57,5 mmol dm -3 (círculos negros) y el 28,8 mmol dm -3 (rectángulos grises). se utilizó 1% en moles de agente de reticulación. KPS concentración inicial fue la misma en todo el bateches en 1,56 mmol dm -3. Las barras de error indican la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: tasa de decaimiento con el cuadrado de la magnitud del vector de dispersión para los cuatro lotes más pequeños volumen de microgel Dependencia lineal de. 
en q 2 y cero de intercepción indicar la distribución del tamaño de partícula estrecha y se indica que la estimación bien definido del coeficiente de difusión media puede calcularse a partir de la pendiente del ajuste lineal. NIPAM concentraciones fueron 57,5 mmol dm -3 (cuadrados rojos y triángulos de color naranja invertida) y el 28,8 mmol dm -3 (resto de los símbolos). concentraciones de colorante fueron 0,044 mmol dm-3 (cuadrados rojos), 0,022 mmol dm -3 (triángulos invertidos naranja), 0,088 mmol dm -3 (triángulos verdes), 0,066 mmol dm -3 (rombos cian), 0,044 mmol dm -3 (triángulos de color azul oscuro), y 0,022 mmol dm -3 (círculos de color rosa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Velocidad de decaimiento con el cuadrado de la magnitud de dispersión de vector para los dos lotes de mayor volumen comportamiento no lineal de Γ 2 con q 2 en el rango q central está causada por los cambios en la ponderación de intensidad de la señal por parte de diferentes fracciones de tamaño en la proximidad de el factor de forma mínima. NIPAM concentración en los lotes ambos eran 57,5 mmol dm-3, Las concentraciones de colorante fueron 0,088 mmol dm -3 (círculos negros) y 0,066 mmol dm -3 (triángulos rojos). Símbolos desteñidos fueron excluidos del ajuste lineal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Factores de formas del trazador marcado y sin marcar partículas de la matriz Por tanto el factor de forma partículas se midió en dos longitudes de onda, 642 nm (luz puntos de datos azul y rojo) y 404 nm (verde y azul oscuro puntos de datos).. líneas continuas son ajustes globales a la 642 nm y 404 nm conjuntos de datos. Las líneas discontinuas muestran los factores de forma de partículas de referencia esfera duros con los mismos radios de giro en forma de partículas de la matriz y de trazadores recuadros (verde y naranja líneas punteadas, respectivamente.) Muestran partículas normalizadaperfiles de densidad del núcleo hasta la superficie calculada, por ejemplo, FitIt! Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Los espectros de excitación y la emisión de partículas de microgel marcado con fluorescencia línea azul indica el espectro de emisión de excitación y la línea roja. línea vertical continua es la longitud de onda de excitación. El área sombreada indica una longitud de onda de fluorescencia recogida. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La media de disp cuadradolacement con el tiempo de retraso para las partículas trazadoras. concentraciones de microgel de matriz no marcados se 15,56 mg / ml (izquierda), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml y 35,35 mg / ml. Los puntos y las barras de error indican los valores experimentales y desviación estándar, respectivamente. Las líneas continuas son ajustes lineales a los puntos de datos. El recuadro muestra una micrografía de fluorescencia de campo amplio de microgeles trazadores en 35.35 mg / ml de concentración de la matriz. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7:. La media de desplazamiento cuadrático con el tiempo de retraso para las partículas trazadoras en escala logarítmica concentraciones de microgel de matriz no marcados se 15,56 mg / ml (izquierda), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml y 35,3 5 mg / ml. Los puntos y las barras de error indican los valores experimentales y desviación estándar, respectivamente. Líneas continuas son ajustes polinómicos a los puntos de datos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8:. Parámetros de anomalías con tiempo de retraso para partículas trazadoras concentraciones de microgel de matriz no marcados se 15,56 mg / ml (izquierda), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml y 35,35 mg / ml. Los puntos representan derivados estimados por diferencias finitas y líneas sólidas analíticamente calculados derivados de los ajustes polinómicos en la Figura 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9:.. Trazas de partículas de 12 microgeles trazadores en dispersión con 35.35 mg / concentración ml de matriz La agrupación de pistas a resultados blobs distintivos de partículas del trazador siendo atrapados en jaulas transitorios formados por sus vecinos no marcados Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10:. Ilustración esquemática de la difusión del trazador microgel en dispersión matriz microgel no marcado concentrado trayectoria Red indica la rápida difusión de los trazadores dentro de las jaulas de transitorios (línea azul punteada) formado por las partículas vecinas. trayectoria azul denota Ti largo retardoMe difusión habilitado por el reordenamiento colectiva de las jaulas transitorios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11:. Coeficientes de difusión largo tiempo de latencia con la concentración de la matriz no marcado microgel A bajas concentraciones de matriz de la difusión de los microgeles trazadores no se ve afectada por las partículas de la matriz. Con el aumento de la concentración de la matriz microgel la difusión mucho tiempo se ralentiza órdenes de magnitud porque la difusión requiere reordenamiento colectiva de las jaulas transitorios, donde se encuentran atrapados los trazadores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La adición de pequeñas cantidades de comonómero funcional puede tener un efecto significativo en el tamaño de partícula y la estructura de los microgeles de PNIPAM derivada. polimerización simultánea tubo de ensayo a pequeña escala es un buen método para dar cuenta de estos cambios, y ayuda a encontrar rápidamente las composiciones de reactivos adecuados para el tamaño de partícula objetivo de ampliación de la escala de la reacción, según sea necesario. La masa de las partículas es de aproximadamente depende exponencialmente de la temperatura de polimerización cuando la descomposición térmica del iniciador, como KPS, se utiliza 20, y por lo tanto se necesita para establecer control de la temperatura estable y preciso en el interior del reactor para una buena reproducibilidad. los volúmenes de partícula final de la reacción de lotes convencional y reacción no agitada están típicamente en buen acuerdo si uno minimiza las perturbaciones relacionadas con la síntesis de lotes, tales como agitación demasiado violento de la mezcla de reacción a evEN No gradientes de temperatura en el reactor grande, o el uso de una cantidad excesiva de solución de iniciador de modo que los cambios de temperatura de reacción durante el período de iniciación.
Dispersión de luz dinámica es un método bien establecido y rápido para determinar el comportamiento de difusión de gran cantidad de partículas in situ. Sin embargo, es esencial para adquirir datos en múltiples ángulos de dispersión. medidas de DLS en un ángulo arbitrario, coincidiendo con un mínimo de factor de forma o en el caso de la distribución del tamaño amplio, darán lugar a un coeficiente de difusión aparente que difieren significativamente del coeficiente de difusión media de la muestra. Tales casos pueden ser reconocidos a partir del comportamiento no lineal en Γ 2 vs 2 q trama. Para resolver distribuciones amplias o multimodal del tamaño de partícula, se puede intentar utilizar un algoritmo de Laplace transformación inversa como CONTIN 34. DLS lo cual no es ideal para este propósito debido a la nat mal condicionadaure del problema de inversión.
Por tanto la luz dinámica y estática de la dispersión de las muestras tienen que ser lo suficientemente diluida para evitar la dispersión múltiple, lo que invalida el análisis de datos de rutina. Para la determinación de factor de forma por SLS también la diferencia de índice de refracción de las partículas y disolvente debe ser bajo con el fin de evitar la dispersión de Mie, que impide el análisis de factor de forma sencilla. Esta condición se cumple cuando 
, dónde 
es el radio medio de las partículas y 
la diferencia entre los índices de refracción de disolvente y de las partículas. Para microgeles ampliamente hinchados con disolvente se cumple este criterio, pero en general las partículas tienen que ser emparejado con contraste suficientemente alto disolvente índice de refracción. La dispersión de Mie se reconoce por la mancha de tque forman los mínimos de factor de, un efecto, que disminuye cuando la diferencia de índice de refracción disminuye.
métodos de dispersión de luz proporcionan un promedio de conjunto de información, mientras que el rastreo de partículas de gran campo se puede utilizar para investigar el comportamiento de difusión de las partículas individuales en el espacio real. En contraste con el rastreo de partículas basado en dispersión de la luz, la alta sensibilidad de la fluorescencia permite el seguimiento de las partículas pequeñas y, en el caso extremo, incluso moléculas individuales. Además, la proporción de partículas marcadas y no marcadas se puede adaptar para medir con precisión también en soluciones muy concentradas. Por lo tanto, el rastreo de partículas proporciona una forma libre de modelo para determinar el modo de coeficiente de difusión y la difusión de los coloides in situ incluso teniendo en cuenta una comparación entre el comportamiento de las partículas individuales. Localización exactitud de trazadores individuales es típicamente mejor que el límite de difracción, pero depende de la relación de señal a ruido de la fluorescencia signal de partículas individuales en la configuración de campo amplio. Por lo tanto, el etiquetado con tintes que presentan un alto rendimiento cuántico, buena fotoestabilidad y un máximo de absorción cerca de la longitud de onda de excitación es un requisito previo para obtener buenos resultados. la concentración de marcador debe mantenerse bajos con el fin de minimizar el cruce de las trayectorias de las diferentes partículas que perturban el algoritmo de seguimiento. Para dispersiones concentradas, la densidad de los marcadores fluorescentes se puede ajustar mediante la mezcla de partículas marcadas y no marcadas. Los trabajos recientes en la ingeniería de la función de dispersión de punto permite partícula 3D de seguimiento de 35,36, que se puede utilizar para investigar difusión anisotrópica en diferentes direcciones del espacio.
En resumen, la caracterización precisa DLS y polimerización tubo de ensayo a pequeña escala proporcionan marco sólido para la sintonización de alta precisión del volumen final de partículas de microgel. técnicas de dispersión de luz y fluorescencia de rastreo de partículas proporcionan información complementaria sobre el conjunto yel comportamiento de difusión de partículas individuales en todo el rango de concentración de amplia dispersión. La combinación de la síntesis de partículas blandas bien definidos con la posibilidad de realizar un seguimiento de ellos en soluciones de diferente concentración será de gran importancia para la investigación de la dinámica de los sistemas de partículas suaves y una comparación con los sistemas coloidales duro bien estudiados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR Chemicals | KRAF13455 | |
| Bisacrylamid | AppliChem | A3636 | |
| n-Hexane | Merck | 104374 | |
| N-Isopropylacrylamide | Fisher Scientific | AC412785000 | recrystallized from n-hexane |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences | 23591 | |
| Potassium peroxodisulfate | Merck | 105091 | |
| Silicone oil 47 V 350 | VWR Chemicals | 83851 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| F12 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9116612 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| XY(Z) Piezo System | Physik Instrumente | P-545.3R7 | |
| 100X Oil immersion objective | Olympus | UPLSAPO | |
| QuadLine Beamsplitter | AHF Analysentechnik | F68-556T | |
| Cobolt Jive 150 laser | Cobolt | 0561-04-01-0150-300 | |
| Multimode Fiber | Thorlabs | UM22-600 | |
| iXON Ultra 897 EMCCD camera | Andor | DU-897U-CS0-BV | |
| Laser goniometer | SLS Systemtechnik | Mark III | |
| CF40 Cryo-compact circulator | Julabo | 9400340 | |
| Laser goniometer system | ALV GmbH | ALV / CGS-8F | |
| Multi-tau corretator | ALV GmbH | ALV-7004 | |
| Light scattering electronics | ALV GmbH | ALV / LSE 5004 | |
| Photon counting module | PerkinElmer | SPCM-CD2969 | 2 units in pseudo cross-correlation mode |
| 633 nm HeNe Laser | JDS Uniphase | 1145P | |
| F32 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9312632 |
References
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