Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Arter Bestemmelse og kvantifisering i blandinger Bruke MRM massespektrometri av Peptider Applied til Meat Authentication

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54420
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,3, 1
1Analytical Sciences Unit, Institute of Food Research, 2Institute of Food Research, 3School of Chemistry, University of East Anglia

Protocol

1. Proteolyse og analyse av referanse Myoglobins

  1. Proteolyse av referanse myoglobins
    1. Forbered løsninger av de rensede referanse myoglobins (variasjon 0,2 til 0,5 mg / ml i 25 mM ammonium bikarbonat) 3.
    2. Overføre en ml alikvoter av hver prøve i 2 ml sentrifugerør.
    3. Termisk denaturering de ekstraherte proteiner ved oppvarming av prøven i en varm blokk ved 95 ° C i 30 min. Avkjøl prøven i ca. 15 minutter inntil den når romtemperatur. Tilsett 30 mg urea (sluttkonsentrasjon 0,5 M) for å forbedre den fordøyelse, og bland.
  2. tryptisk proteolyse
    1. Tilbered en 1 mg / ml oppløsning av trypsin i 25 mM ammoniumbikarbonat og lagres på is etter behov. Legg et tilstrekkelig volum av trypsin slik at den endelige enzymaktiviteten er 420 BAEE (N- benzoyl-L-arginin-etylester-hydroklorid) enheter / mg av ekstrahert protein, og bland ved virvling og skånsom tillater å proteolyze over natten ved 37 ° C.
    2. Utføre natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) 17 for å demonstrere fullstendigheten av proteolyse.
  3. Avsalting av post-proteolyse prøve
    1. Fortynne prøven 1: 2 v: v med vann.
    2. Aktivere et polymert revers fase (RP) patron fylt med 30 mg RP materiale ved tilsetning av 1 ml metanol, og deretter stabilisere seg i kassetten ved tilsetning av 1 ml av 1% maursyre.
    3. Laste prøven på kassetten følge av tyngdekraften.
    4. Vask med 1 ml av 5% metanol / 1% maursyre i henhold til tyngdekraften.
    5. Eluere peptidene med 1 ml acetonitril / vann (90:10 v: v; 0,1% maursyre) under tyngdekraften inn i 2 ml mikrosentrifugerør ferdig utfylt med 5 mL dimetylsulfoksyd (DMSO).
    6. Fjern løsningsmidlet under vakuum ved 50 ° C ved anvendelse av en sentrifugefordamper i 120 minutter, og deretter gjenoppløse residuet i 250 pl acetonitril / vann (3:97 volumdeler, 0,1% maursyre).
    7. Overføreoppløsningen til et lite volum autoprøvetaker hetteglass.
      Merk: Prøver kan bli lagret ved 4 ° C inntil de er klare for væskekromatografi-massespektrometri (LC / MS-analyse).
  4. Generering av overgangslister for MRM
    1. Finn de myoglobin sekvenser for de ulike kjøtt fra Uniprot database.
    2. Angi myoglobin sekvenser inn i "Target" boksen til peptidet og overgang prediksjon programvare (f.eks Skyline). Om nødvendig, holde musepekeren over et peptid for å avsløre sin fragment listen.
    3. Klikk på "Innstillinger" og velg "Peptide Innstillinger". Input preferanser for fordøyelsen (dvs. trypsin) og antall tapte splittelser (0). Skriv inn ønsket utvalg for flere parametere, spesielt peptid lengde (6-25), N-terminale utelukkelser (0) og antatt aminosyre modifikasjoner (ingen).
    4. Klikk på "Innstillinger" og velg "Overgangs Innstillinger". Velg innstillinger forinstrumenttype som brukes til LC / MS-analyse.
    5. Klikk på "Export" og velg "Transition List" for å lage et regneark som inneholder de genererte MRM overganger og parametere.
  5. Analyse ved LC / MS
    1. Sette opp et system av binær gradient (vann (A) og acetonitril (B), hver med 0,1% maursyre volum: volum) væskekromatografi (HPLC) med automatisk prøvetaker, C18 kjerne skall HPLC-kolonne (10 cm x 2,1 mm , 2,6 um partikkelstørrelse) forbundet med en trippel kvadrupol massespektrometer som drives i positiv elektrospray modus med MRM deteksjon.
    2. I datainnsamling programvare (f.eks Analyst), velger du "Fil" og "New" og klikk på "oppkjøpsmetoden" i pop-up-boksen og klikk deretter på "OK".
      Merk: Dette åpner instrumentet method editor, som inneholder en liste over tilkoblede enheter som vil gjøre oppsettet av en ny LC / MS-metoden.
    3. Klikk på "Binary Pump 'og jegnput strømningsverdi (300 ul / min) og den gradient ganger i tabellen, sette en binær gradient profil av 3% B til 30% B over 22 minutter, og øker til 100% B på 23 min for en 5 min bleke før retur til startbetingelser og re-ekvilibrering i ytterligere 6 min.
    4. Klikk på "Autosampler 'og sett injeksjonsvolumet (5 mL). Aktiver "Needle vaskesyklusen" og skriv inn "Wash Time" (30 sek) og velg 'Flush Port'.
    5. Klikk på "termostat Column Controller" og i "kolonne Oven Properties 'sette' Venstre Temperatur 'og' riktig temperatur '(40 ° C).
    6. Klikk på "Mass Spectrometer" og klikk deretter på "Rediger parametre" for å gå inn i kildegass forhold. Velg "Scan Type" som "MRM (MRM)" og "polaritet" som "positiv". Gå til "Periode Summary" og gå inn på "Varighet Time ', den totale tiden for LC-analyse end ekvilibrering (35 min).
    7. I tabellen høyreklikk og velg 'Declustering Potential (DP) "og" Collision Energy (CP) for å legge til disse kolonnene i tabellen. Angi Q1, Q3, Tid (ms), ID, DP og CE-verdier for alle overganger, for en enkelt kjøtt arter, skapt i overgangslisten (se trinn 1.4.5).
      Merk: Tid (ms) refererer til oppholdstiden, tiden massespektrometret tilbringer skanning hver overgang, summering av disse skal ikke overskride 3 sek.
    8. Lagre oppkjøpsmetoden fil (filtype .dam).
      Merk: Trinn 1.5.2 - 1.5.8 må gjentas for hver kjøtt arter. Dette vil skape en enkelt metode fil for hver kjøtt art i skjermmodus i forberedelse til analyse nedenfor.
    9. I datainnsamling programvare, kan du klikke på "Hent" og velg "Ekvilibrer '. I boksen som åpnes, velger du ønsket overtakelsesmetoden for å begynne instrumentet likevekt.
    10. Sett prøverør i arack i auto sampler.
    11. Klikk på "File" og velg "New" og deretter "Acquisition Batch". I "Sample" fanen velg "Legg Set" og deretter "Legg Samples". Sett antall prøver som skal analyseres, og klikk på "OK". I "Erverv" -boksen velger du den metoden fil som skal brukes til analyse fra rullegardinmenyen.
    12. I tabellen velger 'Plate Kode' og velg riktig magasin konfigurasjon fra rullegardinmenyen. Venstre klikk på 'plate koden "kolonneoverskriften deretter høyreklikk og velg" Fyll ned ". I 'Vial plassering' enter posisjonen til hver prøve i auto sampler i radene.
    13. I 'Data File "angi filnavnet for oppkjøpet, deretter til venstre klikk på kolonneoverskriften fulgt av høyreklikke og velge" Fyll Down ". I 'Prøvenavn "sett inn identiteten til hver av prøvene som skal analyseres. Lagre som et oppkjøp batch-fil (fil eXTension .dab).
    14. Klikk på fanen "Send" og deretter markere prøvene som må analyseres på LC / MS. Klikk på "Send". Klikk på "Acquire og Start Sample" for å begynne analysen.
      Merk: Hver oppkjøpsmetoden vil skanne for MRM overganger over hele lengden av chromatograph for en enkelt kjøtt arter. Massespektrometer innstillinger for en MRM oppkjøp varierer i henhold til instrumenttype og peptid.
    15. Se de genererte datafiler ved hjelp av data visningsprogramvare. Klikk på xic (hentet ioner) og i rullegardinlisten markere alle fragmenter (Q3-verdier) for en enkelt forløper (Q1). En ny rute vil åpne som viser bare de valgte overganger.
    16. Record retensjonstid (R-t) for grupper av samtidige overganger siden disse svarer til et enkelt peptid.
    17. Gjenta de to foregående trinnene for hvert sett med overganger for å tildele toppene til sine respektive peptider for hverav kjøtt arter.
    18. Spill markøren peptider som er egnet til å gi artsidentifikasjon (for eksempel peptid HPGDFGADAQGAMTK, forløper m / z = 752, Rt = 12.0 min, for hest), sammen med deres retensjonstider, og legg merke som danner tilsvarende par som er egnet for relativ kvantifisering .
      Merk: For eksempel hesten markør peptid (forløper m / z = 752) har en tilsvarende oksekjøtt peptid, HPSDFGADAQAAMSK (forløper m / z = 767, Rt = 13,2 min).
    19. For å skape en dynamisk metode som omfatter alle de kjøtt art, i datavisnings programvare, for hver kjøtt art i sin tur åpner XIC overgangs dataene for hver forløper (overdratt til et bestemt peptid i 1.5.8).
    20. Zoom inn på topp klyngen på den valgte oppholdstid ved å venstreklikke og dra markøren under klyngen. Identifiser de mest intense overganger (ved å høyreklikke på topp etiketten).
    21. ta overgangene manueltog retensjonstider i et regneark.
    22. For å legge inn parametrene som en ny dynamisk metode på LC / MS-programvare, kan du klikke på «Mass Spectrometer" og klikk deretter på "Rediger parametre" for å gå inn i kildegass forhold. Velg "Scan Type" som "MRM (MRM)" og "polaritet" som "positiv".
    23. Gå til "Periode Oppsummering og angi varigheten tiden (angitt som den totale tiden for LC-analyse og likevekt). I tabellen høyreklikk og velg 'Declustering Potential (DP) "og" Collision Energy (CP) for å legge til disse kolonnene i tabellen.
      Merk: 'Time' kolonne nå refererer til den forventede oppholdstid (min) for hver overgang.
    24. I "Rediger parametre" -delen av LC / MS datainnsamling programvare, se 'Planlagt MRM boksen. Input Q1, Q3, Tid (min), ID, DP og CE verdier for overgangene opprettet i regnearket (1.5.21) og lagre oppkjøpsmetoden (file forlengelse .dam).
      Merk: Denne metoden reduserer typisk antallet MRM overganger til de fire mest intense for hvert peptid og skanner bare over retensjonstid vinduet for hvert peptid topp, noe som gir forbedret følsomhet og kvaliteten på dataene. A 'dynamisk' metode er en "guidet oppholdstid vindus 'metode, også kalt planlegging.

2. Utarbeidelse og analyse av kalibreringsprøver

  1. Utvinning av kjøttblandinger
    1. Ved hjelp av kjøtt tidligere frosset og deretter malt til et pulver, fremstille en rekke kjøttblandinger ved å veie de respektive mengder kjøtt (total masse på ca. 300 mg) i 15 ml plast sentrifugerør.
    2. Tilsett 4 ml ekstraksjonsbuffer (0,15 M kaliumklorid + 0,15 M fosfatbuffer ved pH 6,5). Vortex i 30 sek. Ekstraher på en lab risteapparat ved romtemperatur i to timer ved 250 sykluser / min.
      Merk: sykluser / min refererer seg til en oscillerende bevegelse.
    3. Overfør 2 ml avtrekke inn i et 2 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuger i 5 min ved 4 ° C ved 17000 x g.
    4. Overføre 200 ul alikvoter av supernatanten (reserverer en liten mengde for proteinanalyse, se 2.2) i 2 ml sentrifugerør og tørk ved hjelp av en sentrifugefordamper (forhåndsinnstilt program: 50 ° C, uten lufting og 120 min varighet).
  2. protein analyse
    1. Overføring 7 ul alikvoter av den reserverte supernatanten (se 2.1.4) in triplo til brønnene i en 96-brønners plate.
    2. Overføring 7 ul delmengder av en serie av proteinstandarder i tre eksemplarer, rekkevidde 0 til 1,0 mg / ml bovint serumalbumin (BSA), i den samme 96-brønners plate.
    3. Tilsett 200 ul av Coomassie pluss protein assay reagens til hver brønn.
    4. Visuelt sammenligne fargen på prøvebrønner med proteinstandarder for å undersøke prøvene er i området fra kalibreringsstandardene. Gjenta om nødvendig med fortynnede prøven slik at det blir innenfor rekkevidde.
    5. La platen til stog i 3 minutter.
    6. Burst alle boblene som har dannet med en kanyle.
    7. Analyser platen på plateleser ved bruk av en standard protokoll endepunkt ved en bølgelengde på 595 nm.
    8. Bestem proteinkonsentrasjonen i prøvene ved bruk av kalibreringsdata fra proteinstandarder.
      Merk: Dette er nødvendig for beregning av mengden av trypsin brukt i tryptiske fordøye.
  3. Proteolyse av kjøttblandinger
    1. Gjenoppløse den tørkede rest fra trinn 2.1.4 i 1 ml 25 mM ammonium-bikarbonat-løsning. Bland godt på en rotamixer.
    2. Følg protokoll fra trinn 1.1.3 til 1.3.7.
  4. Analyse ved LC / MS
    1. Sett opp LC / MS som tidligere (trinn 1.5.1).
    2. Opprett en ny anskaffelse batch som skissert tidligere (trinn 1.5.9 - 1.5.14), velge oppkjøpsmetoden opprettet i trinn på 1.5.24 som bruker en dynamisk LC / MS metode å kombinere alle de kjøtt arter, og skaffe data for de Digested kjøttprøver.
    3. Vise hele kromatogrammet i datavisningsprogramvare. Vise XIC for hver overgang satt i sving. Visuelt bekrefte hver klynge inneholder det nødvendige antall klokkeformede topper ved den forventede retensjonstid, for derved å bekrefte eksistensen av det valgte peptidet.
    4. Utfør kvantifisering ved hjelp av datavisning programvare for å integrere de travleste områder for hver av overgangene av interesse ved å dobbeltklikke på "Bygg Kvantitering Method" i navigasjonslinjen.
    5. I "Velg Sample 'uten velge" Data File "og" Sample "for å bli analysert for å generere en' Analytter bord.
    6. Klikk på fanen "Integrering" for å vise den første av overgangene (analytter) for å bli integrert.
    7. Klikk på "Analyttforringelse boksen for å vise nedtrekkslisten overganger. Velg hver overgang i sin tur til å vise det og visuelt bekrefte riktig peak er valgt for integrering. For å modify eller tvinge integrasjon, venstreklikk og dra markøren over målet peak (dette vil bli markert med grønt). Klikk på "Select Peak" -knappen, og klikk "Apply".
    8. Lagre arbeidsområdet som en metode fil (.qmf).
      Merk: Dette skaper en kvantifisering Metode fil for etterfølgende beregning av utvalgstopparealer.
    9. Dobbeltklikk på "Kvantitering Wizard" i navigasjonslinjen. I "Velg Samples" vindu lage "Kvantitering Set 'ved å velge en enkelt' Data File", deretter en eller flere 'Tilgjengelige Samples ". Velg Neste for å vise "Velg Innstillinger og Query" -boksen. Permisjon med mislighold, velg "Next" for å vise "Velg Method". Fra rullegardin 'Metode' boksen velg "Integrering metode" fil opprettet i trinn 2.4.8, deretter velg "Finish".
      Merk: Dette skaper en "Resultater Tabell ', inkludert overgangstopparealer som følge av kjøttblandinger.
      10. <li> Lagre 'Resultater Tabell' (filtype .rdb), eksport som en tekstfil (.txt) og åpne den i et regneark for å gjennomgå dataene.
    10. Plottet grafer av prosentandelen (ved overgang toppareal) av en kjøtt i et annet forhold til den målte prosentandel (w / w) av de to kjøtt for den valgte MRM for utvalgte overganger fra tilsvarende peptider, med fokus på de tilfeller hvor de to fragmentene inneholder samme antall aminosyrer som regnet fra den C-terminale ende.
      Merk: Identiske fragmenter med identiske fragmentering nettsteder gir optimale resultater.
    11. Undersøk plott fra 2.4.11 ovenfor. Enten visuelt eller ved hjelp av en trendlinje verktøy i plotting pakken, identifiserer en gruppe av plott som er både lineære og av samme gradient. Bruk en eller flere av disse CPCP pluss fragment kombinasjoner for kalibrering i det virkelige kjøttprøver.
      Merk: En graf som viser en uvanlig gradient kan tyde på enten peptid eller fragment undertrykkelse med en påfølgende reduksjon i signal strength. Ikke-lineære plott kan tyde på dårlig toppdeteksjon eller andre problemer.

3. kjøttprøver

  1. Utvinning av proteiner fra mål kjøttprøver
    1. Der det er aktuelt, avgiftsdirektoratet uvedkommende ikke-kjøtt materiale fra prøven med en slikkepott. For eksempel, skrape bort saus og pasta fra en kjølt lasagne.
    2. Vei opp 20 g av kjøttet i et metallbeger.
    3. Legg 100 ml 0,15 M kaliumklorid / 0,15 M kaliummonofosfat-buffer ved pH 6,5.
    4. Ekstraher proteinene ved å blande kjøttet i en høyhastighets homogenisator i 1 min.
    5. Følg protokoll fra trinn 2.1.4 - 2.3.2.
  2. Analyse av prøver ved LC / MS
    1. Gjenta trinn 2.4.2 Innhenting av data ved hjelp av dynamisk LC / MS-metoden.
    2. Identifisere peptider fra hver kjøtt myoglobin som utføres i trinn 2.4.3.
    3. For kvantifisering, bruke kvantifisering programvare for å integrere de travleste områdene for hver overgang av interesse,som beskrevet i trinn 2.4.9.
    4. For identifisering av arter i en blanding, registrere dem markør peptider som tilfredsstiller avtalte kriterier for antall overganger og signal til støy for disse overgangene.
    5. For kvantifisering, bruke integrerte overgang topparealer som er godkjent fra trinn 2.4.12 og, ved hjelp av prosentandelen av overgangstopparealet, beregne prosentandelen av myoglobin fra de to arter i blandingen.
    6. Bruk tidligere kunnskap fra litteraturen 18 fra sannsynlige myoglobin nivåene i kjøtt for å anslå de relative vekt / vekt mengder av to kjøtt tilstede i prøven.

Representative Results

I en enkelt dynamisk-modus MRM eksperiment hver programmert overgang er registrert separat (som detektor tellinger per sekund, eps) over en spesifisert oppholdstid vinduet. Derfor, fra alle data oppsamlet i en eksperiment, toppintensiteten for hver overgang individuelt kan ekstraheres. Da den eneste endelige signal er for oppholdstiden vinduet angitt for denne overgangen. Utsiden av vinduet, er det signal null per definisjon. Signalet for enhver overgang, for eksempel 752 → 1269 fra hest (peptid monoisotopic masse 1,501.66 dalton, forløper ion m / z 751.84 dalton, lade stat = 2, fragment ion y 13) har typisk å konkurrere bare med målestøy og ikke fra andre overgangs topper som kan kanskje være fra andre arter. Utgangen er derfor et sett med rene topper, én for hver overgang, til en felles retensjonstid for de overganger som deler en felles forløper ion.

Figur 1 viser utgangs for settet av fire overganger 752 → (1269, 706, 248, 1366) for en blanding av 1% w / w hest i biff. Siden de fire overgangene som vises er forbundet med hest, og er fraværende i prøver av ren biff, lam eller svinekjøtt, disse toppene betegne tilstedeværelsen av hest. Avhengig av robusthet kriterier, et sett av to eller flere overganger hver overstiger noen spesifiserte signal-til-støy-nivå etablerer identifikasjon. Dette tallet etablerer dermed nærværet av hest i en blanding av 1% vekt / vekt hest i storfekjøtt.

Av og til er et enkelt isolert overgang oppdaget. Dette indikerer en mulighet match av forløper-ioner og et enkelt fragment, muligens fra en fremmed protein, med det som kan forventes fra systemet og programmert inn i massespektrometeret. Den enestående natur av toppen, og dens forekomst i en uventet oppholdstid, er den signature av en tilfeldig overgang som kan ignoreres.

Arealet under hver overgang topp kan beregnes individuelt. Basert på et passende fragment, forholdet mellom hesten til oksekjøtt overgangstopparealer, for eksempel 752 → 1269 (hest) til 767 → 1299 (okse), vil være proporsjonal med forholdet mellom selve kjøttet i blandingen. Figur 2 viser en plott av prosentandel av topparealet for disse to overganger versus den prosentvise vekt for vekt av hest i en blanding av hest med oksekjøtt. Dersom prosentandelen overgangstopparealene møter den prosentvise vekt for vekt av kjøtt da skråningen er 1. Hellingen i dette plottet er 1,03, noe som indikerer at, for disse overganger og CPCP par, overgangtopparealene gi et pålitelig mål på de relative mengder av de to kjøtt i blandingen. Dersom hestekjøtt i prøven var dobbelt så rik på myoglobin som oksekjøtt deretter, sammen med andre faktorer uforandret, helningen av linje vil være større enn en.

Figur 1
Figur 1. MRM overgangs intensiteter versus oppholdstid for 1% w / w hest i biff. Overgangene er 752 → (1269, 706, 248, 1366), vist i oransje, svart, blå og grønn, henholdsvis. Markøren peptid er HPGDFGADAQGAMTK. De fire overgangs fragmentene kan betegnes y 13, y 7 y 2 y og 14, henholdsvis, hvor y n betyr telling i n aminosyrer fra peptidets C-terminale ende. Signal til støy varierer 23-53 i løpet av de fire overganger. En ekstra røde linjen angir 752 → 1269 overgang til 0% hest, 100% storfekjøtt for sammenligning. Bare den ikke-null-regionen av oppholdstiden blir vist. Dette tallet har blitt forandret fra Watson et al. 3.es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Plot av hest i storfekjøtt, som prosent vekt for vekt, sammenlignet med hest i storfekjøtt som prosent overgangstopparealet. Plottet benytter par av peptider oksekjøtt (767) og hest (752) og y 13 fragment ion for begge. Hvis A betegner topparealet så ordinaten er 100 A H / (A H + A B). Skråningen av beste tilpasset linje (R 2 = 0,99) er 1,03. Dette tallet har blitt forandret fra Watson et al. 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Utvelgelsen av en passende målprotein er viktig. Et godt mål protein må ha tilsvarende former i arter av interesse, tilstrekkelig artsavhengige sekvensvariasjon, arter spesifisitet, og eksisterer i tilgjengelige mengder innenfor de organismer. For vurdering av blandinger som har gjennomgått behandlingen (for eksempel varmebehandling), et protein med en sekvens forholdsvis immun mot at behandling er ønskelig. Myoglobin er en god kandidat for rødt kjøtt, inkludert kokt rødt kjøtt, men er ikke den eneste muligheten. Når mål-proteinet er bestemt, er den mest kritiske del av protokollen er proteinet proteolyse. Et protein forskjellig fra myoglobin kan godt kreve en alternativ proteolyse protokollen.

Protokollen som beskrevet omfatter et segment basert på henvisning renset protein. Målet er å oppdage oppbevaring tidsvinduer og egnede forløper og fragmentioner. Dette segmentet er svært nyttig, men ikke avgjørende.

figur 2). Dette er fordi den sistnevnte peptid som oppstår fra en forholdsvis trykt KE spalting, forårsaker en under-estimat av nivået av hesten i blandingen. Tilsvarende peptider som starter med forskjellige aminosyrer er derfor best unngås. Ofte fragmenter fra to tilsvarende peptider har identiske aminosyresekvenser og veloppdragen, men dette er ikke alltid tilfelle, og må kontrolleres under metodeutvikling. Artsbestemmelse er mye mindre følsom for disse problemene enn relativ kvantifisering.

Protokollen er påvist i fire rødt kjøtts 3. Andre kjøtt art kan inkluderes, selv om kvaliteten av overgangstoppform kan forringes hvis for mange peptider markør ko-eluerte, effektivt redusere oppholdstiden, og til slutt nedbryte relative kvantiteringsstandarder anslag. Forbedret instrumentering, som allerede er tilgjengelig, vil forbedre dette. Et beslektet problem er at ikke alle kjøtt har forskjellige myoglobins. For eksempel, hest, esel og sebra myoglobins er identiske og dermed strengt tatt metoden er bare i stand til å oppdage hest eller esel eller sebra i biff. I noen tilfeller, selv om myoglobins ikke er identiske, kan noen viktige peptider være. For eksempel, noen lam myoglobin-avledet markør peptider vises også i geit.

En komplikasjon som vender mot denne og andre proteinbaserte deteksjonsmetode er at proteinnivået må antas konstant over alle arter dersom protein eller peptid-nivåer er å likestille trivielt å nivåer av kjøtt i en blanding. For myoglobin og fire røde mspiser dette er ikke universelt sant. Nivåene generelt er artsavhengig, med svinekjøtt oppviser det laveste nivået av de fire. I tillegg varierer den myoglobin nivå med kjøtt og dyr snitt alder. Så selv om forholdene mellom overgangstopparealene kart på en pålitelig måte til prosenter av myoglobin, kartleggingen til forholdet mellom selve kjøttet er et anslag tegning på antagelser om sannsynlige kilder for kjøtt i blandingen.

Fremgangsmåten som er beskrevet i dette arbeidet skiller seg på flere måter fra andre publiserte bidrag. En mer typisk rute er å bruke proteomic metoder for å identifisere forskjellige uensartede artsspesifikke markør peptider, i hvilket tilfelle markører for forskjellige arter besitter ingen bestemt forhold til hverandre 8-12,14,19. Derimot, har vi valgt proteiner som er felles for alle arter av interesse opp til artsavhengige sekvensvarianter tre. Bortsett fra å være sentral i vår relative kvantifisering strategi, har dette den fordelen at prøvenforberedelse strategier kan optimaliseres. I tillegg kan slike korresponderende proteinene kan forventes å oppføre seg på samme måte, for eksempel ved ekstraksjon eller ved kommersiell behandling av prøver som matlaging eller hermetisering. Artsidentifikasjon deretter forløper normalt via detektering av ulike peptider markør, mens i de CPCP tilnærmingen arten identifikasjons fortsetter via detektering av nært beslektede peptider som innehar vanligvis en eller to sekvensforskjeller. Til slutt, kvantifisering av proteiner til å estimere vektprosent av en art i en annen kan på vanlig måte skje via absolutt mengdebestemmelse av hvert protein separat basert på kjente standarder 7,14,15. Men ved hjelp av CPCP metode er det ikke behov for kalibreringsmetoder. I stedet er relative nivåer estimert ved å sammenligne signalstyrkene til to tilsvarende peptider fra de to artene, utenom den absolutte måletrinnet fullstendig. Siden det endelige målet er en vektprosent av en art i another, en relativ kvantifisering, så CPCP er både mer direkte og enklere enn å sammenligne to absolutte kvantiteringsstandarder målinger. Disse funksjonene oversette til korte eksperimentelle ganger forventet å være om lag to timer ved hjelp av raffinerte protokoller, slik at teknikken er nyttig som en rask overvåking verktøy i riket av mat svindeldeteksjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uniprot database www.uniprot.org Freely accessible database of protein sequences
Skyline software www.skyline.gs.washington.edu Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com O9830
Methanol, HPLC grade Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 10674922
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 10010010
Urea Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com U5378
Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK) Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com T1426
Formic acid  Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com F0507
Coomassie Plus Protein Assay Reagent Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com 1856210
Protein standard Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com P0914
Ultra Turrax homogeniser T25 Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk 13190693
Edmund and Buhler KS10 lab shaker
Heraeus Fresco 17 Centrifuge Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com 75002420
Vacuum centrifuge RC 1022 Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes Phenomenex, Macclesfield, UK 8B-S100-UBJ
4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com
1200 rapid resolution LC system Agilent, Stockport, UK
XB C18 reversed-phase capillary column (100 mm x 2.1 mm, 2.6 µm particle size) Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 software AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration
Autosampler vials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Mahony, P. J. Finding horse meat in beef products-a global problem. QJM-An Int. J. Med. 106, 595-597 (2013).
  2. Sentandreu, M. A., Sentandreu, E. Authenticity of meat products: Tools against fraud. Food Res. Int. 60, 19-29 (2014).
  3. Watson, A. D., Gunning, Y., Rigby, N. M., Philo, M., Kemsley, E. K. Meat Authentication via Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry of Myoglobin Peptides. Anal. Chem. 87, 10315-10322 (2015).
  4. Food Standards Agency. Report of the investigation by the Food Standards Agency into incidents of adulteration of comminuted beef products with horse meat and DNA. , (2013).
  5. Taylor, A. J., Linforth, R., Weir, O., Hutton, T., Green, B. Potential of electrospray mass-spectrometry for meat pigment identification. Meat Science. 33, 75-83 (1993).
  6. Ponce-Alquicira, E., Taylor, A. J. Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species. Food Chem. 69, 81-86 (2000).
  7. Gallien, S., Duriez, E., Domon, B. Selected reaction monitoring applied to proteomics. J. Mass Spectrom. 46, 298-312 (2011).
  8. Orduna, A. R., Husby, E., Yang, C. T., Ghosh, D., Beaudry, F. Assessment of meat authenticity using bioinformatics, targeted peptide biomarkers and high-resolution mass spectrometry. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1709-1717 (2015).
  9. Claydon, A. J., Grundy, H. H., Charlton, A. J., Romero, M. R. Identification of novel peptides for horse meat speciation in highly processed foodstuffs. Food Addit. Contam. Part A-Chem. 32, 1718-1729 (2015).
  10. von Bargen, C., Brockmeyer, J., Humpf, H. U. Meat Authentication: A New HPLC-MS/MS Based Method for the Fast and Sensitive Detection of Horse and Pork in Highly Processed Food. J. Agric. Food Chem. 62, 9428-9435 (2014).
  11. von Bargen, C., Dojahn, J., Waidelich, D., Humpf, H. U., Brockmeyer, J. New Sensitive High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Method for the Detection of Horse and Pork in Halal Beef. J. Agric. Food Chem. 61, 11986-11994 (2013).
  12. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Authentication of processed meat products by peptidomic analysis using rapid ambient mass spectrometry. Food Chem. 187, 297-304 (2015).
  13. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid detection of Peptide markers for authentication purposes in raw and cooked meat using ambient liquid extraction surface analysis mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).
  14. Sentandreu, M. A., Fraser, P. D., Halket, J., Patel, R., Bramley, P. M. A Proteomic-Based Approach for Detection of Chicken in Meat Mixes. J. Proteome Res. 9, 3374-3383 (2010).
  15. Elliott, M. H., Smith, D. S., Parker, C. E., Borchers, C. Current trends in quantitative proteomics. J. Mass Spectrom. 44, 1637-1660 (2009).
  16. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  17. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE, Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2016).
  18. Keeton, J. T., Ellerbeck, S. M., Nunez de Gonzalez, M. T. Encyclopedia of Meat Sciences. Devine, C., Dikeman, M. 1, Academic Press. 235-243 (2014).
  19. Montowska, M., Alexander, M. R., Tucker, G. A., Barrett, D. A. Rapid Detection of Peptide Markers for Authentication Purposes in Raw and Cooked Meat Using Ambient Liquid Extraction Surface Analysis Mass Spectrometry. Anal. Chem. 86, 10257-10265 (2014).

Tags

Biokjemi biokjemi Kjøtt autentisering flere reaksjonsmåte massespektrometri myoglobin peptider relativ kvantiteringsstandarder artsspesifikke
Arter Bestemmelse og kvantifisering i blandinger Bruke MRM massespektrometri av Peptider Applied til Meat Authentication
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gunning, Y., Watson, A. D., Rigby,… More

Gunning, Y., Watson, A. D., Rigby, N. M., Philo, M., Peazer, J. K., Kemsley, E. K. Species Determination and Quantitation in Mixtures Using MRM Mass Spectrometry of Peptides Applied to Meat Authentication. J. Vis. Exp. (115), e54420, doi:10.3791/54420 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter