Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kontrollerad Syntes och Fluorescence Spårning av mycket jämn Poly ( Published: September 8, 2016 doi: 10.3791/54419
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Physical Chemistry, RWTH Aachen University

Summary

Icke-omrörd utfällningspolymerisation tillhandahåller en snabb, reproducerbar prototyping tillvägagångssätt till syntesen av stimuli-känsliga poly (N -isopropylacrylamide) mikrogeler med snäv storleksfördelning. I detta protokoll syntes är ljusspridning karakterisering och enda partikel fluorescens spårning av dessa mikrogeler i ett brett fält mikroskopi inställning påvisas.

Abstract

Stimuli känsliga poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) mikrogeler har olika potentiella praktiska tillämpningar och användning i grundforskning. I detta arbete använder vi enda partikel spårning av fluorescerande PNIPAM mikrogeler som ett skyltfönster för avstämning mikrogelstorlek av en snabb icke omrörd utfällningspolymerisation förfarande. Detta tillvägagångssätt är väl lämpad för prototyper nya reaktions kompositioner och villkor eller för applikationer som inte kräver stora mängder av produkten. Mikrogel syntes, partikelstorlek och strukturbestämning av dynamisk och statisk ljusspridning beskrivs i protokollet. Det visas att tillsatsen av funktionella sammonomerer kan ha ett stort inflytande på partikelkärnbildning och struktur. spårning enda partikel genom brett fält fluorescensmikroskopi möjliggör en undersökning av diffusion av märkta spår mikrogeler i en koncentrerad matris av icke-märkta mikrogeler, inte ett system lätt undersökts avandra metoder såsom dynamisk ljusspridning.

Introduction

Stimuli känsliga poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) mikrogeler 1,2 har lockat kontinuerligt intresse under de senaste två decennierna på grund av deras potential i olika smarta applikationer. Visade användningsfall omfattar omkopplings emulsionsstabilisatorer 3-8, mikrolinser 9, cellodling för enkel cell skörd 10,11 och smarta bärare för lågmolekylära föreningar och andra biomedicinska användningar 12. Från en grundläggande forskning synvinkel dessa partiklar har visat sig vara användbar för att undersöka ämnen som kolloidala interaktioner 13-15 och polymerlösningsmedlet interaktioner 16-18.

Framgångsrik användning av PNIPAM mikrogeler och deras derivat i en viss applikation kräver vanligtvis kunskap om medelpartikelstorleken och bredden av partikelstorleksfördelningen. För den korrekta tolkningen av de experimentella resultaten som involverar PNIPAM microgeler, har partikelstrukturen, som kan påverkas av funktionella sammonomerer, att bli känd. Dynamisk och statisk ljusspridning (DLS och SLS, respektive) är unikt lämpade för att skaffa denna information, eftersom dessa metoder är snabba och relativt lätt att använda; och de sond partikelegenskaperna icke-invasivt i sin ursprungliga miljö (dispersion). DLS och SLS samlar också data från stort antal partiklar undvika bias till följd av små provstorlekar, som är typiska för mikroskopimetoder. Därför är det första syftet med detta arbete att införa god praxis när det gäller ljusspridning för praktiker nya till kolloidalt karakterisering.

Typiskt utfällning utförs polymerisationen i laboratorieskala och att hitta de rätta reaktionsbetingelser för specifika partikelegenskaper kan vara arbetskrävande och kräver många upprepningar av syntesen. I motsats till stor sats syntes, är icke-omrörd utfällningspolymerisation 19,20 arAPID förfarande där partier av olika reaktantkompositionen kan polymeriseras samtidigt avkastnings partiklar med snäv storleksfördelning. Samtidig polymerisation minimerar experimentell variation och stor produktion innebär att rätt reaktionsbetingelser kan hittas snabbt för uppskalning reaktionen. Därför är vår andra mål att demonstrera användbarheten av icke-omrörd utfällningspolymerisation i prototyper och i tillämpningar som inte kräver en stor mängd av produkten.

Olika aspekter av syntes och karakterisering möts i exempel på tillämpning av fluorescerande märkt PNIPAM mikrogeler i kolloidalt interaktion forskning. Här använder vi mycket noggrann spårning enda partikel för att undersöka spridningen av märkta spår mikrogeler i spridning av omärkta matris mikrogeler över ett brett matris koncentrationsintervall och lösa bur effekt i koncentrerad kolloidal dispersion. Brett fält fluorescensmikroskopi är väl lämpad for detta ändamål eftersom det kan karakterisera specifikt beteende av ett fåtal spårmolekyler bland ett stort antal potentiellt olika matris arter. Detta är i motsats till tekniker såsom DLS, SLS och reologi, som mäter de ensemble genomsnittliga egenskaper hos system och därför inte kan lösa beteendet hos litet antal sondpartiklar i ett stort system. Vidare i detta specifika exempel konventionella ljusspridningsmetoder kan ej utnyttjas även på grund av partikelkoncentration hög, vilket leder till stark multipel spridning ogiltigförklara någon standardanalys. Användning av automatiserad databehandling och statistiska metoder möjliggör analys av den totala systembeteende även för enstaka partikel spårning, som medelvärde över stora provstorlekar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikrogel Syntes

OBS: N -isopropylacrylamide (NIPAM) omkristalliserades ur n-hexan. Andra reagens användes såsom de erhölls.

  1. Konventionell Batch Syntes av Poly (NIPAM) Matrix Mikrogeler
    1. Lös upp 1,8 g NIPAM och 24 mg N, N '-bisacrylamide (BIS) i 245 ml filtrerad (0,2 | j, m regenererad cellulosa (RC) membranfilter) dubbeldestillerat vatten i en 500 ml tre-halsad rundbottnad kolv utrustad med en återloppskylare, en omrörare och ett gummiseptum.
    2. Sätt en termometer och en 120 mm nål för kvävetillförseln genom membranet.
    3. Värm lösningen till 60 ° C, under omröring. Deoxygenate lösningen genom spolning med kväve under 40 min.
    4. Samtidigt framställa en initiatorlösning av 155 mg kaliumpersulfat (KPS) i 5 ml filtrerade dubbeldestillerat vatten och bubbla lösningen med kväve för att avlägsna syre.
    5. Överför hela 5 ml KPS solution i en kvävetvättade spruta utrustad med en 120 mm nål.
    6. Lyft kväve nålen ovanför lösningen nivån i trehalskolv och tillsätt KPS lösning snabbt genom gummimembranet in i reaktorn.
    7. Låt polymerisationen fortgå under 1 timme under kväveflöde och långsam omrörning vid 60 ° C.
    8. Använd en Buchner-tratt och filterpapper för att filtrera den heta reaktionslösningen för att kassera stora aggregat. Låt dispersionen svalna.
    9. Centrifugera och återdispergera dispersionen tre gånger under 40 minuter vid 257.000 x g och slutligen återdispergera sedimentet i en minimal livsduglig mängd dubbeldestillerat vatten. Normalt är 2-4 ml.
    10. Lyofilisera dispersionen för lagring.
  2. Icke omrörd Syntes av fluorescerande Poly (NIPAM) Mikrogeler
    1. Väg 257,7 mg NIPAM, 3,5 mg BIS, och 1,5 mg metakryloxietyl tiokarbamoyl rodamin B (färg) i glasbehållare och tillsätt 10 ml av filtrerat dubbel destillerared vatten.
    2. Ultrasonicate dye-monomerlösningen i 15 min för att upplösa färgämnet i vatten.
    3. Förbereda samma lösning utan färgämnet i ett separat glaskärl.
    4. Framställa olika utspädningar av monomerlösningen med färgämnet med användning av monomerlösningen utan färgämnet för att erhålla en koncentrationsserie med olika färgämneskoncentrationer. I detta arbete använder färgämnet i koncentrationsområdet 0,02 till 0,1 mmol / L.
    5. Lös upp 8,4 mg KPS i 10 ml filtrerade dubbeldestillerat vatten för att få initiatorlösningen.
    6. Överför 0,5 ml av koncentrationsserie och 0,5 ml av KPS-lösning till provrör med 10 mm diameter för att erhålla de slutliga reaktionslösningar och täta dem med gummi septa.
    7. Förvärma ett oljebad i en dubbelväggig glaskärl som är ansluten till en uppvärmnings cirkulator till 63 ° C.
    8. Deoxygenize reaktionslösningarna genom spolning med kväve genom 120 mm nålar under 20 min.
    9. Sätt rören i afloating plattform och sänk plattformen i förvärmt oljebad. Ställ in temperaturen på 60 ° C. Initialt högre temperatur i badet är nödvändigt eftersom rumstemperaturen lösningar svalna badet. För hög precision partikelstorleks tuning temperaturregleringen under den initiala reaktionen måste vara strikt, typiskt ± 0,1 ° C.
    10. Låt reaktionen fortgå under en lämplig tid. Normalt en timme är tillräckligt.
    11. Överför reaktionsrören snabbt till en ugn vid 60 ° C och sätta en droppe av den heta dispersionen till 10 ml filtrerade dubbeldestillerat vatten förvärmdes över PNIPAM volym fasövergångstemperatur (VPTT, 32 -34 ° C) 1, för DLS karakterisering i kollapsade tillstånd.
    12. Låt resten av dispersionerna svalna till rumstemperatur och överföra dem i centrifugrör.
    13. Centrifugera lösningen tre gånger under 40 minuter vid 257.000 x g och späd mikrogelerna slutligen i 2 ml filtrerade dubbeldestillerat vatten for användning som spårämnespartiklar.

2. Light Scattering Characterization

  1. Hydrodynamiska radien Fastställande i hopvikt tillstånd från Dynamic Light Scattering
    1. Tvätta kyvetter och glas med aceton ånga.
    2. Heat 10 ml filtrerat (t.ex. 200 nm eller mindre RC-filter) dubbeldestillerat vatten över PNIPAM VPTT.
    3. Överföra en droppe av heta dispersionen till den filtrerade vatten med användning av en förvärmd nål (0,9 x 40 mm) och sprutan (1 ml).
    4. Temperera DLS goniometer index match bad till 50 ° C och överföra provet till instrumentet utan att låta det svalna.
    5. Hitta den största spridningsvinkeln där den spridda intensiteten är tillräcklig för att få en correlogram genom att utföra provmätningar.
      1. Sätt i prov-kyvett (10 mm diameter glasröret med 1 ml partikeldispersion). Flytta detektorn armen till liten spridning vinkel (här 30 °).
      2. Kontrollera strålprofilen for multipel spridning: ingen glöd runt den primära strålen, ingen multipel spridning, etc. Kontrollera att räkna serien är lämplig för mätning på lägsta spridningsvinkeln (ca mellan 30 och 600 kHz, övre högra hörnet av fönstret programvara..)
      3. Flytta goniometer armen till högsta spridningsvinkeln (välj 120 ° här). Kontrollera att räknehastigheten är fortfarande hög nog för mätningen (mellan 30 och 600 kHz). Om intensiteten är för låg, förflytta armen för att sänka spridningsvinkeln.
    6. Kontrollera strålen visuellt genom toluen bad glas på den lägsta spridningsvinkeln, om glöd runt den infallande strålen observeras multipel spridning sker. I detta fall, minska laserintensiteten eller använda en högre utspädning.
    7. Förvärva 20 correlograms mellan lägsta och högsta spridningsvinkeln (t.ex. 30 ° - 140 °) med minsta möjliga förvärv tid på 60 sek. Öka förvärvstiden för svag intensitet stora spridningsvinklarom nödvändigt.
  2. Dataanalys 37
    1. Beräkna spridning vektor magnituder för spridningsvinkeln enligt Eq 2 , Där n är brytningsindex för dispersionen, ekv 3 våglängden hos lasern i vakuum och ekv 4 spridningsvinkeln.
    2. I fallet mätningen programvara ger intensitetskorrelationsfunktion ekv 5 , Omvandla den till elektriska fältet korrelationsfunktion ekv 6 enligt ekv 7 . Parameter ekv 8 är en ointressant avgörande parameter relaterad till graden av spatial koherens av det spridda ljuset over detektorarean.
    3. Utföra Cumulant analys på correlograms, dvs passa andra ordningens polynom till logaritmen av varje elektriskt fält korrelationsfunktion ekv 9 genom linjära minstakvadrater. ekv 8 visas som interceptet av passform och dess exakta värde är oviktig med avseende på dataanalysen. Begränsa passningen till en meningsfull fördröjning τ värde, till exempel, så att korrelationen amplituden är 10-20% av den maximala amplituden. Koefficienten för den första ordningens term är medelvärdet avklingningshastigheten av korrelationsfunktion, ekv 10 .
    4. Hitta den mest sannolika värdet för medelvärdes diffusionskoefficienten ekv 11 av partiklarna av linjära minsta kvadratanpassning på ekv 12 . Omekv 10 mot ekv 13 verkar inte linjär och gå genom origo i felet, är partikelstorleksfördelningen bred och hydrodynamiska radien kommer att dåligt definierade.
    5. Beräkna genomsnittlig hydrodynamisk radie från Stokes-Einstein förhållande ekv 14 , där ekv 15 är Boltzmann-koefficienten, ekv 16 den absoluta temperaturen och ekv 17 viskositeten hos dispersionen vid ekv 16 . Propagera standardavvikelsen för ekv 11 till ekv 18 .
    6. Partikel Struktur Bestämning av statisk ljusspridning
      1. Tvätta kyvetter och glas med aceton ånga. Använd 20 mm diameter eller större kyvetter för att minimera den cylindriska linseffekten.
      2. Filter (200 nm RC-filter eller mindre) ca 20 ml dubbeldestillerat vatten till en glasflaska och överföra en droppe av renad dispersionen till flaskan. Tvätta filtret med 10 ml vatten innan det används för provberedning för att avlägsna föroreningar som återstår från tillverkningsprocessen.
      3. Ta prov mot alla omgivande ljuskällan. Om blå nyans observeras, kommer sannolikt att vara alltför koncentrerad provet. Späd därefter.
      4. Förbered bakgrunds vattenprov genom att spola kuvetten flera gånger med filtrerat vatten och därefter fylla upp till lämplig provvolym, beroende på kyvetten och laserläge i instrumentet. Lasern måste passera genom provet utan att brytas från menisken.
      5. Kalibrera instrument användning av en toluen prov.
      6. Mät vatten spridning (bakgrund) hela det tillgängliga vinkelområdet.
      7. Mäta spridningsintensiteten från provet genom hela det tillgängliga vinkelområdet företrädesvis vid flera våglängder. Spridningsmönster normaliserad till den framåtriktade spridningsintensiteten är känt som formfaktorn.
      8. Om partikelstruktur är känd, använd lämplig modell uttryck för att beräkna den globala passa på datamängder som uppmätts vid olika våglängder.
      9. För okända partikelstruktur användning reglerats direkt (såsom FitIt! 33) eller en mer allmän indirekt invers Fourier-trans 21,22 rutin i samband med dekonvolution av fördelningsfunktionen paret avstånd (endast för sfäriska partiklar) 23,24 för automatisk klassificering av partikel typ.
      10. Vid montering eller inversion rutin ger en uppskattning av funktion partikel radie fördelningen, beräkna polydispersitetindex (standardavvikelsen för fördelningen dividerat med dess medelvärde).

    3. Partikel Spårning av brett fält fluorescensmikroskopi

    OBS: Tracer och matrispartiklar av 465 ± 7 nm och 405 ± 7 nm hydrodynamiska radier vid 20 ° C, respektive, användes för spårning partikel.

    1. prov~~POS=TRUNC
      1. Förbereda koncentrerad matris mikrogel dispersion genom återdispergering känd mängd av lyofiliserad omärkt mikrogel till känd mängd av dubbeldestillerat vatten. Tillsätt en liten volym av märkta spårpartiklar.
      2. Bekräfta lämplig spår mikrogelen koncentration i mikroskop. Den optimala koncentrationen är en kompromiss mellan samtidiga förvärv av maximalt antal spår, samtidigt som spårämneskoncentrationen låg nog så att sannolikheten för att de spårpartikelspåren korsar under förvärvet är försumbar.
      3. Förbereda koncentrerade dispersioner genom indunstningvatten i en ugn. Bestämma viktkoncentration genom att jämföra vikten av dispersionen till den ursprungliga vikten av provet före indunstning.
    2. Datainsamling och analys
      1. Använd en lämplig objektiv av önskad förstoring och öppning för excitation av spårämnen och samtidig fluorescens samling från provet. I detta arbete, använd en 100X / 1,3 NA oljeimmersionsobjektiv.
      2. Placera fuktkammaren på en xyz-piezo tabell, som passar in i en kommersiell mikroskop.
      3. För att förhindra att provet torkar, placera en plasma rengöras täckglas i fuktkammaren och pipett 10 ul av poly (NIPAM) spridning av den önskade koncentrationen på halka.
      4. Beroende på excitations- och emissionsspektra av det fluorescerande färgämnet, använd en lämplig laser för excitation och justera lasereffekten på lämpligt sätt. Intensiteten bör vara tillräckligt låg för att undvika snabb fotoblekning av färgämnena, men vidsamtidigt stark nog för noggrann enda partikel positionering (se nedan). I detta arbete använder en 561 nm diodpumpade solid-state laser och hålla lasereffekten konstant vid 16 mW (ca 0,5 kW cm -2 på provet) för alla mätningar.
      5. För att erhålla homogent prov belysning, använd den kritiska belysning installationen som beskrivs här. För detta par lasern i en multimodfiber (NA 0,22 ± 0,02, kärna 0,6 mm diameter), skaka fibern med hjälp av en virvel för att tidsmässigt genomsnittliga ut laser prickar och projicera fiberänden in i provplanet.
      6. Kalibrera z avståndet från återreflektion av locket glida och fokus flera mikrometer in i provet genom att flytta målet något uppåt och fixera z-positionen med användning av en z-kompensator. Detta undviker eventuella effekter gränssnitt med täckglas.
      7. Justera detektorparametrar, såsom exponeringstid, till styrkan hos den fluorescenssignal. I detta fall, använd en EMCCD kameramed exponeringstid av 0,1 sek, elektron multiplicera läge och vinst på 50.
      8. Förvärva flera filmer med ett lämpligt antal av ramar att erhålla adekvat fördröjningstid för att beräkna medelkvadrat förskjutningen av mikrogeler i olika regioner i provet. I detta arbete använder förvärvs ramnummer av 500 eller 1000 ramar.
      9. Analysera data genom att placera partiklarna i varje bildruta med hjälp av Gauss montering 25 och använda en lämplig partikelspårningsalgoritmen 26 för att erhålla medelkvadrat förflyttningen. 27 Beräkna medelvärden och standardavvikelsen med medelvärdet över alla spår i alla filmer. Beräkna de långa fördröjning diffusionskoefficienter av linjär regression från ekv 19 , var ekv 20 är medelkvadrat förskjutning, D medel diffusionskoefficienten och t fördröjningstiden.
      10. estiMate den anomali parametern γ från avvikande diffusionsekvationen ekv 21 genom att omvandla data till logaritmisk skala, vilket gav ekv 22 . Anomalin parametern ekv 23 ges av derivatet i handlingen. Derivatet kan uppskattas genom de finita differenser av datapunkterna, eller anpassning datapunkterna genom polynomfunktioner och differentiera analytiskt. Bestäm tillräcklig grad av polynomanpassning funktioner genom att rita de passar rester och kvarvarande norm för att öka polynom ordning.
      11. Upprepa samma procedur för olika koncentrationer av mikrogelen matriser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antalet PNIPAM mikrogelpartiklar i partiet, och därmed den slutliga partikelvolymen, bestäms i början av reaktionen under kärnfasen 20 Hydrofob sammonomer färgämne metakryloxietyl tiokarbamoyl rodamin B påverkar kärn genom att minska partikelantal tätheten i partiet. Minskningen i partikelkoncentration för två olika initiala NIPAM koncentrationer kan ses som ökning av den genomsnittliga slutliga partikelvolym i hopfällt tillstånd med ökande färgämneskoncentration, visas i Figur 1. Volymökningen kan tillskrivas den hydrofoba sammonomeren färgämne, vilket främjar mikrogel kärnor aggregering vid tidiga reaktionstider, minskar partikelkoncentrationen och öka den slutliga partikelvolymen.

Resultat från en framgångsrik DLS measurements visas i figur 2. För sex minsta slutliga partikelvolym satser linjärt beroende av medelvärdet dämpfaktorn Γ 2 på q 2 och noll y-skärnings inom felet indikerar att partikelstorleksfördelningar för dessa satser är relativt smala och en väl -defined uppskattning för medelvärdes diffusionskoefficienten kan erhållas från lutningen av den linjära passform. Figur 3 visar en mer komplicerad resultat från de två största volym satser, där Γ 2 avviker från den linjära beteende i det mellanliggande q intervallet. Den icke-linjäritet kommer från den formfaktor (vinkelspridningsmönster) minimum som sammanfaller med dessa Q-värden. 28 Fenomenet ifråga kan observeras för partiklar med dimensioner som är jämförbara med våglängden hos den infallande laserstrålningen och till och med en måttlig partikelstorleksfördelning bredd. Fastställande av diffusionskoefficienten i denna q figur 3, Γ två speglar den genomsnittliga beteendet igen med hög q, där alla partikelstorleksfraktioner bidrar jämnare till den totala spridda intensiteten. Ett enkelt sätt att få en rimlig uppskattning av medel diffusionskoefficienten är att utesluta mellan Γ 2 värden från linjär anpassning. Om formfaktor av partiklarna är kända, kan en noggrannare passande metod användas 28.

Bestämning av hydrodynamiska volymen i det sammanfallna tillståndet utan att låta proverna svalna under PNIPAM VPTT säkerställer att den icke-gelade sol fraktion som inte har lossnat från partiklarna. Därför volymen i hopfällt tillstånd återspeglar massa och antal av partiklarna under polymerisationen, vilket är viktigt om den Fundamental egenskaperna hos utfällningspolymerisation utreds 20. Volym i det hopvikta tillståndet ger också en god kvalitet för att jämföra olika reaktionsparametrar, eftersom det är oberoende av de svällande egenskaper och den fraktion av icke-gelad polymer i partiklarna som regleras av mängden tvärbindare i monomerblandningen. Mindre storlek och högre spridnings kontrast i hopfällt tillstånd underlättar också DLS karakterisering.

Statisk ljusspridning data som mäts vid två våglängder på 642 nm och 404 nm för de matris och tracerpartiklar visas i Figur 4 Visuell inspektion av de vinkelspridningsmönstren avslöjar att partiklarna är väldefinierade:. Flera stående svängningar är typiska för sfäriska partiklar i hela q indikerar smal polydispersitet, i detta fall 7% respektive 6% för spår och matris mikrogeler, respektive. slät behavior vid låg q indikerar att proven är tillräckligt utspädda och ingen signifikant partikelaggregation är närvarande. Ökningen av spridda intensiteten vid extrem q kan hänföras till spridningen på grund av back reflekterade strålen från den inre kyvett väggen. Inversion av formfaktorer matrispartiklarna bekräftar typiska mikrogel struktur 29 med tät kärna och radiellt ruttnande densitetsprofilen från tvärbindande sampolymerisation kinetik 30 (se infälld bild). Den streckade linjen visar den formfaktor av referens hårt sfär med samma medeltröghetsradie som matrispartiklarna. Den experimentella formfaktor avtar snabbare med q än den hårda sfären formfaktor, som är typisk för partiklar med luddig yta. Däremot spårpartiklar uppvisar okonventionella mikrogel struktur. Detta kan också ses från referens hård sfär formfaktor, vilket visar att den experimentella formfaktor gör från början inteavklinga snabbare än referensen. Detta resultat visar att innehåller färgämnesmolekyler till mikrogeler kan påverka deras struktur, som måste beaktas vid tolkningen av resultaten.

Den höga likformighet av syntetiserade partiklarna är av stort intresse för studier av deras spridning på volymfraktioner runt glasövergångstemperaturen för att exakt bestämma utvecklingen beteende i denna regim 13, och jämför det med hårda partiklar 31. Därför var en låg fraktion av märkta mikrogeler blandas med icke-märkt mikrogel av jämförbar storlek. Excitation och emissionsspektra hos mikrogelpartiklar-införlivad färgämnesmolekyler tillsammans med excitationsvåglängden och filterkonfiguration som används i banan utsläpps presenteras i figur 5. Absorbans och emissionsmaxima av metakryloxietyl tiokarbamoyl rodamin B är nära att excitationsvåglängd och fluorescensuppsamlingsintervall,respektive, vilket möjliggör hög avskiljningsgrad i spårningspartikel installationen. Tidsutvecklingen för medelkvadrat förskjutning för spårämnes mikrogeler i olika icke-märkt mikrogelpartiklar matriskoncentrationer visas i figur 6 och figur 7 i linjära och logaritmisk skala, respektive. Vid låga matriskoncentrationer mikrogelpartiklar de spår partiklarna diffunderar snabbt. Trots att de syns bara för ett begränsat antal ramar innan man går ut ur fokus planet, är det möjligt en relativt god uppskattning av deras medelkvadrat förskjutningar. Den linjära ökningen av medelkvadrat förskjutning med tiden indikerar normal diffusion beteende för alla ledtider mäts. Men för mikrogelpartiklar koncentrationer som ligger nära den kolloidala glasövergångs, dvs 29-36 mg / ml, blir tidsutvecklingen av medelkvadrat förskjutningar icke-linjär (se figur 7). Beteendet liknar en av kolloidalt mikrometerstora PMMA partiklar som fallanderibed av Weeks och Weitz 31 och kan relateras till buren effekten. Som visas schematiskt i figur 10, kan en märkt mikrogel i en tät matris diffunderar ganska fritt i buren. Av den anledningen ökar medelkvadrat förskjutning linjärt i de första få millisekunder. Eftersom partiklarna fastnar i transienta burar som bildas av sina grannar, är det nödvändigt med en kollektiv ombildning av de omgivande mikrogeler för mikrogeler att gå vidare. Denna bur effekt yttrar sig i en ganska ytlig lutning i det andra området i figur 7, och kan även bekräftas genom att inspektera de partikelspåren i figur 9. Vid korta ledtider partiklarna litegrann i sina burar, varifrån de kommer undan bara för att få instängd igen. Vid långa fördröjningstider, är det linjära diffusion beteende utvanns. Bur effekter kan analyseras med hjälp anomala diffusionsmodeller där tidsutvecklingen av de (två-dimensionellt detekteras) mean square displacement uttrycks av en potensfunktion i tid: ekv 24 eller i logaritmisk form ekv 25 med anomali parametern ekv 26 32. För normal diffusion, är lika med den anomali parametern 1, subdiffusion representeras av värden under 1. Figur 8 visar tidsutvecklingen av anomali parametern direkt bestämmas från lutningen i log-log-plot Figur 7. Vid lägre koncentrationer av mikrogeler i vår studie, anomalin parametern som motsvarar i grunden till 1. för fördröjningstider ekv 27 i området av flera sekunder, avviker faktorn från en mot lägre värden. Detta beteende är en artefakt på grund av att den axiella (z) observationsintervall i brett fält mikroskopi är begränsad till endast ett fåtal mikrometer. Den smala z-intervall förspänner analys för snabb spridning vid långa tidsintervall för att snabbt spridande spårämnen vid låga matriskoncentrationer. Vid ökning av mikrogelen koncentration, finner vi att den minsta av anomali parameter blir mycket mer uttalad och övergången till normal diffusion ( ekv 28 ) Visas senare. Detta är en tydlig indikation på buren effekt visas för täta mikrogeler system när man närmar sig sin glasövergångsregim.

Figur 1
Figur 1:. Enda partikel volym i hopfällt tillstånd med inledande färgämneskoncentration i satsen Två slags NIPAM koncentrationer användes, 57,5 mmol dm -3 (svarta cirklar) och 28,8 mmol dm -3 (grå rektanglar). 1 mol-% av tvärbindningsmedlet användes. Initial KPS koncentration var densamma i alla batches på 1,56 mmol dm -3. Felstaplar betecknar standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Decay takt med kvadraten på spridningsvektor storlek för de fyra minsta volym mikrogelpartiklar partier linjärt beroende av. ekv 29 på q 2 och nollskärnings indikerar snäv partikelstorleksfördelning och indikerar att väldefinierad uppskattning av medelvärdet diffusionskoefficienten kan beräknas från lutningen av den linjära passform. NIPAM koncentrationer var 57,5 mmol dm -3 (röda fyrkanter och apelsin inverterade trianglar) och 28,8 mmol dm -3 (resten av symbolerna). Dye koncentrationer var 0,044 mmol dm -3 (röda fyrkanter), 0,022 mmol dm -3 (orange inverterade trianglar), 0,088 mmol dm -3 (gröna trianglar), 0,066 mmol dm -3 (cyan romber), 0,044 mmol dm -3 (mörkblå trianglar), och 0,022 mmol dm -3 (rosa cirklar). klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Dämpfaktor med kvadraten på spridningsvektor storlek för de två största volym partier icke-linjärt beteende av Γ 2 med q 2 i den centrala q intervallet orsakas av förändringar i intensiteten viktningen av signalen av olika storleksfraktioner i närheten av den formfaktor minimum. NIPAM koncentration i båda satserna var 57,5 ​​mmol dm-3, Färgämneskoncentrationerna 0,088 mmol dm -3 (svarta cirklar) och 0,066 mmol dm -3 (röda trianglar). Faded symboler uteslöts från linjär anpassning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Form faktorer märkt tracer och omärkta matrispartiklar för både partiklar formfaktorn mättes vid två våglängder, 642 nm (ljusblå och röda datapunkter) och 404 nm (grön och mörkblå datapunkter).. Heldragna linjer är globala passar till 642 nm och 404 nm datamängder. Streckade linjerna visar formfaktorer av hårda sfär referens partiklar med samma tröghetsradier som matris och spårpartiklar (orange och grönt streckade linjer, respektive.) Inlägg visar normaliserade partikeldensitetsprofiler från kärnan till ytan beräknas t.ex. FitIt! Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5:. Excitation och emissionsspektra för fluorescensmärkt mikrogelpartiklar Blue linje markerar excitations- och röd linje emissionsspektrum. Fast vertikal linje är excitationsvåglängden. Skuggade området betecknar fluorescensuppsamlingsvåglängdsområdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6: Genomsnittlig kvadrat displacement med fördröjning för spårpartiklarna. Omärkt matris mikrogelpartiklar koncentrationerna var 15,56 mg / ml (till vänster), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml och 35,35 mg / ml. Punkter och felstaplar betecknar experimentella värden och standardavvikelse, respektive. Heldragna linjer är linjära passar till datapunkterna. Infällda bilden visar ett brett fält fluorescens mikroskop av spår mikrogeler på 35,35 mg / ml matriskoncentration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7:. Mean square förskjutning med fördröjning för spår partiklarna i logaritmisk skala Omärkt matris mikrogelpartiklar koncentrationer var 15,56 mg / ml (till vänster), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml och 35,3 5 mg / ml. Punkter och felstaplar betecknar experimentella värden och standardavvikelse, respektive. Heldragna linjer är polynom passar till datapunkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8:. Anomaly parametrar med fördröjning för spårpartiklar Omärkt matris mikrogelpartiklar koncentrationer var 15.56 mg / ml (till vänster), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml och 35,35 mg / ml. Punkter representerar derivat uppskattas av finita differenser och heldragna linjer analytiskt beräknade derivat från polynomet passar i figur 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 9
Figur 9:.. Partikel spår för 12 spår mikrogeler i dispersion med 35,35 mg / ml matriskoncentration Kluster av spår till distinkta blobbar resultat från spår s partiklar fastnar i transienta burar som bildas av de omärkta grannar Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10
Figur 10:. Schematisk illustration av spårämne mikrogel diffusion i koncentrerad omärkt matris mikrogel dispersion Röd bana betecknar snabb diffusion av de spårämnen inom de transienta burar (blå streckad linje) som bildas av de närliggande partiklarna. Blå bana betecknar lång fördröjning timig diffusion möjliggörs genom kollektiva ombildning av övergående burar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 11
Figur 11:. Lång fördröjning diffusionskoefficienter med omärkt matris mikrogel koncentration vid låg matriskoncentrationen spridningen av spår mikrogeler inte påverkas av matrispartiklarna. Med ökande matris mikrogel koncentrationen länge diffusion saktar ner tiopotenser eftersom diffusion kräver kollektiva ombildning av övergående burar, där spår är fångade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tillsats av små mängder av funktionell sammonomer kan ha en betydande effekt på partikelstorlek och struktur PNIPAM härrör mikrogeler. Samtidig småskaliga provrör polymerisation är en bra metod för att redogöra för sådana förändringar, och hjälper till att snabbt hitta rätt reagerande kompositioner för mål partikelstorlek för uppskalning reaktionen efter behov. Massan av partiklarna är approximativt exponentiellt beroende av polymerisationstemperaturen när termiskt sönder initiator, såsom KPS, används för 20, och behöver därför en att upprätta stabil och exakt temperaturreglering inuti reaktorn för god reproducerbarhet. Slutliga partikelvolymer från konventionell satsvis reaktion och icke-omrörda reaktions är typiskt i god överensstämmelse om en minimerar satsvis syntes relaterade störningar, såsom för våldsam omrörning av reaktionsblandningen för att evsv ut temperaturgradienter i den stora reaktorn, eller med hjälp av överdriven mängd initiatorlösning så att ändringarna reaktionstemperaturen under initieringen perioden.

Dynamisk ljusspridning är en väletablerad och snabb metod för att bestämma diffusion beteende stort antal partiklar in situ. Det är emellertid väsentligt att förvärva data vid multipel spridning vinklar. DLS mätningar vid en godtycklig vinkel, vilket sammanföll med en formfaktor minimum eller i fallet med bred storleksfördelning, kommer att leda till en skenbar diffusionskoefficient signifikant skiljer sig från medelvärdet diffusionskoefficienten av provet. Sådana fall kan kännas igen från icke-linjärt beteende i Γ 2 vs. q 2 tomt. För att lösa breda eller multimodala partikelstorleksfördelningar, kan man försöka använda en invers Laplace transformation algoritm såsom CONTIN 34. DLS är dock inte idealisk för detta ändamål på grund av dåligt rade nature av inversions problemet.

För både dynamisk och statisk ljusspridning proverna måste vara tillräckligt utspädda för att undvika multipel spridning, som ogiltigförklarar rutinen dataanalys. För formfaktor bestämning av SLS också brytningsindexskillnaden av partiklarna och lösningsmedel måste vara låg för att undvika Mie spridning, vilket förhindrar enkel formfaktor analys. Detta villkor är uppfyllt när ekv 30 , var ekv 31 är den genomsnittliga partikelradie och ekv 32 skillnaden mellan brytningsindex för lösningsmedel och partiklar. För mikrogeler utför svällda med lösningsmedel detta kriterium är uppfyllt, men i allmänhet har partiklarna vara kontrast matchas med tillräckligt högt brytningsindex lösningsmedel. Mie spridning kan kännas igen från utsmetning tHan formfaktor minima, en effekt som minskar när brytningsindexskillnaden minskar.

Ljusspridande förfaranden tillhandahåller ensemble genomsnitt informationen, medan brett fält spårning partikel kan användas för att undersöka diffusionen beteendet hos enskilda partiklar i verkliga rymden. I motsats till partikelspårning baserad på ljusspridning, den höga känsligheten hos fluorescens möjliggör spårning av små partiklar och, i extremfallet, till och med enskilda molekyler. Dessutom kan förhållandet mellan märkta och icke-märkta partiklar anpassas för att mäta exakt även i höggradigt koncentrerade lösningar. Partikelspårning ger därför en modell fritt sätt att avgöra diffusionskoefficienten och diffusion läge av kolloider på plats även möjliggör en jämförelse mellan de beteenden av enskilda partiklar. Localization noggrannhet av enskilda spårämnen är typiskt bättre än diffraktionsgränsen men beror på signal-till-brus-förhållandet mellan fluorescens signal av enstaka partiklar på det breda fält setup. Således är märkning med färgämnen som uppvisar ett högt kvantutbyte, god fotostabilitet och ett absorptionsmaximum nära excitationsvåglängden en förutsättning för goda resultat. Spårämneskoncentrationen har att hållas låg för att minimera korsning av banorna för olika partiklar stör spårningsalgoritmen. För koncentrerade dispersioner kan densiteten av fluorescerande spårämnen justeras genom blandning av märkta och icke-märkta partiklar. Senaste arbete på punktspridningsfunktion teknik möjliggör 3D partikel spårning 35,36, som kan användas för att undersöka anisotropisk diffusion i olika riktningar i rymden.

Sammanfattningsvis, exakt DLS karakterisering och småskalig provrör polymerisation ge robust ramverk för hög precision tuning av mikrogel slutliga partikelvolym. Ljusspridning och spårning fluorescens partikel tekniker ger kompletterande information om ensemblen ochenda partikel diffusion beteende över bred spridning koncentrationsområde. Kombinationen av syntesen av väldefinierade mjuka partiklar med möjlighet att spåra dem i lösningar av olika koncentration kommer att vara av stor betydelse för utredningen av dynamiken i mjuka partikelsystem och en jämförelse med väl studerade hårt kolloid system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone VWR Chemicals KRAF13455
Bisacrylamid AppliChem A3636
n-Hexane Merck 104374
N-Isopropylacrylamide Fisher Scientific AC412785000 recrystallized from n-hexane
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B Polysciences 23591
Potassium peroxodisulfate Merck 105091
Silicone oil 47 V 350 VWR Chemicals 83851
Toluene Sigma Aldrich 244511
F12 Refrigerated/heating circulator Julabo 9116612
Microscope Olympus IX83
XY(Z) Piezo System Physik Instrumente P-545.3R7
100X Oil immersion objective Olympus UPLSAPO
QuadLine Beamsplitter AHF Analysentechnik F68-556T
Cobolt Jive 150 laser Cobolt 0561-04-01-0150-300
Multimode Fiber Thorlabs UM22-600
iXON Ultra 897 EMCCD camera Andor DU-897U-CS0-BV
Laser goniometer SLS Systemtechnik Mark III
CF40 Cryo-compact circulator Julabo 9400340
Laser goniometer system  ALV GmbH ALV / CGS-8F
Multi-tau corretator ALV GmbH ALV-7004
Light scattering electronics ALV GmbH ALV / LSE 5004
Photon counting module PerkinElmer SPCM-CD2969 2 units in pseudo cross-correlation mode
633 nm HeNe Laser JDS Uniphase 1145P
F32 Refrigerated/heating circulator Julabo 9312632

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelton, R. Temperature-sensitive aqueous microgels. Adv. Colloid Interfac. 85, 1-33 (2000).
  2. Pich, A., Richtering, W. Microgels by Precipitation Polymerization: Synthesis, Characterization and Functionalization. Adv. Polym. Sci. 234, 1-37 (2010).
  3. Richtering, W. Responsive Emulsions Stabilized by Stimuli-Sensitive Microgels: Emulsions with Special Non-Pickering Properties. Langmuir. 28 (50), 17218-17229 (2012).
  4. Wiese, S., Spiess, A. C., Richtering, W. Microgel-Stabilized Smart Emulsions for Biocatalysis. Angew. Chem. Int. Edit. 52 (2), 576-579 (2012).
  5. Schmitt, V., Ravaine, V. Surface compaction versus stretching in Pickering emulsions stabilised by microgels. Curr. Opin. Colloid In. 18 (6), 532-541 (2013).
  6. Wellert, S., Richter, M., Hellweg, T., von Klitzing,, R,, Hertle, Y. Responsive Microgels at Surfaces and Interfaces. Z. Phys. Chem. 229 (7-8), 1-26 (2015).
  7. Li, Z., Harbottle, D., Pensini, E., Ngai, T., Richtering, W., Xu, Z. Fundamental Study of Emulsions Stabilized by Soft and Rigid Particles. Langmuir. 31 (23), 6282-6288 (2015).
  8. Deshmukh, O. S., van den Ende, D., Stuart, M. C., Mugele, F., Duits, M. H. G. Hard and soft colloids at fluid interfaces: Adsorption, interactions, assembly & rheology. Adv. Colloid Interfac. 222, 215-227 (2015).
  9. Serpe, M. J., Kim, J., Lyon, L. A. Colloidal Hydrogel Microlenses. Adv. Mater. 16 (2), 184-187 (2004).
  10. Schmidt, S., Zeiser, M., Hellweg, T., Duschl, C., Fery, A., Möhwald, H. Adhesion and Mechanical Properties of PNIPAM Microgel Films and Their Potential Use as Switchable Cell Culture Substrates. Adv. Func. Mater. 20 (19), 3235-3243 (2010).
  11. Xia, Y., He, X., et al. Thermoresponsive Microgel Films for Harvesting Cells and Cell Sheets. Biomacromolecules. 14 (10), 3615-3625 (2013).
  12. Guan, Y., Zhang, Y. PNIPAM microgels for biomedical applications: from dispersed particles to 3D assemblies. Soft Matter. 7 (14), 6375 (2011).
  13. Yunker, P. J., Chen, K., Gratale, M. D., Lohr, M. A., Still, T., Yodh, A. G. Physics in ordered and disordered colloidal matter composed of poly(N-isopropylacrylamide) microgel particles. Rep. Prog. Phys. 77 (5), 056601-056629 (2014).
  14. Lohr, M. A., Still, T., et al. Vibrational and structural signatures of the crossover between dense glassy and sparse gel-like attractive colloidal packings. Phys. Rev. E. 90 (6), 062305 (2014).
  15. Dreyfus, R., Xu, Y., Still, T., Hough, L. A., Yodh, A. G., Torquato, S. Diagnosing hyperuniformity in two-dimensional, disordered, jammed packings of soft spheres. Phys. Rev. E. 91 (1), 012302-012312 (2015).
  16. Kojima, H., Tanaka, F. Reentrant volume phase transition of cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) gels in mixed solvents of water/methanol. Soft Matter. 8 (10), 3010-3011 (2012).
  17. Hofmann, C. H., Plamper, F. A., Scherzinger, C., Hietala, S., Richtering, W. Cononsolvency Revisited: Solvent Entrapment by N-Isopropylacrylamide and N, N-Diethylacrylamide Microgels in Different Water/Methanol Mixtures. Macromolecules. 46 (2), 523-532 (2013).
  18. Bischofberger, I., Calzolari, D. C. E., Trappe, V. Co-nonsolvency of PNiPAM at the transition between solvation mechanisms. Soft Matter. 10 (41), 8288-8295 (2014).
  19. Virtanen, O. L. J., Richtering, W. Kinetics and particle size control in non-stirred precipitation polymerization of N-isopropylacrylamide. Colloid Polym. Sci. 292 (8), 1743-1756 (2014).
  20. Virtanen, O. L. J., Ala-Mutka, H. M., Richtering, W. Can the Reaction Mechanism of Radical Solution Polymerization Explain the Microgel Final Particle Volume in Precipitation Polymerization of N-Isopropylacrylamide? Macromol. Chem. Phys. 216 (13), 1431-1440 (2015).
  21. Glatter, O. A new method for the evaluation of small-angle scattering data. J. Appl. Crystallogr. 10 (5), 415-421 (1977).
  22. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. J. Appl. Crystallogr. 25 (4), 495-503 (1992).
  23. Glatter, O. Convolution Square Root of Band-Limited Symmetrical Functions and Its Application to Small-Angle Scattering Data. J. Appl. Crystallogr. 14, 101-108 (1981).
  24. Glatter, O., Hainisch, B. Improvements in Real-Space Deconvolution of Small-Angle Scattering Data. J. Appl. Crystallogr. 17, 435-441 (1984).
  25. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative Comparison of Algorithms for Tracking Single Fluorescent Particles. Biophys. J. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  26. Wöll, D., Kölbl, C., Stempfle, B., Karrenbauer, A. A novel method for automatic single molecule tracking of blinking molecules at low intensities. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (17), 6196-6205 (2013).
  27. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Bioph. Biom. 26, 373-399 (1997).
  28. Pusey, P. N., van Megen, W. Detection of small polydispersities by photon correlation spectroscopy. J. Chem. Phys. 80 (8), 3513 (1984).
  29. Stieger, M., Pedersen, J. S., Richtering, W., Lindner, P. Small-angle neutron scattering study of structural changes in temperature sensitive microgel colloids. J. Chem. Phys. 120 (13), 6197-6206 (2004).
  30. Wu, X., Pelton, R. H., Hamielec, A. E., Woods, D. R., McPhee, W. The kinetics of poly(N-isopropylacrylamide) microgel latex formation. Colloid Polym. Sci. 272, 467-477 (1994).
  31. Weeks, E. R., Weitz, D. A. Subdiffusion and the cage effect studied near the colloidal glass transition. Chem. Phys. 284 (1-2), 361-367 (2002).
  32. Ernst, D., Köhler, J., Weiss, M. Probing the type of anomalous diffusion with single-particle tracking. Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (17), 7686-7691 (2014).
  33. Virtanen, O. L. J. FitIt! (Version 1.1.4). , Available from: https://www.github.com/ovirtanen/fitit (2015).
  34. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method For Inverting Data Represented By A Linear Algebraic or Integral Equations. Comput. Phys. Commun. 27 (3), 213-227 (1982).
  35. Holtzer, L., Meckel, T., Schmidt, T. Nanometric three-dimensional tracking of individual quantum dots in cells. Appl. Phys. Lett. 90 (5), 053902-053904 (2007).
  36. Diezmann, A. V., Lee, M. Y., Lew, M. D., Moerner, W. E. Correcting field-dependent aberrations with nanoscale accuracy in three-dimensional single-molecule localization microscopy. Optica. 2 (11), 985-989 (2015).
  37. Neutrons, X-rays and Light: Scattering Methods Applied to Soft Condensed Matter. Lindner, P., Zemb, T. , North Holland Delta Series. Amsterdam. (2002).

Tags

Kemi poly (N-isopropylakrylamid) utfällningspolymerisation fluorescensmärkning mikrogeler ljusspridning partikelspårning fluorescensmikroskopi
Kontrollerad Syntes och Fluorescence Spårning av mycket jämn Poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Mikrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Virtanen, O. L. J., Purohit, A.,… More

Virtanen, O. L. J., Purohit, A., Brugnoni, M., Wöll, D., Richtering, W. Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels. J. Vis. Exp. (115), e54419, doi:10.3791/54419 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter