Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Artsbestemmelse og kvantificering i blandinger Brug MRM massespektrometri af peptider Anvendt til Kød Authentication

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54420
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,3, 1
1Analytical Sciences Unit, Institute of Food Research, 2Institute of Food Research, 3School of Chemistry, University of East Anglia

Protocol

1. Proteolyse og analyse af referencecentre myoglobiner

  1. Proteolyse af reference- myoglobiner
    1. Forbered opløsninger af de oprensede reference- myoglobiner (området fra 0,2 - 0,5 mg / ml i 25 mM ammoniumbicarbonat) 3.
    2. Overfør 1 ml alikvoter af hver prøve til 2 ml centrifugerør.
    3. Termisk denaturere de ekstraherede proteiner ved opvarmning af prøven i en varm blok ved 95 ° C i 30 minutter. Prøven afkøles i ca. 15 min, indtil den når stuetemperatur. Tilsæt 30 mg af urinstof (slutkoncentration 0,5 M) for at forbedre fordøjelsen, derefter blandes.
  2. Tryptisk proteolyse
    1. Der fremstilles en 1 mg / ml opløsning af trypsin i 25 mM ammoniumbicarbonat og gemme på is efter behov. Tilsæt en tilstrækkelig mængde trypsin således at den endelige enzymaktivitet er 420 BAEE (N- benzoyl-L-arginin-ethylester-hydrochlorid) enheder / mg ekstraheret protein, bland derefter ved forsigtig vortexing og lad den proteolyze natten over ved 37 ° C.
    2. Udfør natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) 17 at demonstrere fuldstændigheden af proteolyse.
  3. Afsaltning af post-proteolyse prøve
    1. Fortynde prøven 1: 2 v: v med vand.
    2. Aktivere en polymer omvendt fase (RP) patron fyldt med 30 mg RP materiale ved tilsætning af 1 ml methanol og derefter ækvilibrere patronen ved tilsætning af 1 ml 1% myresyre.
    3. Læg prøven på patronen under tyngdekraften.
    4. Vask med 1 ml af 5% methanol / 1% myresyre under tyngdekraften.
    5. Eluer peptiderne med 1 ml acetonitril / vand (90:10 vol: vol; 0,1% myresyre) under tyngdekraft i 2 ml mikrocentrifugerør forfyldt med 5 pi dimethylsulfoxid (DMSO).
    6. Fjern opløsningsmidlet under vakuum ved 50 ° C under anvendelse af en centrifugal fordamper i 120 min, derefter genopløses remanensen i 250 pi acetonitril / vand (3:97 vol: vol; 0,1% myresyre).
    7. Overførselopløsningen til en lav volumen autosampler hætteglas.
      Bemærk: Prøver kan opbevares ved 4 ° C indtil den er klar til væskekromatografi-massespektrometri (LC / MS) analyse.
  4. Generation af overgange lister for MRM
    1. Lokalisere myoglobin sekvenser for de forskellige kød fra UniProt databasen.
    2. Indtast myoglobin sekvenser i den "Target" æske af peptidet og overgang forudsigelse software (f.eks, Skyline). Hvis det er nødvendigt, holde musen over et peptid til at afsløre sin fragment liste.
    3. Klik på 'Indstillinger' og vælg 'Peptide Settings'. Input præferencer for fordøjelsen (dvs. trypsin) og antallet af mistede spaltninger (0). Indtast den ønskede selektion for yderligere parametre, især peptidet længde (6 - 25), N-terminale udelukkelser (0) og antages aminosyremodifikationer (ingen).
    4. Klik på 'Indstillinger' og vælg 'Transition indstillinger'. Vælg præferencer forinstrumentet anvendes til den praktiske LC / MS-analyse.
