Protocol
1. التحلل البروتيني وتحليل Myoglobins المرجعي
- التحلل البروتيني من myoglobins المرجعية
- إعداد حلول للmyoglobins إشارة تنقيته (المدى 0،2-0،5 ملغ / مل في بيكربونات الأمونيوم 25 ملم) 3.
- نقل 1 مل aliquots من كل عينة إلى 2 مل أنابيب الطرد المركزي.
- حراريا تفسد البروتينات المستخرجة عن طريق تسخين العينة في كتلة ساخنة في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تبريد عينة لحوالي 15 دقيقة حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 30 ملغ من اليوريا (تركيز النهائي 0.5 M) لتعزيز عملية الهضم، ثم المزيج.
- التحلل البروتيني زيتية
- يعد حل 1 ملغ / مل من التربسين في بيكربونات الأمونيوم 25 مم وتخزينها على الجليد كما هو مطلوب. إضافة كمية كافية من التربسين مثل أن نشاط انزيم النهائي هو 420 BAEE (بيروكسايد-L-أرجينين N- إيثيل استر هيدروكلوريد) وحدة / ملغ من البروتين المستخرج، ثم مزيج من قبل vortexing لطيف، والسماح لproteolyze بين عشية وضحاها في 37 ° C.
- تنفيذ دوديسيل الصوديوم بولي أكريلاميد كبريتات الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) 17 للتدليل على اكتمال التحلل البروتيني.
- إزالة الأملاح من العينة بعد التحلل البروتيني
- تمييع عينة 1: 2 ت: الخامس مع الماء.
- تفعيل البوليمر عكس المرحلة (RP) خرطوشة مملوءة 30 ملغ مادة RP بإضافة 1 مل من الميثانول، ثم تتوازن خرطوشة بإضافة حمض الفورميك 1 مل من 1٪.
- تحميل العينة على خرطوشة تحت الجاذبية.
- تغسل مع 1 مل من حمض الفورميك 5٪ الميثانول / 1٪ بفعل الجاذبية.
- أزل الببتيدات مع 1 مل من الأسيتونيتريل / المياه (90:10 ت: ت، حمض الفورميك 0.1٪) بفعل الجاذبية إلى 2 مل أنابيب microcentrifuge بريفيليد مع 5 ميكرولتر dimethylsulphoxide ([دمس]).
- إزالة المذيب تحت فراغ عند 50 درجة مئوية باستخدام المبخر الطرد المركزي لمدة 120 دقيقة، ثم تنحل بقايا في 250 ميكرولتر أسيتونتريل / الماء (3:97 ت: ت؛ 0.1٪ حمض الفورميك).
- تحويلالحل لانخفاض حجم السيارات العينات قارورة.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للالسائل الطيف اللوني كتلة (LC / MS) التحليل.
- جيل من قوائم الانتقال لMRM
- تحديد تسلسل الميوجلوبين لاللحوم المختلفة من قاعدة البيانات يونيبروت.
- أدخل تسلسل الميوجلوبين في مربع "الهدف" من الببتيد والانتقال التنبؤ برامج (على سبيل المثال، الأفق). إذا لزم الأمر، تحوم فوق الببتيد للكشف عن قائمة جزء لها.
- انقر على 'الإعدادات' وحدد 'الببتيد إعدادات ". إدخال تفضيلات الهضم (مثل التربسين) وعدد الانشقاقات غاب (0). أدخل اختيار اللازمة لمعلمات إضافية، على وجه الخصوص، وطول الببتيد (6-25) والاستثناءات N-محطة (0) وافترض التعديلات الأحماض الأمينية (لا شيء).
- انقر على "إعدادات" ثم اختر "إعدادات الانتقالية". حدد تفضيلات لنوع الأداة المستخدمة لتحليل LC / MS.
- انقر على 'تصدير' وحدد 'قائمة الانتقال "إلى إنشاء جدول يحتوي على التحولات MRM ولدت والمعلمات.
- تحليل من قبل LC / MS
- إعداد نظام التدرج ثنائي (الماء (A) والأسيتونتريل (B)، ولكل منها 0.1٪ حمض الفورميك الخامس: الخامس) الكروماتوجرافي السائل عالي الأداء (HPLC) مع أخذ العينات السيارات، C18 عمود الأساسية قذيفة HPLC (10 سم × 2.1 مم ، و 2.6 ميكرومتر حجم الجسيمات) متصلة الثلاثي رباعية مطياف الكتلة تعمل في وضع electrospray الإيجابي مع الكشف عن MRM.
- في برنامج جمع البيانات (على سبيل المثال، محلل)، اختر 'ملف' و 'الجديد' وانقر على 'طريقة اقتناء "في مربع منبثق ثم انقر على" موافق ".
ملاحظة: هذا يفتح محرر أسلوب الصك، الذي يحتوي على قائمة من الأجهزة المتصلة التي من شأنها تمكين الإعداد لLC طريقة / MS جديد. - انقر على 'مضخة ثنائي "وأناnput قيمة معدل التدفق (300 ميكرولتر / دقيقة) والأوقات التدرج في الجدول، ووضع الملف الشخصي التدرج ثنائي من 3٪ B إلى 30٪ B أكثر من 22 دقيقة، وزيادة إلى 100٪ B في 23 دقيقة لمدة 5 دقائق تزول قبل أن يعود إلى الظروف الأولية وإعادة موازنة ل6 دقيقة أخرى.
- انقر على 'الاوتوماتيكى "وإدراج حجم الحقن (5 ميكرولتر). تمكين "إبرة غسل الدراجات وأدخل" وقت الغسيل "(30 ثانية) ثم اختر 'تدفق ميناء.
- اضغط على "وحدة تحكم العمود Thermostatted" وفي "عمود فرن العقارية" تعيين "درجة الحرارة اليسار" و "درجة الحرارة الصحيحة" (40 درجة مئوية).
- انقر على 'مطياف الكتلة' ثم اضغط على 'تعديل معلمات "للدخول إلى الظروف الغاز المصدر. حدد "نوع المسح الضوئي" على أنه "MRM (MRM)" و "قطبية" على أنه "إيجابي". الذهاب إلى صفحة "ملخص الفترة" ودخول "مدة الوقت، الوقت الإجمالي لتحليل وLCد موازنة (35 دقيقة).
- في الجدول انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر "Declustering المحتملة (DP)" و "الاصطدام الطاقة (CP)" لإضافة هذه الأعمدة إلى طاولة المفاوضات. أدخل Q1، Q3، الوقت (مللي ثانية)، معرف، DP وCE القيم لجميع التحولات، وبالنسبة لأنواع اللحوم واحدة، وخلق في قائمة الانتقال (راجع الخطوة 1.4.5).
ملاحظة: الوقت (مللي ثانية) يشير إلى زمن السكون، في الوقت الذي مطياف الكتلة ينفق مسح كل انتقال، والجمع الذي يجب أن لا يتجاوز 3 ثانية. - حفظ ملف طريقة الشراء (ملف تمديد .dam).
ملاحظة: الخطوات 1.5.2 - 1.5.8 حاجة لتكرارها لكل أنواع اللحوم. وهذا إنشاء ملف طريقة واحدة لكل أنواع اللحوم في وضع الشاشة استعدادا لتحليل أدناه. - في برنامج جمع البيانات، اضغط على "اكتساب" واختر "توازن". في المربع الذي يفتح، حدد المطلوبة طريقة الشراء للبدء في موازنة الصك.
- ضع قارورة العينة في عACK في العينات السيارات.
- انقر على 'ملف' ثم اختر 'جديد' ثم 'دفعة اقتناء ". في علامة التبويب "عينة" واختر "إضافة مجموعة 'ثم' إضافة عينات. أدخل إلى تحليل عدد من العينات وانقر على "موافق". في مربع "اكتساب" حدد الملف طريقة التي سيتم استخدامها لتحليل من القائمة المنسدلة.
- في الجدول، حدد "رمز لوحة" وحدد التكوين صينية المناسب من القائمة المنسدلة. انقر على اليسار في 'لوحة كود "رأس العمود ثم النقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر" ملء داون. في "فيال الوظيفة" إدخال موقف كل عينة في العينات السيارات في الصفوف.
- في "ملف بيانات" أدخل اسم ملف لاقتناء، انقر فوق ثم ترك في رأس العمود تليها فوق الحق واختر 'ملء داون. في 'اسم نموذج' إدراج هوية كل من عينات لتحليلها. حفظ كملف اكتساب دفعة (ملف البريدXTENSION .dab).
- انقر على علامة التبويب "إرسال" ثم تسليط الضوء على العينات التي تحتاج إلى تحليل على LC / MS. انقر على "إرسال". انقر على "اكتساب" و "ابدأ عينة" لبدء تحليل.
ملاحظة: كل طريقة الشراء بالبحث عن التحولات MRM عبر كامل طول اللوني لأنواع اللحوم واحدة. تختلف إعدادات مطياف الكتلة لاكتساب MRM وفقا لنوع الصك والببتيد. - عرض ملفات البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج عرض البيانات. انقر على XIC (الأيونات المستخرجة) وفي القائمة المنسدلة تسليط الضوء على جميع أجزاء (قيم Q3) لالسلائف واحد (Q1). سيتم فتح الجزء الجديد الذي يظهر فقط في التحولات المحدد.
- تسجيل الوقت الاحتفاظ (R ر) لمجموعة من التحولات المتزامنة لأن هذه تتوافق مع الببتيد واحد.
- كرر الخطوتين السابقتين لكل مجموعة من التحولات من أجل تعيين القمم لالببتيدات كل منهما لكلمن أنواع اللحوم.
- تسجيل الببتيدات علامة التي هي مناسبة لتوفير تحديد الأنواع (على سبيل المثال، الببتيد HPGDFGADAQGAMTK، السلائف م / ض = 752، ص ر = 12.0 دقيقة، للحصان)، جنبا إلى جنب مع أوقات الاحتفاظ بها، والتي لاحظ شكل أزواج مناسبة لتحديد الكميات النسبية المقابلة .
ملاحظة: على سبيل المثال، الببتيد علامة الحصان (السلائف م / ض = 752) لديه الببتيد لحم البقر المقابلة، HPSDFGADAQAAMSK (السلائف م / ض = 767، ص ر = 13.2 دقيقة). - من أجل إنشاء أسلوب ديناميكي واحد يشمل جميع أنواع اللحوم، في البرنامج مشاهدة البيانات، لكل أنواع اللحوم في المقابل، فتح بيانات XIC الانتقال لكل السلائف (المخصصة للببتيد خاص في 1.5.8).
- تكبير الكتلة الذروة في الوقت الاحتفاظ اختيارهم من قبل اليسار النقر والسحب المؤشر تحت الكتلة. التعرف على التحولات الأكثر كثافة (عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على قمة التسمية).
- تسجيل التحولات يدوياومرات الاحتفاظ في جدول بيانات.
- للدخول المعلمات كوسيلة ديناميكية جديدة على LC البرمجيات / MS، انقر على 'مطياف الكتلة' ثم اضغط على 'تعديل معلمات "لدخول الظروف الغاز المصدر. حدد "نوع المسح الضوئي" على أنه "MRM (MRM)" و "قطبية" على أنه "إيجابي".
- الذهاب إلى صفحة "ملخص الفترة"، وأدخل الوقت المدة (على النحو الوقت الإجمالي لتحليل LC وموازنة). في الجدول انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر "Declustering المحتملة (DP)" و "الاصطدام الطاقة (CP)" لإضافة هذه الأعمدة إلى طاولة المفاوضات.
ملاحظة: يشير عمود "الوقت" الآن إلى الوقت الاحتفاظ المتوقع (دقيقة) لكل الانتقالية. - في قسم "تحرير المعاملات" من LC / MS برنامج جمع البيانات، والتحقق من مربع "من المقرر MRM. إدخال Q1، Q3، الوقت (دقيقة)، معرف، DP وCE قيم التحولات التي تم إنشاؤها في جداول البيانات (1.5.21) وحفظ طريقة الشراء (سن الفيلالبريد تمديد .dam).
ملاحظة: هذه الطريقة تقلل عادة عدد MRM التحولات إلى 4 أشده لكل الببتيد ويفحص فقط عبر نافذة الوقت الاحتفاظ لكل ذروة الببتيد، مما يتيح تحسين حساسية ونوعية البيانات. وهناك طريقة "ديناميكية" هو "الاحتفاظ الموجهة الوقت النوافذ 'الطريقة، التي تسمى أحيانا الجدولة.
2. إعداد وتحليل عينات المعايرة
- استخراج خليط اللحم
- استخدام اللحوم المجمدة سابقا ثم تحويله إلى مسحوق، وإعداد مجموعة من خلطات اللحوم وزنها كميات كل من اللحوم (كتلة إجمالية تبلغ حوالي 300 ملغ) إلى 15 مل أنابيب الطرد المركزي البلاستيك.
- إضافة 4 مل من استخراج العازلة (0.15 كلوريد البوتاسيوم M + 0.15 عازلة M الفوسفات في درجة الحموضة 6.5). دوامة لمدة 30 ثانية. استخراج على شاكر المختبر في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة في 250 دورة / دقيقة.
ملاحظة: دورات / دقيقة يشير إلى حركة متذبذبة. - نقل 2 مل مناستخراج إلى أنبوب microcentrifuge 2 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 17000 ز س.
- نقل 200 مكل من طاف (حجز كمية صغيرة لفحص البروتين، انظر 2.2) في 2 مل أنابيب الطرد المركزي والجافة باستخدام المبخر الطرد المركزي (برنامج محدد سلفا: 50 درجة مئوية، مع عدم وجود تهوية و 120 مدة دقيقة).
- البروتين مقايسة
- نقل 7 مكل من طاف المحجوزة (انظر 2.1.4) في ثلاث نسخ في الآبار من 96 لوحة جيدا.
- نقل 7 مكل من سلسلة من المعايير البروتين في ثلاث نسخ، ومجموعة 0-1،0 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA)، لنفس 96 لوحة جيدا.
- إضافة 200 ميكرولتر من Coomassie بالإضافة إلى فحص البروتين الكاشف إلى كل بئر.
- بصريا مقارنة لون الآبار عينة مع المعايير البروتين للتحقق من العينات في مجموعة من المعايير المعايرة. إذا لزم الأمر، كرر مع عينة المخفف حتى يصبح في نطاق.
- ترك لوحة لشارعولمدة 3 دقائق.
- انفجر أي فقاعات التي شكلت بإبرة تحت الجلد.
- تحليل لوحة على قارئ لوحة باستخدام بروتوكول نقطة النهاية القياسي في الطول الموجي من 595 نانومتر.
- تحديد تركيز البروتين من العينات باستخدام بيانات المعايرة من المعايير البروتين.
ملاحظة: هذا مطلوب لحساب كمية التربسين المستخدمة في هضم زيتية.
- التحلل البروتيني من خليط اللحم
- تنحل بقايا المجففة من الخطوة 2.1.4 في 1 مل من 25 ملي حل بيكربونات الأمونيوم. تخلط جيدا على rotamixer.
- متابعة بروتوكول من الخطوة 1.1.3 إلى 1.3.7.
- تحليل من قبل LC / MS
- إعداد LC / MS كما سبق (الخطوة 1.5.1).
- إنشاء دفعة استحواذ جديدة كما هو موضح سابقا (الخطوات 1.5.9 - 1.5.14)، واختيار طريقة الشراء التي تم إنشاؤها في خطوة في 1.5.24 يستخدم LC الديناميكي / MS طريقة الجمع بين جميع أنواع اللحوم، والحصول على البيانات ل وdigesعينات اللحوم تيد.
- عرض اللوني الكامل في البرنامج مشاهدة البيانات. عرض XIC لكل الانتقال المنصوص عليها في المقابل. تأكيد بصريا كل مجموعة تحتوي على العدد المطلوب من قمم على شكل جرس في الوقت الاحتفاظ المتوقع، مما يؤكد وجود الببتيد المحدد.
- أداء الكميات باستخدام البيانات عرض البرنامج لدمج المناطق الذروة لكل من التحولات من الفائدة عن طريق النقر المزدوج على 'بناء أسلوب الكميات "في شريط التنقل.
- في جزء "تحديد نموذج 'اختيار' ملف البيانات" و "عينة" ليتم تحليلها لتوليد جدول "التحاليل".
- انقر على علامة التبويب "تكامل" لعرض أول من التحولات (التحاليل) أن تكون متكاملة.
- انقر على مربع "الحليلة" لعرض قطرة قائمة الانتقال إلى أسفل. حدد كل الانتقال بدوره إلى عرضه وتأكيد بصريا يتم تحديد الذروة الصحيحة لتحقيق التكامل. إلى modify أو إجبار التكامل، وغادر انقر واسحب المؤشر فوق ذروة الهدف (سيتم تسليط الضوء هذا باللون الأخضر). انقر على زر "تحديد الذروة" وانقر على 'تطبيق'.
- حفظ مساحة العمل كملف طريقة (.qmf).
ملاحظة: هذا بإنشاء ملف الطريقة الكميات لحساب لاحق من مناطق ذروة العينة. - انقر نقرا مزدوجا فوق "معالج الكميات" في شريط التنقل. في الإطار "تحديد العينات" إنشاء "مجموعة الكميات من خلال اختيار واحد 'ملف البيانات"، ثم واحدة أو أكثر' هناك عينات متوفرة؟ ". اختر 'التالي' لعرض 'الإعدادات حدد والاستعلام' مربع. ترك العجز عن السداد، اختر 'التالي' لعرض "تحديد الأسلوب". من القائمة المنسدلة مربع 'أسلوب' اختيار ملف "أسلوب التكامل" بإنشائه في الخطوة 2.4.8، ثم اختر 'إنهاء'.
ملاحظة: هذا يخلق "نتائج الجدول، بما في ذلك مناطق ذروة التحول الناجمة عن خليط من اللحوم. <لى> حفظ "نتائج جدول '(ملف تمديد .rdb)، تصدير كملف نصي (txt) وفتحه في جدول لمراجعة البيانات.
- الرسوم البيانية مؤامرة من نسبة (قبل الذروة المنطقة الانتقالية) من اللحوم واحدة في آخر مقابل نسبة قياس (ث / ث) من اثنين من اللحوم لهذه الآلية المختارة للالتحولات مختارة من الببتيدات المقابلة، مع التركيز على الحالات التي تحتوي على شظايا اثنين نفس العدد من الأحماض الأمينية كما تحسب اعتبارا من نهاية C-المحطة.
ملاحظة: شظايا متطابقة مع مواقع تجزئة متطابقة تعطي أفضل النتائج. - دراسة المؤامرات من 2.4.11 أعلاه. إما بصريا، أو باستخدام أداة خط الاتجاه في حزمة التآمر، وتحديد مجموعة من المؤامرات التي هي على حد سواء الخطية والتدرج مماثل. استخدام أي واحد أو أكثر من هذه CPCP بالإضافة إلى جزء مجموعات للمعايرة في عينات اللحوم الحقيقية.
ملاحظة: مؤامرة تبين التدرج غير عادي قد يشير إما الببتيد أو قمع جزء مما أسفر عن تخفيض في تعزيز بنية الشع إشارةngth. قد يشير المؤامرات غير الخطية الفقراء ذروة الكشف أو مشاكل أخرى.
3. عينات اللحوم
- استخراج البروتينات من عينات اللحوم الهدف
- عند الاقتضاء، المكوس دخيلة المواد غير اللحوم من العينة باستخدام ملعقة. على سبيل المثال، كشط بعيدا صلصة المعكرونة ومن اللازانيا المبردة.
- تزن 20 غرام من اللحم في كوب المعادن.
- إضافة 100 مل من 0.15 كلوريد البوتاسيوم M / 0.15 عازلة الأدينوزين M البوتاسيوم في درجة الحموضة 6.5.
- استخراج البروتينات عن طريق مزج اللحم في الخالط سرعة عالية لمدة 1 دقيقة.
- متابعة بروتوكول من الخطوة 2.1.4 - 2.3.2.
- تحليل العينات التي LC / MS
- كرر الخطوة 2.4.2 لاكتساب البيانات باستخدام LC طريقة / MS الحيوية.
- تحديد الببتيدات من كل الميوجلوبين اللحوم كما يؤديها في الخطوة 2.4.3.
- لتحديد الكميات، استخدام البرمجيات الكميات لدمج المناطق الذروة لكل انتقال من الفائدة،كما هو موضح في الخطوة 2.4.9.
- لتحديد الأنواع في الخليط، وتسجيل تلك الببتيدات علامة تلبية معايير متفق عليها لعدد من التحولات وإشارة إلى الضوضاء لتلك التحولات.
- لتحديد الكميات، استخدم المناطق الانتقالية ذروة متكاملة كما هو متفق عليه من الخطوة 2.4.12، وباستخدام نسبة من ذروة المنطقة الانتقالية، وحساب النسبة المئوية للالميوجلوبين من هذين النوعين في الخليط.
- استخدام المعرفة السابقة من الأدب 18 من مستويات الميوجلوبين المحتملة في اللحوم لتقدير المبالغ / ث النسبية ث اثنين من اللحوم الموجودة في العينة.
Representative Results
في دينامية وضع التجربة MRM واحدة يتم تسجيل كل انتقال مبرمجة بشكل منفصل (كما التهم كاشف لكل ثانية، من القانون الجنائي) على نافذة الوقت الاحتفاظ المحدد. لذلك، من جمع كافة البيانات في تجربة واحدة، وشدة الذروة لكل الانتقال يمكن استخراجها بشكل فردي. ثم إشارة محدودة الوحيدة هي لنافذة الوقت الاحتفاظ المحددة لهذا الانتقال. خارج النافذة، وإشارة صفرا بحكم التعريف. إشارة لأي انتقال واحد، على سبيل المثال، 752 → 1269 من الحصان (الببتيد monoisotopic الشامل 1،501.66 دالتون، تمهيدا أيون م / ض 751.84 دالتون، توجيه الاتهام الدولة = 2، جزء أيون ص 13) وعادة للتنافس فقط مع الضوضاء القياس وليس من قمم الانتقال أخرى لعلها تكون من الأنواع الأخرى. لذا تكون المخرجات عبارة عن مجموعة من القمم نظيفة، واحدة في المرحلة الانتقالية، في وقت الاحتفاظ مشترك لتلك التحولات تقاسم أيون السلائف المشترك.
SS = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> ويبين الشكل (1) والناتج عن مجموعة من أربعة تحولات 752 → (1269، 706، 248، 1366) عن خليط من 1٪ ث / ث الحصان في لحوم البقر. منذ ترتبط التحولات أربعة عرض مع الحصان، وغائبة في عينات من لحوم البقر الخالص، والضأن أو لحم الخنزير، هذه القمم دلالة على وجود الحصان. اعتمادا على معايير المتانة، ومجموعة من اثنين أو أكثر من التحولات تتجاوز كل بعض الإشارات المحددة لمستوى الضوضاء يحدد هوية. وبالتالي هذا الرقم يحدد وجود الخيل في خليط من 1٪ وزن / وزن الحصان في لحوم البقر.
في بعض الأحيان، يتم الكشف عن انتقال معزولة واحد. وهذا يدل على المباراة فرصة لايون السلائف وجزء واحد، وربما من البروتين دخيلة، مع تلك المتوقعة من النظام ومبرمج في مطياف الكتلة. طبيعة فريدة من الذروة، وحدوثه في وقت الاحتفاظ غير متوقع، هي الاشتراكيةgnature من الانتقال من قبيل الصدفة ان يمكن تجاهلها.
ويمكن حساب المساحة تحت كل ذروة التحول بشكل فردي. واستنادا إلى جزء مناسب، نسبة الحصان إلى مناطق ذروة لحم البقر الانتقالية، على سبيل المثال، 752 → 1269 (الحصان) إلى 767 → 1299 (لحوم البقر)، ستكون متناسبة مع نسبة من اللحوم الفعلية في خليط الشكل 2 يظهر مؤامرة من نسبة من منطقة الذروة لهذه التحولات عامين مقابل الوزن نسبة للوزن الحصان في خليط من حصان مع لحوم البقر. إذا المناطق الذروة نسبة انتقال تطابق النسبة المئوية للوزن لوزن اللحم ثم المنحدر هو 1. المنحدر في هذه المؤامرة هو 1.03، مشيرا إلى أن لهذه التحولات وزوج CPCP، والمناطق التي تمر بمرحلة انتقالية ذروة تعطي مقياس موثوق لكميات النسبية من اللحوم اثنين في الخليط. إذا كان لحوم الخيل في العينة ضعف غنية في الميوجلوبين مثل لحم البقر ثم، مع عوامل أخرى دون تغيير، المنحدر من ان خط يكون أكبر من واحد.
الشكل 1. شدة MRM الانتقال مقابل الوقت الاحتفاظ ل1٪ وزن / وزن الحصان في لحوم البقر. التحولات هي 752 → (1269، 706، 248، 1366)، كما هو موضح في البرتقالي والأسود والأزرق والأخضر، على التوالي. الببتيد علامة هو HPGDFGADAQGAMTK. شظايا الانتقال أربعة يمكن أن تدل ص 13، ص 7، ص 2 و ص 14، على التوالي، حيث يدل ذ ن عد في الأحماض الأمينية ن من نهاية الببتيد C-المحطة. إشارة إلى الضوضاء تختلف 23-53 على التحولات الأربعة. خط أحمر إضافي يدل على انتقال 752 → 1269 ل 0٪ حصان، و 100٪ لحم البقر للمقارنة. يتم عرض المنطقة غير الصفرية فقط من الوقت الاحتفاظ. تم تعديل هذا الرقم من واطسون وآخرون. 3.وفاق / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. قطعة الحصان في لحوم البقر، والوزن في المئة للوزن، مقابل حصان في لحم البقر كما الذروة المنطقة في المئة الانتقالية. وتستخدم مؤامرة الزوج من الببتيدات لحم البقر (767) والحصان (752) وص 13 جزء أيون على حد سواء. إذا ويدل منطقة الذروة ثم تنسيق 100 ألف H / (A H + A B). المنحدر من أفضل خط مناسبا (R 2 = 0.99) هو 1.03. تم تعديل هذا الرقم من واطسون وآخرون. 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
اختيار بروتين الهدف مناسبة مهمة. يحتاج البروتين هدفا جيدا لأشكال المقابلة في الأنواع ذات الأهمية، يكفي تعتمد الأنواع تسلسل الاختلاف، خصوصية الأنواع، وتوجد بكميات الوصول إليها داخل الكائنات الحية. لتقييم الخلائط التي خضعت لمعالجة (على سبيل المثال، المعالجة الحرارية)، وهو بروتين وجود تسلسل محصنة نسبيا إلى أن معالجة أمر مرغوب فيه. الميوجلوبين هو مرشح جيد للحوم الحمراء، بما في ذلك اللحوم الحمراء المطبوخة، ولكن ليس هو الاحتمال الوحيد. مرة واحدة يتم تحديد البروتين المستهدف، والجزء الأكثر أهمية من البروتوكول هو التحلل البروتيني بروتين. بروتين مختلفة من الميوجلوبين قد تتطلب كذلك بروتوكول التحلل البروتيني البديل.
البروتوكول كما هو موضح يشمل شريحة على أساس مرجعية تنقية البروتين. هذا ويهدف إلى اكتشاف ويندوز الوقت الاحتفاظ والسلائف وتفتيت أيونات مناسبة. هذا الجزء هو مفيد جدا ولكن ليس من الضروري.
وقد تجلى البروتوكول لمدة أربعة اللحوم الحمراءالصورة 3. يمكن تضمين أنواع اللحوم إضافية، على الرغم من أن نوعية ذروة شكل التحول قد تتدهور إذا كان الكثير من الببتيدات علامة شارك في أزل، والحد من فعالية زمن السكون والمهينة في نهاية المطاف تقديرات الكميات النسبية. وتحسين الأجهزة، والمتاحة بالفعل، وتحسين هذا. ومن المسائل ذات الصلة هي أن ليس كل اللحوم لها myoglobins مختلفة. على سبيل المثال، حصان، حمار وحمار وحشي myoglobins متطابقة وبالتالي بالمعنى الدقيق للكلمة فإن هذه الطريقة الوحيدة القادرة على الكشف عن حصان أو حمار أو حمار وحشي في لحوم البقر. في بعض الحالات، على الرغم من myoglobins ليست متطابقة، أن بعض الببتيدات الرئيسية أن يكون. على سبيل المثال، تظهر بعض الضأن المستمدة من الميوجلوبين الببتيدات علامة أيضا في الماعز.
ومن المضاعفات التي تواجه هذه وغيرها من أي طريقة الكميات المعتمدة على البروتين هي أن مستوى البروتين يجب أن يفترض المستمر في جميع الأنواع إذا كانت مستويات بروتين أو ببتيد هي مساواة مسلي إلى مستويات اللحوم في الخليط. لالميوجلوبين وم أحمر أربعةيأكل هذا ليس صحيحا عالميا. المستويات في عام هي الأنواع التي تعتمد، مع لحم الخنزير واظهار أدنى مستوى في أربعة. وبالإضافة إلى ذلك، يختلف مستوى الميوجلوبين مع قطع اللحم وعمر الحيوان. وذلك على الرغم نسب مناطق ذروة التحول خريطة موثوق بها إلى نسب الميوجلوبين، التعيين إلى نسبة اللحوم الفعلية هو الرسم التقدير على افتراضات بشأن المصادر المحتملة من اللحوم في الخليط.
النهج المبين في هذا العمل يختلف في عدد من الطرق من مساهمات أخرى منشورة. والطريق أكثر نموذجية لاستخدام أساليب البروتين لتحديد مختلف المتباينة الببتيدات علامة تعتمد على الأنواع، وفي هذه الحالة علامات الأنواع المختلفة تمتلك أي علاقة خاصة مع واحد 8-12،14،19 آخر. على النقيض من ذلك، فقد اخترنا البروتينات مشتركة بين جميع الأنواع من الفوائد حتى الأنواع التي تعتمد على تسلسل المتغيرات 3. وبصرف النظر عن كونها أساسية لاستراتيجيتنا الكميات النسبية، وهذا له ميزة أن عينةيمكن أن يكون الأمثل استراتيجيات الإعداد. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون من المتوقع أن تتصرف على نحو مماثل، على سبيل المثال، في استخراج أو في تجهيز التجارية من عينات مثل الطبخ أو تعليب هذه البروتينات المقابلة. تحديد الأنواع ثم تنتقل عادة عن طريق الكشف عن الببتيدات علامة المتباينة، في حين أنه في نهج CPCP عائدات تحديد الأنواع عن طريق الكشف عن الببتيدات ذات صلة وثيقة امتلاك عادة واحد أو اثنين من الاختلافات التسلسل. وأخيرا، الكميات من البروتينات لتقدير في المئة من وزنها من نوع واحد في آخر قد انتقل تقليديا عن طريق تحديد الكميات المطلقة من كل من البروتين على أساس منفصل عن المعايير المعروفة 7،14،15. ومع ذلك باستخدام طريقة CPCP ليست هناك حاجة لأساليب المعايرة. بدلا من ذلك، يتم تقدير المستويات النسبية من خلال مقارنة قوة الإشارة في اثنين من المقابلة الببتيدات من هذين النوعين، وتجاوز مرحلة قياس المطلقة تماما. لأن الهدف النهائي هو نسبة وزنا من نوع واحد شرجيذر، والكميات النسبية، ثم CPCP على حد سواء أكثر مباشرة وبساطة من المقارنة بين اثنين من قياسات الكميات المطلقة. هذه الميزات تترجم مرات تجريبية قصيرة، متوقعا أن يكون ما يقرب من ساعة باستخدام بروتوكولات المكررة، مما يجعل هذه التقنية مفيدة كأداة المراقبة السريعة في مجال الكشف عن الغش الغذائي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uniprot database | www.uniprot.org | Freely accessible database of protein sequences | |
| Skyline software | www.skyline.gs.washington.edu | Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | O9830 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10674922 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 10010010 | |
| Urea | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | U5378 | |
| Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | T1426 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | F0507 | |
| Coomassie Plus Protein Assay Reagent | Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com | 1856210 | |
| Protein standard | Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com | P0914 | |
| Ultra Turrax homogeniser T25 | Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk | 13190693 | |
| Edmund and Buhler KS10 lab shaker | |||
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com | 75002420 | |
| Vacuum centrifuge RC 1022 | Jouan | ||
| Plate Reader | |||
| Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes | Phenomenex, Macclesfield, UK | 8B-S100-UBJ | |
| 4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | ||
| 1200 rapid resolution LC system | Agilent, Stockport, UK | ||
| XB C18 reversed-phase capillary column (100 mm x 2.1 mm, 2.6 µm particle size) | Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com | ||
| Analyst 1.6.2 software | AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com | QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration | |
| Autosampler vials |
References
- O'Mahony, P. J. Finding horse meat in beef products-a global problem. QJM-An Int. J. Med. 106, 595-597 (2013).
- Sentandreu, M. A., Sentandreu, E. Authenticity of meat products: Tools against fraud. Food Res. Int. 60, 19-29 (2014).
- Watson, A. D., Gunning, Y., Rigby, N. M., Philo, M., Kemsley, E. K. Meat Authentication via Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry of Myoglobin Peptides. Anal. Chem. 87, 10315-10322 (2015).
- Food Standards Agency. Report of the investigation by the Food Standards Agency into incidents of adulteration of comminuted beef products with horse meat and DNA. , (2013).
- Taylor, A. J., Linforth, R., Weir, O., Hutton, T., Green, B. Potential of electrospray mass-spectrometry for meat pigment identification. Meat Science. 33, 75-83 (1993).
- Ponce-Alquicira, E., Taylor, A. J. Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species. Food Chem. 69, 81-86 (2000).
- Gallien, S., Duriez, E., Domon, B. Selected reaction monitoring applied to proteomics. J. Mass Spectrom. 46, 298-312 (2011).
- Orduna, A. R., Husby, E., Yang, C. T., Ghosh, D., Beaudry, F. Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1709-1717 (2015).
- Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).
- von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food. J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).
- von Bargen, C., Dojahn, J., Waidelich, D., Humpf, H. U., Brockmeyer, J. New Sensitive High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Horse and Pork in Halal Beef. J. Agric. Food Chem. 61, 11986-11994 (2013).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry. Food Chem. 187, 297-304 (2015).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid detection of Peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
- Sentandreu, M. A., Fraser, P. D., Halket, J., Patel, R., Bramley, P. M. A Proteomic-Based Approach for Detection of Chicken in Meat Mixes. J. Proteome Res. 9, 3374-3383 (2010).
- Elliott, M. H., Smith, D. S., Parker, C. E., Borchers, C. Current trends in quantitative proteomics. J. Mass Spectrom. 44, 1637-1660 (2009).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE, Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2016).
- Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T. Encyclopedia of Meat Sciences. Devine, C., Dikeman, M. 1, Academic Press. 235-243 (2014).
- Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid Detection of Peptide Markers for Authentication Purposes in Raw and Cooked Meat Using Ambient Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