    5. Klik på 'Export' og vælg 'Transition List' for at oprette et regneark, der indeholder de genererede MRM overgange og parametre.
  5. Analyse ved LC / MS
    1. Oprette et system af binære gradient (vand (A) og acetonitril (B), hver med 0,1% myresyre v: v) højtydende væskekromatograf (HPLC) med auto sampler, C18 kerne shell HPLC-søjle (10 cm x 2,1 mm , 2,6 um partikelstørrelse) forbundet til en tripel kvadrupol massespektrometer anvendes i positiv elektrospraymåde med MRM detektion.
    2. I dataindsamlingen software (f.eks, Analyst), vælg 'Filer' og 'Ny' og klik på 'Acquisition Method "i pop-up boksen og klik på' OK '.
      Bemærk: Dette åbner instrument method editor, der indeholder en liste over de forbundne enheder, der vil gøre det muligt at opsætning af en ny LC / MS-metoden.
    3. Klik på 'Binary Pump' og jegkommet input strømningshastigheden værdi (300 pl / min) og gradient gange i tabellen, angive en binær gradient profil på 3% B til 30% B i 22 min, stigende til 100% B ved 23 min for en 5 min udvaskning før han vendte tilbage til oprindelige betingelser og re-ækvilibrering i yderligere 6 min.
    4. Klik på 'Autosampler' og indsæt injektion volumen (5 pi). Aktiver 'Needle Wash Cycle "og indtast" Wash Time' (30 sek) og vælg 'Flush Port «.
    5. Klik på 'termostateret kolonne Controller "og i" Kolonne Ovn Properties' sæt den "Venstre Temperatur" og "rigtige temperatur« (40 ° C).
    6. Klik på 'masse Spectrometer "og derefter klikke på' Rediger Parametre 'for at indtaste kilde for gas. Vælg "Scan Type 'som' MRM (MRM)" og "polaritet" som 'positive'. Gå til "Periode Summary" og indtast "Duration Time ', den samlede tid for LC-analyse end ækvilibrering (35 min).
    7. I tabellen til højre klik og vælg "Declustering Potential (DP)" og "Collision Energy (CP) 'for at tilføje disse kolonner til tabellen. Indtast Q1, Q3, Time (ms), ID, DP og CE-værdier for alle de overgange, for en enkelt kød art, skabt i overgangen listen (se trin 1.4.5).
      Bemærk: Time (ms) henviser til hviletiden, tidspunktet massespektrometret tilbringer scanning hver overgang, summation af hvilket bør ikke overstige 3 sek.
    8. Gem overtagelsesmetoden fil (filtypen .dam).
      Bemærk: Trin 1.5.2 - 1.5.8 skal gentages for hver kød art. Dette vil skabe en enkelt metode fil for hver kød art i skærm som forberedelse til analyse nedenfor.
    9. Ved indsamlingen af ​​data software, klik på 'Acquire' og vælg 'ligevægt'. I boksen, der åbnes, skal du vælge den ønskede Acquisition metode til at begynde instrumentet ligevægt.
    10. Sæt prøvehætteglas i arack i auto sampler.
    11. Klik på "Filer" og vælg "Ny" og derefter "Acquisition Batch«. I fanebladet 'Sample' vælge 'Tilføj Set' og derefter 'Tilføj Samples «. Indsæt det antal prøver, der skal analyseres, og klik på 'OK'. I 'Acquisition' box vælge den metode fil, der vil blive anvendt til analysen fra drop down menuen.
    12. I tabellen, vælg 'Plate Code', og vælg det relevante magasin konfiguration fra rullemenuen. Venstre klik i "Plate Code 'kolonneoverskriften og derefter højreklikke og vælge" Fyld Downs. I 'Hætteglas Position' indtaste positionen for hver prøve i auto sampler i rækkerne.
    13. I 'Data File' indtaste filnavnet for erhvervelse, derefter til venstre klik i kolonneoverskriften efterfulgt af højreklik og vælg 'Fill Down «. I 'Sample Name "indsæt identiteten af ​​hver af de prøver, der skal analyseres. Gem som en overtagelse batchfil (fil eXtension .dab).
    14. Klik på fanen "Send" og derefter fremhæve de prøver, der skal analyseres på LC / MS. Klik på 'Send'. Klik på 'Acquire "og" Start Sample' for at starte analysen.
      Bemærk: Hver overtagelsesmetoden vil scanne for MRM overgange på tværs af hele længden af ​​kromatografen for en enkelt kød art. Masse spektrometer indstillinger for en overtagelse MRM varierer alt efter instrument type og peptid.
    15. Se de genererede datafiler ved hjælp af data visning software. Klik på Xic (udvundet ioner) og i drop down listen fremhæve alle de fragmenter (Q3 værdier) for en enkelt forløber (Q1). En ny rude åbner der kun viser de valgte overgange.
    16. Optag retentionstiden (Rt) for grupper af samtidige overgange eftersom disse svarer til et enkelt peptid.
    17. Gentag de to foregående trin for hver sæt af overgange for at tildele toppene til deres respektive peptider til hveraf kød arter.
    18. Optag markør peptider, som er egnet til at give identifikation arter (f.eks peptid HPGDFGADAQGAMTK, forløber m / z = 752, Rt = 12,0 min, for hest), sammen med deres retentionstider, og bemærk hvilke danner tilsvarende par egnede til relativ kvantificering .
      Bemærk: F.eks hesten markør peptid (precursor m / z = 752) har en tilsvarende oksekød peptid, HPSDFGADAQAAMSK (precursor m / z = 767, Rt = 13,2 min).
    19. For at skabe et enkelt dynamisk metode omfavne alle de kød arter, i data visning software, for hver kød arter i gengæld åbne XIC overgang data for hver forløber (tildeles en bestemt peptid i 1.5.8).
    20. Zoom ind på toppen klynge på den valgte opholdstid ved at venstreklikke og trække markøren under klyngen. Identificer de mest intense overgange (ved at højreklikke på toppen etiket).
    21. Manuelt optage overgangeneog retentionstider i et regneark.
    22. For at indtaste de parametre som en ny dynamisk metode på LC / MS-software, skal du klikke på 'masse Spectrometer' og derefter klikke på 'Rediger Parametre' for at indtaste kilde for gas. Vælg "Scan Type 'som' MRM (MRM)" og "polaritet" som 'positive'.
    23. Gå til "Periode Summary" og indtast varighed (indstillet som den samlede tid for LC analyse og ligevægt). I tabellen til højre klik og vælg "Declustering Potential (DP)" og "Collision Energy (CP) 'for at tilføje disse kolonner til tabellen.
      Bemærk: 'Time' kolonne nu henviser til den forventede opholdstid (min) for hver overgang.
    24. I 'Rediger parametre' sektion af LC / MS dataindsamling software, kontrollere 'Planlagt MRM' kassen. Indtast Q1, Q3, Time (min), ID, DP og CE værdier for overgangene oprettet i regnearket (1.5.21) og gemme overtagelsesmetoden (file extension .dam).
      Bemærk: Denne metode reducerer typisk antallet af MRM overgange til 4 mest intense for hvert peptid og scanner kun på tværs af retentionstiden vindue for hvert peptid peak, der giver forbedret følsomhed og kvaliteten af ​​dataene. En "dynamisk" metode er en "guidet opholdstid vindues 'metode, også kaldet planlægning.

2. Forberedelse og analyse af kalibreringsprøver

  1. Ekstraktion af kød blandinger
    1. Brug kød tidligere frosne derefter malet til et pulver, forberede en række kød blandinger ved vejning respektive mængder af kød (totalvægt på omkring 300 mg) i 15 ml plast centrifugerør.
    2. Tilsæt 4 ml ekstraktionsbuffer (0,15 M kaliumchlorid + 0,15 M phosphatbuffer ved pH 6,5). Vortex i 30 sek. Uddrag på en lab ryster ved stuetemperatur i 2 timer ved 250 cykler / min.
      Bemærk: Cycles / min henviser til en oscillerende bevægelse.
    3. Overfør 2 ml afekstraheres i et 2 ml mikrocentrifugerør. Centrifuger i 5 minutter ved 4 ° C ved 17.000 x g.
    4. Overfør 200 pi prøver af supernatanten (reservere et mindre beløb for proteinanalyse, se 2.2) i 2 ml centrifugerør og tør bruge en centrifugal fordamper (forudindstillet program: 50 ° C, uden udluftning og 120 min varighed).
  2. proteinanalyse
    1. Overførsel 7 pi prøver af de reserverede supernatant (se 2.1.4) i tre eksemplarer i brøndene på en 96 brønds plade.
    2. Overførsel 7 pi alikvoter af en række proteinstandarder i tre eksemplarer, område 0 - 1,0 mg / ml bovint serumalbumin (BSA), til den samme plade med 96 brønde.
    3. Tilsæt 200 pi Coomassie plus protein assayreagens til hver brønd.
    4. sammenligne visuelt farven af ​​prøvebrønde med proteinet standarder for at kontrollere prøverne er i området fra kalibreringsstandarderne. Gentag om nødvendigt med fortyndet prøve så det bliver inden for rækkevidde.
    5. Lad pladen stog i 3 minutter.
    6. Burst eventuelle bobler, der har dannet med en kanyle.
    7. Analyser pladen på pladelæseren anvendelse af en standard endpoint protokol ved en bølgelængde på 595 nm.
    8. Bestem proteinkoncentrationen af ​​prøver ved anvendelse af kalibreringsdata fra proteinstandarder.
      Bemærk: Dette er nødvendigt til beregning af mængden af ​​trypsin anvendes i tryptiske fordøje.
  3. Proteolyse af kød blandinger
    1. Genopløse den tørrede rest fra trin 2.1.4 i 1 ml 25 mM ammoniumbicarbonat-opløsning. Bland godt på en rotamixer.
    2. Følg protokollen fra trin 1.1.3 til 1.3.7.
  4. Analyse ved LC / MS
    1. Opsæt LC / MS som tidligere (trin 1.5.1).
    2. Opret en ny erhvervelse parti som skitseret tidligere (trin 1.5.9 - 1.5.14), valg af overtagelsesmetoden skabt i trin på 1.5.24, der bruger en dynamisk LC / MS metode kombinerer alle de kød arter, og erhverve de data for de Digested kød prøver.
    3. Vis den fulde kromatogram i data visning software. Vis XIC for hver overgang sat i sving. Bekræft visuelt hver klynge indeholder det nødvendige antal klokkeformede toppe på det forventede opholdstid, hvilket bekræfter eksistensen af ​​den valgte peptid.
    4. Udfør kvantificering ved hjælp af data visning software til at integrere toparealer for hver af overgangene af interesse ved at dobbeltklikke på 'Byg Kvantificering Method' i navigationslinjen.
    5. I "Vælg Sample" rude vælge 'Data File "og" Sample ", der skal analyseres for at generere en" Analytter' bord.
    6. Klik på fanen 'Integration' for at vise den første af de overgange (Analytter), der skal integreres.
    7. Klik på 'analyt' boksen for at vise rullelisten overgange. Vælg hver overgang i tur til at vise det og visuelt bekræfte den korrekte peak er valgt for integration. Til modify eller tvinge integration, venstre klik og træk markøren hen over peak mål (dette vil blive markeret med grønt). Klik på knappen 'Vælg Peak' og klik 'Tilføj ".
    8. Gem arbejdsområdet som en metode fil (.qmf).
      Bemærk: Dette skaber en Kvantificering Metode fil til efterfølgende beregning af prøven arealer.
    9. 'Wizard Kvantificering' Double klik i navigationslinjen. I "Vælg Prøver 'vindue skabe" Kvantificering Set "ved at vælge en enkelt' Data File ', så en eller flere' Tilgængelige Samples". Vælg 'Næste' for at vise 'Vælg Indstillinger og Query' kassen. Lad med defaults, vælg 'Næste' for at vise 'Vælg Method'. Fra drop down "metode" box vælge 'Integration Method' fil oprettet i trin 2.4.8, og vælg derefter 'Afslut'.
      Bemærk: Dette skaber en "Resultater Tabel«, herunder overgange toparealer skyldes kød blandinger.
      10. <li> Gem "Resultater Tabel« (filtypen .rdb), eksport som en tekstfil (.txt) og åbne den i regneark for at gennemgå dem.
    10. Plot grafer af procentdelen (ved overgangen areal af toppen) af ét kød i en anden versus den målte procentdel (vægt / vægt) af de to kød for den valgte MRM for udvalgte overgange fra tilsvarende peptider, der fokuserer på de tilfælde, hvor de to fragmenter indeholder samme antal aminosyrer som talt fra den C-terminale ende.
      Bemærk: Identiske fragmenter med identiske fragmentering sites giver optimale resultater.
    11. Undersøg plots fra 2.4.11 ovenfor. Enten visuelt eller ved anvendelse af en trend line værktøj i plotte pakke, identificere en gruppe af grunde, som er både lineære og lignende gradient. Brug en eller flere af disse CPCP plus fragment kombinationer til kalibrering i prøver virkelige kød.
      Bemærk: Et plot viser en usædvanlig gradient kan indikere enten peptid eller fragment undertrykkelse med en deraf følgende reduktion i signal strength. Ikke-lineære plots kan indikere dårlig peak afsløring eller andre problemer.

3. Kød Prøver

  1. Ekstraktion af proteiner fra prøver target kød
    1. Hvor det er relevant, punktafgifter uvedkommende ikke-kød materiale fra prøven ved hjælp af en spatel. For eksempel skrabe væk sauce og pasta fra en kølet Lasagne.
    2. Afvej 20 g af kød til en metal bægerglas.
    3. Der tilsættes 100 ml 0,15 M kaliumchlorid / 0,15 M kalium monophosphat puffer ved pH 6,5.
    4. Uddrag proteinerne ved blanding kødet i en homogenisator med høj hastighed i 1 min.
    5. Følg protokollen fra trin 2.1.4 - 2.3.2.
  2. Analyse af prøver ved LC / MS
    1. Gentag trin 2.4.2 at erhverve data efter den dynamiske LC / MS-metode.
    2. Identificer de peptider fra hver kød myoglobin som udføres i trin 2.4.3.
    3. For kvantificering bruge kvantificering software til at integrere toparealerne for hver overgang af interesse,som skitseret i trin 2.4.9.
    4. Til identifikation af arter i en blanding, optage disse markør peptider opfylder aftalte kriterier for antallet af overgange og signalere til støj for disse overgange.
    5. For kvantificering, bruge integrerede overgang toparealer som aftalt fra trin 2.4.12 og ved hjælp procentsats, overgangen topareal, beregne den procentdel af myoglobin fra de to arter i blandingen.
    6. Brug forudgående viden fra litteraturen 18 af sandsynlige myoglobin niveauer i kødet til at estimere de relative vægt / vægt mængder af to kød til stede i prøven.

Representative Results

I en enkelt dynamisk-mode MRM eksperiment hver programmeret overgang registreres særskilt (som detektor tællinger pr sek, cps) over en nærmere specificeret tidsinterval. Derfor, fra alle de indsamlede data i et eksperiment, skal den maksimale intensitet for hver overgang kan individuelt ekstraheret. Så den eneste finite signal er for retentionstiden vinduet indstillet for denne overgang. Vinduets yderside, signalet er nul ved definition. Signalet for nogen overgang, for eksempel 752 → 1269 fra hest (peptid monoisotopisk mass 1,501.66 dalton, precursor ion m / z 751.84 dalton, opladningstilstand = 2, fragment ion y 13) har typisk kun at konkurrere med måling støj og ikke fra andre overgangsøkonomier toppe, kunne måske være fra andre arter. Udgangen er derfor et sæt af rene toppe, én pr overgang, ved en fælles opholdstid for de overgange, der deler en fælles forløber ion.

Figur 1 viser output for sættet af fire overgange 752 → (1269, 706, 248, 1366) og en blanding af 1% vægt / vægt hest i oksekød. Da de fire overgange viste er forbundet med hest, og er fraværende i prøver af rent oksekød, lammekød eller svinekød, disse toppe tilkendegiver tilstedeværelsen af ​​hesten. Afhængig af robusthed kriterier, et sæt af to eller flere overgange hver overskridelse nogle angivne signal til støjniveau etablerer identifikation. Dette tal fastsættes derfor tilstedeværelsen af ​​hesten i blandingen af ​​1% vægt / vægt hest i oksekød.

Lejlighedsvis, der registreres en enkelt isoleret overgang. Dette indikerer en chance kamp precursor-ion og et enkelt fragment, eventuelt fra et fremmed protein, med de forventede fra systemet og programmeret ind i massespektrometeret. Den enestående natur af toppen, og dens forekomst på en uventet retentionstid, er signature af en utilsigtet overgang, kan ignoreres.

Arealet under hver overgang peak kan beregnes individuelt. Baseret på en egnet fragment er forholdet mellem hest til oksekød overgang toparealer for eksempel 752 → 1269 (hest) til 767 → 1299 (oksekød), vil være proportional med forholdet mellem den faktiske kød i blandingen. Figur 2 viser en plot af procent af arealerne for disse to overgange versus den procentvise vægt for vægten af ​​hesten i en blanding af hest med oksekød. Hvis procentdel overgang toparealer matcher den procentvise vægt for vægten af ​​kød så hældningen er 1. Hældningen i dette plot er 1,03, hvilket indikerer, at der for disse overgange og CPCP par, de overgang toparealer giver et pålideligt mål for de relative mængder de to kød i blandingen. Hvis hestekød i prøven var dobbelt så rig på myoglobin som oksekød derefter, med andre faktorer uændret, hældningen af line ville være større end én.

figur 1
Figur 1. MRM overgangsintensiteter versus retentionstiden for 1% w / w hest i oksekød. Overgangene er 752 → (1269, 706, 248, 1366), er vist i orange, sort, blå og grøn, hhv. Markøren peptid er HPGDFGADAQGAMTK. De fire overgang fragmenter kan betegnes y 13, y 7, y 2 og y 14 henholdsvis hvor y n betyder tælling i n aminosyrer fra peptidet C-terminale ende. Signal-støj varierer fra 23 til 53, i løbet af de fire overgange. En ekstra røde linje angiver 752 → 1269 overgang til 0% hest, 100% oksekød til sammenligning. Kun den ikke-nul-regionen af ​​retentionstiden vises. Dette tal er blevet ændret fra Watson et al. 3.es / ftp_upload / 54.420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Plot af hest i oksekød, som procent vægt for vægt, versus hest i oksekød som procent overgang topareal. Plottet bruger parret af peptider oksekød (767) og hest (752) og y 13 fragment ion for begge. Hvis A betegner toparealet derefter ordinaten er 100 A H / (A H + A B). Hældningen af den bedste pasform linie (R2 = 0,99) er 1,03. Dette tal er blevet ændret fra Watson et al. 3. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Udvælgelsen af ​​et egnet target protein er vigtig. En god målprotein skal have tilsvarende former i arter af interesse, tilstrækkelig arter afhængige sekvensvariation, artsspecificitet, og findes i tilgængelige mængder inden for de organismer. For at vurdere blandinger som er behandlet (f.eks varmebehandling), et protein med en sekvens relativt immune over for denne behandling er ønskelig. Myoglobin er en god kandidat til rødt kød, herunder kogt rødt kød, men er ikke den eneste mulighed. Når målproteinet bestemmes, den mest kritiske del af protokollen er det protein proteolyse. Et protein forskelligt fra myoglobin kan meget vel kræve en alternativ proteolyse protokol.

Protokollen som beskrevet indeholder et segment baseret på henvisning renset protein. Dette har til formål at opdage fastholdelse tid vinduer og egnede prækursorer og fragment-ioner. Dette segment er meget nyttigt, men ikke afgørende.

figur 2). Dette er fordi sidstnævnte peptid skyldes en forholdsvis undertrykt KE spaltning, der forårsager en undervurdering af niveauet af hesten i blandingen. Tilsvarende peptider starter med forskellige aminosyrer er derfor bedst undgås. Ofte fragmenterne fra to tilsvarende peptider har identiske aminosyresekvenser og er godt behaved, men dette er ikke altid tilfældet, og skal kontrolleres under udvikling metode. Arter identifikation er langt mindre følsomme over for disse spørgsmål end relativ kvantificering.

Protokollen er blevet påvist for fire rødt køds 3. Yderligere kød arter kan indbefattes, selvom kvaliteten af ​​overgangen topform kan forringes, hvis for mange markør peptider co-eluerer, effektivt at reducere opholdstiden og i sidste ende nedbrydning relative kvantificering skøn. Forbedret instrumentering, der allerede findes, vil forbedre dette. Et beslægtet problem er, at ikke alle kød har forskellige myoglobiner. For eksempel, hest, æsel og zebra myoglobiner er identiske og dermed strengt taget metoden er kun i stand til at detektere hest eller æsel eller zebra i oksekød. I nogle tilfælde, selv om myoglobiner ikke er identiske, kan nogle af de vigtigste peptider være. For eksempel vises nogle lam myoglobin-afledte markør peptider også i ged.

En komplikation overfor denne og andre protein-baserede kvantificering fremgangsmåde er, at proteinniveauet må antages konstant over alle arter, hvis proteinet eller peptidet niveauer er at sidestille trivielt til niveauer på kød i en blanding. For myoglobin og fire røde mæder dette ikke er universelt sandt. Niveauerne i almindelighed er arter afhængige, med svinekød udviser det laveste niveau af de fire. Derudover myoglobin niveauet varierer med udskårne kødstykke og dyrs alder. Så selv om forhold mellem overgangen toparealer kort pålideligt til forhold mellem myoglobin, kortlægning til forholdet mellem de faktiske kød er et skøn tegning på formodninger om sandsynlige kilder til kød i blandingen.

Strategien i dette arbejde adskiller sig på flere måder fra andre offentliggjorte bidrag. En mere typisk vej er at bruge proteom metoder til at identificere forskellige uensartede arter-afhængig markør peptider, i hvilket tilfælde de markører for forskellige arter besidder nogen særlig relation med hinanden 8-12,14,19. Derimod har vi udvalgt proteiner fælles for alle arter af interesse op til arter afhængige sekvens varianter 3. Ud over at være central for vores relative kvantificering strategi har dette den fordel, at prøvenstrategier forberedelse kan optimeres. Desuden kan sådanne tilsvarende proteiner forventes at opføre sig på samme måde, for eksempel ved udvindingen eller i kommerciel behandling af prøver såsom madlavning eller konserves. Arter identifikation derefter normalt forløber via påvisning af forskellige markør-peptider, mens der i de CPCP tilgang identifikation arter provenu via påvisning af nært beslægtede peptider besidder typisk en eller to sekvens forskelle. Endelig kvantificering af proteiner til at estimere den vægtprocent af én art i en anden kan konventionelt forløbe via absolut kvantificering af hvert protein separat baseret på kendte standarder 7,14,15. Men ved hjælp af CPCP metode er der ikke behov for kalibreringsmetoder. I stedet er relative niveauer anslås ved sammenligning signalstyrker to tilsvarende peptider fra de to arter, uden om absolut måling fase helt. Da det endelige mål er en vægtprocent af en art i another, en relativ kvantificering, så CPCP er både mere direkte og enklere end at sammenligne to absolutte kvantificeringsfremgangsmåder målinger. Disse funktioner omsættes til korte eksperimentelle gange, forventede at være cirka to timers hjælp raffinerede protokoller, hvilket gør teknikken anvendelig som en hurtig overvågning værktøj i realm af afsløring af svindel mad.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uniprot database www.uniprot.org Freely accessible database of protein sequences
Skyline software www.skyline.gs.washington.edu Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com O9830
Methanol, HPLC grade Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 10674922
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 10010010
Urea Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com U5378
Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com T1426
Formic acid  Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com F0507
Coomassie Plus Protein Assay Reagent Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com 1856210
Protein standard Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com P0914
Ultra Turrax homogeniser T25 Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 13190693
Edmund and Buhler KS10 lab shaker
Heraeus Fresco 17 Centrifuge Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com 75002420
Vacuum centrifuge RC 1022 Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes Phenomenex, Macclesfield, UK 8B-S100-UBJ
4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com
1200 rapid resolution LC system Agilent, Stockport, UK
XB C18 reversed-phase capillary column (100 mm x 2.1 mm, 2.6 µm particle size) Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 software AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration
Autosampler vials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Mahony, P. J. Finding horse meat in beef products-a global problem. QJM-An Int. J. Med. 106, 595-597 (2013).
  2. Sentandreu, M. A., Sentandreu, E. Authenticity of meat products: Tools against fraud. Food Res. Int. 60, 19-29 (2014).
  3. Watson, A. D., Gunning, Y., Rigby, N. M., Philo, M., Kemsley, E. K. Meat Authentication via Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry of Myoglobin Peptides. Anal. Chem. 87, 10315-10322 (2015).
  4. Food Standards Agency. Report of the investigation by the Food Standards Agency into incidents of adulteration of comminuted beef products with horse meat and DNA. , (2013).
  5. Taylor, A. J., Linforth, R., Weir, O., Hutton, T., Green, B. Potential of electrospray mass-spectrometry for meat pigment identification. Meat Science. 33, 75-83 (1993).
  6. Ponce-Alquicira, E., Taylor, A. J. Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species. Food Chem. 69, 81-86 (2000).
  7. Gallien, S., Duriez, E., Domon, B. Selected reaction monitoring applied to proteomics. J. Mass Spectrom. 46, 298-312 (2011).
  8. Orduna, A. R., Husby, E., Yang, C. T., Ghosh, D., Beaudry, F. Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1709-1717 (2015).
  9. Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).
  10. von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food. J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).
  11. von Bargen, C., Dojahn, J., Waidelich, D., Humpf, H. U., Brockmeyer, J. New Sensitive High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Horse and Pork in Halal Beef. J. Agric. Food Chem. 61, 11986-11994 (2013).
  12. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry. Food Chem. 187, 297-304 (2015).
  13. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid detection of Peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
  14. Sentandreu, M. A., Fraser, P. D., Halket, J., Patel, R., Bramley, P. M. A Proteomic-Based Approach for Detection of Chicken in Meat Mixes. J. Proteome Res. 9, 3374-3383 (2010).
  15. Elliott, M. H., Smith, D. S., Parker, C. E., Borchers, C. Current trends in quantitative proteomics. J. Mass Spectrom. 44, 1637-1660 (2009).
  16. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  17. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE, Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2016).
  18. Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T. Encyclopedia of Meat Sciences. Devine, C., Dikeman, M. 1, Academic Press. 235-243 (2014).
  19. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid Detection of Peptide Markers for Authentication Purposes in Raw and Cooked Meat Using Ambient Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).

Tags

Biokemi Biokemi Kød autentificering multipel reaktion tilstand massespektrometri myoglobin peptider relativ kvantificering artsspecifik
Artsbestemmelse og kvantificering i blandinger Brug MRM massespektrometri af peptider Anvendt til Kød Authentication
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gunning, Y., Watson, A. D., Rigby,… More

Gunning, Y., Watson, A. D., Rigby, N. M., Philo, M., Peazer, J. K., Kemsley, E. K. Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication. J. Vis. Exp. (115), e54420, doi:10.3791/54420 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter