Introduction
Кишечника является крупнейшим поверхности тела, которая подвергается воздействию внешней среды. Обширные массивы резидентных микробов колонизировать кишечник человека с образованием кишечной микробиоты (или микрофлору). Это, по оценкам, состоит до 100 триллионов клеток микроорганизмов и является одним из самых густонаселенных бактериальных сред обитания известных в биологии 1-3. В GIT бактерии заселяют кишечную нишу , где они выживают и размножаются 4. В свою очередь, микрофлора жертвует хозяина с дополнительными функциональными особенностями не закодированы на своем геноме 1. Например, микрофлора стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток, производит витамины , которые проходят не может производить самостоятельно, регулирует обмен веществ и защищает от патогенных микроорганизмов 4-6. Учитывая это выгодные отношения, некоторые авторы полагают , что люди являются «супер-организмы" или "holobionts" , которые представляют собой сочетание бактериальных и человеческих генов 7,8, Учитывая благотворное влияние микробиоты на (человека) хозяина, кишечная иммунная система должна терпеть комменсальных микробы , с тем чтобы их существование в просвет , но и убивают болезнетворные микроорганизмы , которые вторгаются с полостной стороны 9-11. Кишечный иммунная система разработала механизмы различать между безвредные и потенциально вредных микробов в просвете; Однако эти механизмы еще далеко не понята 12. Поддержание целостности кишечника требует жестко регулируется иммунного гомеостаза , чтобы сохранить баланс между толерантностью и иммунитета 13. Дисбаланс иммунного гомеостаза способствует индукции кишечных заболеваний , таких как воспалительное заболевание кишечника (IBD) 3,14.
Существуют два основных типа IBD: болезнь Крона (CD) и язвенного колита (ЯК). У больных с этими заболеваниями , как правило , страдают от ректального кровотечения, тяжелая диарея и боли в животе 15,16. Единственная причина IBD по-прежнемунеизвестен, но сочетание генетических факторов, воздействия окружающей среды и дизрегуляции иммунных реакций может быть ключевым событием для развития болезни 15.
Животные модели для IBD были использованы в течение более 50 лет. В последние несколько десятилетий новые модельные системы IBD были разработаны для проверки различных гипотез о патогенезе IBD 17,18. Наиболее характеризуется модель хронического колита является модель переноса Т-клеток , что вызывает нарушение Т-клеточного гомеостаза 19,20. Эта модель включает в себя перенос наивных Т - клеток от иммунокомпетентных мышей в хозяев , которые испытывают недостаток Т и В-клеток (например, КГР - / - и SCID мышей) 16,21. Развитие болезни в этой модели отслеживается в течение 3-10 недель, оценивая наличие диареи, снижение физической активности, а также потерю массы тела. Это так называемый синдром расточительствуя 16. По сравнению с здоровых мышей толстой ткани пересаженных хозяев является Тикг, короче и тяжелее 16. С помощью модели переноса Т - клеток, можно понять , каким образом различные популяции Т - клеток может внести свой вклад в патогенез IBD 22. Модель переноса Т-клеток не анализирует взаимодействие между АРС и Т-клеток в процессе болезни в антиген-специфическим образом. Было показано , что взаимодействие между миелоидных клеток и лимфоидные клетки могут быть ответственны за развитие воспаления кишечника 23. Хотя многие аспекты IBD были выяснены, начальные события, которые приводят к развитию болезни по-прежнему необходимо четко понимать.
Было показано , что при отсутствии передачи микрофлора колита не может быть установлено 24. В последнее время , несколько теорий , позволяют предположить , что ВЗК может быть результатом иммунной реакции против синантропных бактерий 25. Авторы также предложили, что синантропных бактерий необходимы, чтобы вызвать воспаление в дистальной кишке26. В свободных от бактерий (GF) животных кишечной иммунной системы , как правило , с нарушениями 27,28, но колонизация этих мышей со смесью специфических-патогена бактерий приводит к развитию полностью компетентной кишечной иммунной системы 29. Следовательно, микрофлора , как представляется, является ключевым элементом в патогенезе IBD, либо в качестве механизма , который предрасполагает или защищает от развития кишечных воспаления 30,31. Современные теории предполагают , что IBD является результатом микробного дисбаланса, называемого дисбактериоза, у генетически предрасположенных пациентов 32, но пока не ясно , если дисбактериоз является причиной или следствием заболевания 12. Принимая во внимание роль микроорганизмов в развитии IBD, в пробирке эксперименты показали , что CD4 + Т - клетки могут быть активированы с помощью АРС импульсными с кишечными бактериями 33,34.
Кроме того, было показано, что антигены изразличных синантропных видов бактерий, таких как E. палочка, Bacteroides, Eubacterium и Proteus, способны активировать CD4 + Т - клеток 35. Это указывает на то, что представление бактериальных антигенов Т-клеткам имеет важное значение для развития IBD. Для того, чтобы уменьшить сложность нескольких антигенов , полученных микрофлорой в процессе болезни, штамм E.coli был создан , который производит антиген OVA. Передача колиты индуцировали путем инъекции OVA-специфических Т - клеток в КГР - / - животные колонизировали с OVA-экспрессирующие E. палочки.
Эта модель основана на последних данных , свидетельствующих о том , что CX 3 CR1 + депутаты, главным подмножество клеток в собственной пластинке слизистой оболочки толстой кишки (CLP) 36, взаимодействуют с CD4 + Т - клеток во время передачи колита 37. Депутаты образца просвет кишечника по отношению к антигену частиц, таких как бактерии, используя их дендриты 36, 38,39. Предыдущие исследованияпоказали , что депутаты могут также занять растворимые антигены, такие как OVA, введенные в просвете кишечника 40,41. Учитывая обилие СХ 3 CR1 + MPs в ПСЯ, вполне возможно , что эти клетки могут попробовать бактерии и в его стенке взаимодействуют с CD4 - Т - клетками. Конфокальной изображения мышей трансплантировали OVA-специфических CD4 + Т - клеток с колонизацией Е. палочка КФП-ОВА, показывают , что СХ 3 CR1 + депутаты находятся в контакте с ОТ-II CD4 + Т - клеток при разработке антигенного управляемой колита. Эта модель позволяет исследовать процесс презентации антигена между кишечными БТРах и Т-клеток, специфичных только для конкретных антиген-экспрессирующими бактерий в просвет кишечника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мыши были выведены и держали под конкретного патогена (SPF) условиях в виварии из университета Ульма (Ульм, Германия). Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами местного использования животных и комитетом по уходу и права национального благосостояния животных.
1. Строительство PCFP-OVA плазмиды
- Amplify полный ген размер OVA с использованием праймеров Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') и Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 с использованием плазмиды пКи-OVA (устойчивых к ампициллину) 42 в качестве матрицы. Клонирование продукта ПЦР (то есть последовательности , кодирующей OVA) в коммерчески доступный фагов середине вектор с использованием SpeI и ClaI Ограничения участки праймеров и вектора , чтобы получить конкретную OVA-плазмиды.
- Амплификации гена КФП-кодирования вместе с сильным конститутивным промотором Р гипер с использованием плазмиды пэду 1 43 в качестве матрицы и праймеров , CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') и CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
- Клонирование гена CFP-кодирования в специфическую ОВА-плазмиды (ампициллин устойчивостью) , используя сайты рестрикции SpeI и SacI праймеров и вектора 37. Это вводит распорку 6 остатков глицина между CFP-кодирования из последовательности OVA-кодирования.
2. Строительство Е. coli PCFP-OVA
- Grow E.coli штамма DH10B в 100 мл Лурии Бертани (LB) среде аэробно при 37 ° С на ротационном шейкере в течение ночи.
- Смешайте 800 мкл бактериальной культуры с 200 мкл глицерина для создания глицерине и хранят при -80 ° С.
- Добавляют 50 мкл E.coli штамма DH10B из раствора в глицерине в 5 мл LB-среды и выращивают их в аэробных условиях при 37 ° С на ротационном шейкере Овеrnight.
- Перенести культуру в разделительными перегородками 1-литровую колбу Эрленмейера с 250 мл LB среды при 37 ° С в роторном дрожанием.
- Grow бактерии до оптической плотности при 600 нм (OD 600) 0,5, а затем охладить культуру на льду в течение 30 мин. Центрифуга бактерии при 5000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- Ресуспендируют бактерии с 100 мл ледяной стерильной H 2 O и центрифугами бактерий в количестве 5000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С ресуспендирования бактерий с 100 мл охлажденного льдом 10% глицерина и центрифуге бактерий при 5000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Повторите этот последний шаг дважды.
- После заключительной стадии промывки, ресуспендируют бактерий в 700 мкл 10% -ного глицерина. Замораживание 50 мкл аликвоты в жидком азоте и хранят при -80 ° С.
- Оттепель 50 мкл аликвоты на льду и переноса в предварительно охлажденную кювету для электропорации (2 мм), расстояние между электродами.
- Добавьте 5 мкл плазмидной ДНК (100 нг) в 50 мкл E. палочки aliquoц. Выполните электропорации с помощью одного импульса при 25 мкФ, 200 Ом (Ом) и 2,5 кВ.
- Ресуспендируют бактерий в 1 мл подогретого SOC среднего (5 г / л дрожжевого экстракта, 2 г / л триптона, 10 мМ хлорида натрия, 2,5 мМ хлорида калия, 10 мМ хлорид магния, 10 мМ сульфат магния) и инкубируют при температуре 37 ° С аэробно в течение 1 часа.
- Пластинчатые бактерии на LB-чашках с агаром с добавлением ампициллина, 100 мкг / мл (100 мкл 100 мг / мл ампициллина запаса в 100 мл LB-агар) и инкубировать в течение ночи аэробно при 37 ° С.
- Выберите одиночные колонии и повторное их в полосу LB-чашки с агаром, дополненной ампициллин 100 мкг / мл. Выдержите в течение ночи аэробно при температуре 37 ° С.
- Выберите одиночные колонии и выращивают их в течение ночи в 10 мл LB среде с ампициллин 100 мкг / мл для выделения плазмид. Используйте имеющиеся в продаже плазмиды мини - набор подготовительную и элюции плазмидной ДНК с 30 мкл дН 2 O (дистиллированная вода) в зависимости от производителя ", S протокол. Проверьте плазмид путем рестрикционного анализа и секвенирования ДНК 37,42,43.
- Настройка культуры положительных клонов Е. палочка PCFP-ОВА в 100 мл LB среды с добавлением ампициллина , 100 мкг / мл. Grow аэробно при 37 ° С на ротационном шейкере в течение ночи.
- Смешайте 800 мкл бактериальной культуры с 200 мкл чистого глицерина и хранят при -80 ° С.
- Центрифуга остальную часть ночной культуры при 5000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) и ресуспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере (PBS). Поместите 10 мкл суспензии на предметное стекло и накройте ее покровным.
- Обратите внимание на образцы в стандартной флуоресцентной микроскопии для подтверждения экспрессии флуоресценции CFP-OVA (CFP возбуждение при 450 нм, излучение на длинах волн 480 нм). Анализ бактерий, начиная с увеличением 400X.
- Центрифуга 1 мл бактерий из ночных культур в количестве 5000 мкг в течение 10 мин, RT. Ресуспендируют осадок в 40 мклPBS и кипят при температуре 95 ° С в течение 10 мин.
- Центрифуга образцов при 30000 х г в течение 10 мин и используют супернатанты для Вестерн - блот - анализа 37. Используйте кролика-рейз против OVA поликлональные антитела, разбавленного 1: 400.
3. Генерация OT-II / Красный Мыши
- Крест мужчина / женщина OT-II мышь с женской / мужской мыши , выражающей красный флуоресцентный белок (оба штамма имеются в продаже) для того , чтобы генерировать OT-II / Red мышей 37.
4. Селезенка Выделение клеток
- Эвтаназии ОТ-II / Red мышей путем смещени шейных позвонков после анестезии при вдыхании любого галоидированного эфира (до 5% индукции), коммерчески доступны.
- Используйте ножницы, чтобы вырезать левой верхней брюшной части мыши. Под этим брюшной части есть селезенка (овальной формы с темно-красного цвета). Используйте ножницы и пинцет, чтобы удалить его.
- Извлечение селезенке / красный мышей ОТ-II и передать его через 100ячейки фильтра мкм расположены по 50 мл пробирку с помощью плунжера шприца емкостью 1 мл, чтобы получить одно-клеточной суспензии. Промыть сетчатый фильтр дважды с 10 мл PBS с добавлением 1% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS).
- Центрифуга клеточной суспензии при 390 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют осадок с помощью 5 мл подогретого буфера для лизиса (144 мМ NH 4 Cl, 17 мМ Трис, рН = 7,2) , чтобы лизировать красные кровяные клетки. Инкубировать 10 мин при 37 ° С.
- Отмывки образца с 25 мл PBS с добавлением 1% FBS. Центрифуга при 390 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют осадок в 10 мл PBS с добавлением 1% FBS.
- Граф клеток с использованием счетной камере Neubauer. Смешайте 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего. Инкубируют в течение 1-2 мин.
- Заполните гемоцитометра камеру с 10 мкл окрашенных клеток. Граф клеток под микроскопом в четырех 1 х 1 мм 2 квадраты одной камеры и determinе среднее число клеток на квадратный. Жизнеспособные клетки появляются белые, мертвые клетки кажутся синими. Для того, чтобы определить количество клеток / мл умножить число клеток на коэффициент разбавления. Если 2-4 квадранта подсчитываются, делят на число квадрантов.
5. CD4 + CD62 L + T Cell Обогащение
- Пополните клетки селезенки для CD4 + CD62L + Т - клеток с помощью набора магнитной изоляции с использованием принципов негативного или позитивного отбора. Здесь используют негативный отбор для выделения CD4 + Т - клеток и использовать положительный отбор для дальнейшего обогащения для CD62L + населения в пределах клеточного пула CD4 + T.
Примечание: В отрицательной процедуре отбора, клетки, которые не будут изолированы (здесь: все CD4 отрицательные клетки) помечены специфическими антителами, связанными с магнитными микрогранул. Во время стирки колонки шаги CD4 + Т - клетки будут проходить через колонку таким образом , чтобы они могли быть ПодобнееLY собраны. В положительном процедура отбора клеток, которые будут изолированы помечены соответствующим антителом в сочетании с магнитными микрогранул. Во время стирки колонки шаги меченые клетки будут оставаться в колонке, и они могут быть собраны путем удаления колонки из магнитного поля и прополоскнуть буфером. - Для отрицательной процедуры отбора, ресуспендируют 10 7 тотального количества клеток селезенки в 40 мкл холодного PBS , дополненной 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Добавьте 10 мкл биотин маркированы коктейль антител , поставляемой в комплекте магнитной изоляции (специфических антител , связывающих не-CD4 + Т - клеток) и инкубировать в течение 15 мин на льду.
- Добавьте 30 мкл холодного PBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 20 мкл анти-биотин микрогранул. Инкубировать 20 мин на льду.
- Добавить в образце 10 мл PBS с 0,5% BSA и центрифуге, дополненной при 390 х г в течение 5 мин. Повторите этот шаг дважды. Ресуспендируют клеток в 1 мл холодного PBS, дополненной 0,5% BSА.
- Поместите колонку, специфичного для отрицательной процедуры отбора в магнитном поле и промыть 3 мл холодного PBS с 0,5% BSA, дополненной на колонку. Добавить клеточной суспензии на колонку и промыть 3 раза с 3 мл холодного PBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина.
- Центрифуга клетки истекающей при 390 х г в течение 5 мин. Стоки прохождения через колонку содержит немаркированные CD4 + Т - клеток. Ресуспендируют осадок в 1 мл PBS, дополненной 0,5% БСА и подсчета клеток.
- Граф клеток с использованием счетной камере Neubauer. Смешайте 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего. Инкубируют в течение 1-2 мин.
- Заполните гемоцитометра камеру с 10 мкл окрашенных клеток. Граф клеток под микроскопом в четырех 1 х 1 мм 2 квадраты одной камеры и определить среднее число клеток на площади. Жизнеспособные клетки появляются белые, мертвые клетки кажутся синими. Для того, чтобы определить количество клеток / мл умножить Celл число на коэффициент разбавления. Если 2-4 квадранта подсчитываются, делят на число квадрантов.
- Для положительного процедуры отбора, добавьте 10 мкл CD62L микрошариков на 10 7 предварительно обогащенной фракции клеток CD4 + T. Инкубировать 15 мин на льду.
- Добавить в образце 10 мл PBS с 0,5% BSA и центрифуге, дополненной при 390 х г в течение 5 мин. Повторите этот шаг дважды. Ресуспендируют в 500 мкл холодного PBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина.
- Поместите конкретный столбец для отрицательной процедуры отбора в магнитном поле и промыть 500 мкл холодного PBS, дополненной 0,5% бычьего сывороточного альбумина на колонку. Добавить клеточной суспензии на колонку и промыть 3 раза с 500 мкл холодного PBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина.
- Удалить столбец из магнитного поля и поместить его на подходящую пробирку. Добавить 1 мл PBS , дополненной 0,5% БСА в колонку и вымывать CD4 + CD62L + Т - клеткиы удерживается в колонке, плотно нажимая на поршень в колонну.
Примечание: Выделенные CD4 + CD62L + Т - клетки теперь готовы для последующих приложений, таких как эксперименты в естественных условиях. В соответствии с инструкцией изготовителя из комплекта изоляции клетки CD4 + CD62L + Т, микрошариков не являются токсичными. Из-за небольшого размера (около 50 нм), они не активируют клетки, и они не будут насыщать клеточной поверхности эпитопы. Поэтому выделенные клетки могут быть перенесены в иммунодефицитных мышей , чтобы побудить колита 37,44,45. - Граф клеток с использованием счетной камере Neubauer. Смешайте 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего. Инкубируют в течение 1-2 мин.
- Заполните гемоцитометра камеру с 10 мкл окрашенных клеток. Граф клеток под микроскопом в четырех 1 х 1 мм 2 квадраты одной камеры и определить среднее число клеток на площади. Жизнеспособные клетки appeaг белые, мертвые клетки кажутся синими. Для того, чтобы определить количество клеток / мл умножить число клеток на коэффициент разбавления. Если 2 - 4 квадранта подсчитываются, делят на число квадрантов.
6. Индукционный антигенпрезентирующих ведомой Колит
- Вводят внутрибрюшинно 3 х 10 5 OT-II / Красный CD4 + CD62L + Т - клеток в CX 3 CR1 / GFP + х КГР - / - мышей. Для индукции антиген-специфического колита, администрировать E. палочка PCFP-ОВА каждый второй день в дозе 1 × 10 8 колониеобразующих единицы (CFU) в 100 мкл PBS на одно животное через желудочный зонд или пероральном инстилляции за резцами.
- Монитор два раза в неделю вес тела трансплантированных мышей и их клиническое состояние (наличие крови в стуле, консистенции стула и активности мышей).
7. Образцы ткани для гистопатологического исследования
- Возьмите образцы ткани из-йе толстой кишки мышей, фиксируют в нейтральном буферном растворе формалина (10%), встраивает в парафине , как описано выше 36,46.
- Раздел образцы парафина на микротомом, смонтировать на слайдах, а также выполнять пятно 47,48 H & E.
- Классифицировать гистологию толстой кишки, опубликованной ранее 47,48: нормальный (0 баллов); мягкий колиты (1 балла), умеренная колиты (оценка 2) и тяжелой колита (3 балла).
8. Выделение Толстокишечная Propria клеток Lamina
- Эвтаназии трансплантированных мышей путем смещения шейных позвонков после анестезии при вдыхании любого галогенированного эфира (до 5%) для индукции коммерчески доступного.
- Поместите животное вниз с животом вверх. Используйте пинцет, чтобы захватить кожу кпереди, чтобы отверстие мочеиспускательного канала. Используйте ножницы, чтобы разрезать кожу вдоль вентральной срединной линии от паха до груди. Потяните кожу обратно по бокам.
- Вырезать через прозрачную брюшную стенку мышц иоткрывая полость тела. Определить толстую кишку , которая идет от заднего прохода к слепая кишка 49. Нарезать 2 конечностями и освободить ткань от любого жира.
- Откройте толстую кишку в продольном направлении с использованием рассечение ножницами. Используйте пинцет, чтобы встряхнуть ткани толстой кишки в чашку Петри, содержащую 25 мл PBS с добавлением 1% FBS для удаления мусора и слизистой. Вырезать толстую кишку на 5 - 8 мм штук.
- Поместите сегменты толстой кишки в 50 мл пробирку, содержащую 20 мл промывочного буфера. Буфер Wash содержит 500 мл DPBS, 10мм Hepes и 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
- Vortex через трубку в течение 30 с при максимальной скорости.
- Инкубируйте пробирку с сегментами двоеточием в водяной бане при температуре 37 ° С с 200 оборотов в минуту встряхивания в течение 10 мин.
- После инкубации вихревые трубки в течение 30 с при максимальной скорости.
- Откажитесь супернатанты и поместить образцы ткани в новой 50 мл пробирку, содержащую 20 мл буфера для промывки. Повторите шаги 6-9 три раза
- Откажитесь от Supernatants и поместить образцы ткани в чашку Петри, содержащую 25 мл PBS. Используйте пинцет, чтобы осторожно встряхните образцы ткани в чашке Петри в течение нескольких секунд, чтобы удалить остаточные эпителиальные клетки. Повторите этот шаг три раза.
- Вырезать толстой ткани в 2 х 2 мм 2 части и переваривают их путем инкубации в 10 мл института Roswell Park Memorial (RPMI) среде с 0,5 мг / мл коллагеназы типа VIII из Clostridium histolyticum и 10 ед / мл DNAseI.
- Vortex через трубку в течение 30 с при максимальной скорости.
- Инкубируют фрагменты толстой кишки на водяной бане при температуре 37 ° С при 200 оборотов в минуту встряхивания в течение 35 мин и вихревые трубки в течение 30 с при максимальной скорости через каждые 5 мин.
- В конце инкубации вихревой трубки в течение 30 с при максимальной скорости.
- Сбор переваренных фрагментов, пропуская их через сито 70 ячейки мкм, расположенной на новой 50 мл пробирку.
- Отмывки образца путем добавления 20 мл ДЗФР и центрифугировать при 400 г в течение 5 мин. Тогда ресуспендируют тон клеток в 1 мл ДЗФР.
- Граф клеток с использованием счетной камере Neubauer. Смешайте 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего. Инкубируют в течение 1-2 мин.
- Заполните гемоцитометра камеру с 10 мкл окрашенных клеток. Граф клеток под микроскопом в четырех 1 х 1 мм 2 квадраты одной камеры и определить среднее число клеток на площади. Жизнеспособные клетки появляются белые, мертвые клетки кажутся синими. Для того, чтобы определить количество клеток / мл умножить число клеток на коэффициент разбавления. Если 2-4 квадранта подсчитываются, делят на число квадрантов.
9. внеклеточной Окрашивание для анализа ТСМ
- Центрифуга клетки 5 ClP мин при 390 х г. Ресуспендируют клеток в 1 мл FACS А (ФБР с добавкой 1% БСА и 0,1% азида натрия)
Примечание: азид натрия очень токсичен. Это может привести к гипотонии, гипотермия, головная боль судороги или смерти. Разбавленные растворы азида натрия (00,1 до 1,0%), как правило, не представляют чрезвычайные опасности для пользователя, но они глаз и кожи раздражающие вещества. Поэтому использовать азид натрия только в химической капотом во время ношения лабораторный халат и двукратную пару одноразовых нитриловые перчатки. - Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре с моноклональными антителами (МКА) 2.4G2 , направленной против FcγRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 мкг моноклональными / 10 6 клеток) , разведенного в FACS А.
- Добавить 200 мкл FACS-A к клеткам и центрифугировать 5 мин при 390 х г. Повторите этот шаг дважды. Инкубируйте клетки с 0,5 нг / 10 6 клеток соответствующего мАт в течение 20 мин при 4 ° C. Развести антитела в FACS А.
- Добавить 200 мкл FACS-A к клеткам и центрифугировать 5 мин при 390 х г. Повторите этот шаг дважды. Ресуспендируют образцы в 100 мкл FACS А.
- Анализ Т - клеток из CX 3 CR1 GFP / + х КГР - / - мышей воссозданные с OT-II / Красный CD4 Т - клеток на проточном цитометре 37.
Анализ 10. конфокальной микроскопии
- Анализ толстой кишки CX 3 CR1 GFP / + мышей разведенных или не с OT-II / Красный CD4 + CD62L + Т - клеток и кормили перорально каждый второй день с 1 х 10 8 КОЕ Е. штамм E.coli DH10B PCFP-OVA.
- Удалить толстую кишку у мышей с помощью ножниц и пинцетов. Открыть его в продольном направлении с помощью рассечения ножницами.
- Вырезать 5-8 мм часть образца толстой кишки с помощью ножниц, положить на стеклах и накрыть покровные.
- Анализ образцов толстой кишки с помощью конфокального микроскопа при увеличении в 40 / 1.30.
- Обнаружить CX 3 CR1 + парламентариям, меченый зеленым флуоресцеина белка (GFP), используя набор фильтров с возбуждением при длине волны 488 нм и эмиссии при 509 нм.
- Обнаружить CD4 + Т - клетки , экспрессирующие красный белок , используя набор фильтров с возбуждением при 554 нм и эмиссии на 586 нм.
- Обнаружение E.coli PCFP-OVA , используя набор фильтров с возбуждением при длине волны 450 нм и излучение на длине волны 480 нм.
- Определить область интереса и генерировать диаграммы рассеяния , как описано выше 50 , чтобы провести анализ совместной локализации. Используйте 2 различные формулы: Перекрытие коэффициент согласно Manders и коэффициент Пирсона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы установить антиген управляемой колиты моделирующие E. штамм был построен , который содержит плазмиду , в которой ген для CFP слита с последовательностью , кодирующей белок куриного овальбумина и слитой конструкции экспрессируется под контролем сильного конститутивного промотора P гипер (фиг.1А). Флуоресцентная микроскопия показывает , что рекомбинантный E. PCFP палочка-OVA, но не родительская Е. палочка DH10B, выражает CFP (рис 1B). CFP-OVA- производства E. палочка может активировать клетки ОТ-II в пробирке и индуцировать продукцию IFN-gamma в отличие от Е. штамм E.coli экспрессии CFP только (рисунок 2). Рисунок 3A показывает 3D ех естественных условиях конфокальной визуализации толстой ткани CX 3 CR1 / GFP + мышей , которых кормили с E. PCFP палочка-OVA. E. PCFP палочка-OVA можетбыть обнаружены в крипт , расположенных вблизи эпителиальные клетки кишечника и со-локализуется с CX 3 CR1 + фагоцитов. Для определения относительной доли E. PCFP палочка-OVA усвоены определенной CX 3 CR1 + фагоциты, синий и зеленый интенсивность цветения определяли с помощью рассеяния клякс. Анализ показал , что CX 3 CR1 + клетки пробы 11,9 ± 1,5% от E. палочки PCFP-OVA обнаружены в толстой кишке (рис 3B). В OT-II / Красные животных, CD4 + Т - клетки характеризуются Красным выражением и Vβ 5.1 выражение показано с помощью проточной цитометрии (рисунок 4). На рисунке 5А показан общий обзор антиген приводится модель колита. / Красный + CD4 + T CD62L + клетки OT-II были адаптивно переносили в CX 3 CR1 GFP / + х КГР - / - получатели , которые были затем через желудочный зонд каждый второй день с E.PCFP палочка-OVA. Когда вызов с E. палочки PCFP-OVA, переносили CX 3 CR1 GFP / + х КГР - / - мыши теряют вес тела и развивать клинические признаки колита (рис 5б) На рисунке 6 показан ех естественных 3D конфокальной микроскопии толстой ткани 7, 14 и 21 дней после. восстановление гетерозиготной CX 3 CR1 GFP / + х КГР - / - получатели с OT-II / красный + клетки заражали Е. PCFP палочка-OVA. Через семь дней после переноса клеток только несколько CX 3 CR1 + фагоциты взяли пробы E. PCFP палочка-OVA и OT-II / красный + клетки не были обнаружены. Через четырнадцать дней после переноса клеток, CX 3 CR1 + фагоциты , что выборочные E. PCFP палочка-OVA были расположены близко к OT-II / красный + клеток. Через двадцать один день после того, как клетки передать большое количество CX 3 CR1 + клеток, которые выборочные E. PCFP палочка-OVA и OT-II / REd + клетки, диспергированные в номерном знаке автомобиля в непосредственной близости от СХ 3 CR1 + фагоцитами.
Рисунок 1: CFP-OVA Производство Е. палочки. (A) Карта PCFP-OVA с соответствующими сайтами рестрикции, ген , кодирующий OVA и ярко - синий флуоресцентный белок CFP. (B) Светлое поле и флуоресцентные микроскопические изображения дикого типа E. палочки DH10B, E. палочки DH10B PCFP и E. палочки DH10B PCFP-OVA. Шкала бар:. 10 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: ОТ-II Клетки , стимулированные с CFP-OVA Продукция IFN-gamma. После выделения из селезенки, клетки OT-II были стимулированы с указанными числами Е. палочки DH10B PCFP-OVA. Бактериальные клетки инактивируют следующих 2 ч инкубации с 5 мкг / мл гентамицина. После 72 ч культивирования супернатанты собирали и концентрации IFN-gamma определяли методом ИФА. Эксперименты проводились в трех экземплярах и данных , представленных в виде среднего значения ± SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: CX 3 CR1 + Фагоциты Образец E. PCFP палочка-OVA. (A) ClP ткань CX 3 CR1GFP / + мышей через желудочный зонд с 1 х 10 8 Е. палочка PCFP-ОВА в течение 7 дней и анализировали с помощью экс виво конфокальной микроскопии. Увеличение 40X / 1.30. Шкала бар = 30 мкм. (Б) Процент интернализированной E. PCFP палочка-OVA количественному и данные представлены как среднее ± SEM. В тесте р Манн-Уитни <0,05 считалось статистически значимым. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Характеристика OT-II / красный + CD4 + Т - клеток (А) ОТ-II трансгенные животные были скрещены с животными , выражающих красный флуоресцентный белок , чтобы получить OT-II / красный +клетки. OT-II / красный + клетки выделяли из селезенок OT-II / Red трансгенные животные, окрашивали на CD4 и Vß5.1 и анализировали с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: ОВА приводом Передача Колит (А) Схематическое представление антигена приводом модели колита.. / Красный + CD4 + T CD62L + клетки OT-II были адаптивно переносили в CX 3 CR1 GFP / + х КГР - / - мышей и хозяева были через желудочный зонд каждый второй день с E. PCFP палочка-OVA. Вес (В) Тело указанных групп измеряли два раза в неделю. Среднее ± SEM потеря веса тела (%) представлена. В тесте Манна-Уитнир <0,05 считалось статистически значимым. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 6: CX 3 CR1 + Парламентарии Связь с клетками OT-II Во время OVA управляемой передачи колита (A) Образцы Толстокишечные ткани исследовали экс естественных 3D конфокальной микроскопии на 7 -й день, 14 и 21 после передачи OT-II / Red + CD4 + T CD62L + клетки в CX 3 CR1 GFP / + х КГР - / - получателей. Увеличение 40X / 1.30. Шкала бар = 30 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как и с любой другой моделью, антиген управляемой модели колита описано выше, может представлять несколько вопросов, которые следователь, выполняющий технику должны быть в курсе. При инъекции OT-II / красный + CD4 + T CD62L + клетки в хостах, исследователь должен быть очень нежным и осторожным , чтобы вставить иглу в брюшную полость. Несоблюдение этого правила может привести к разрыву кишечника мыши, которая может привести к смерти или подкожного введения клеток, которые не вызывают каких-либо заболеваний.
Как правило, мыши будут набирать вес в течение первой недели после переноса клеток. Исследователь должен взвешивать мышей одновременно в каждый момент времени веса и использовать один и тот же баланс весом на протяжении всей процедуры. Иногда подопытных мышей, особенно когда их вес в начале эксперимента ниже 18 г, не развивается никаких признаков синдрома истощения. Тем не менее, эти животные mighт до сих пор значительное развитие воспаления кишечника при макроскопической оценке.
При работе с генетически модифицированных бактерий, контаминации может произойти. Чтобы избежать этих проблем , настоятельно рекомендуется проверить E.coli , выражающую CFP-OVA с помощью флуоресцентного микроскопа , чтобы проанализировать , если бактерии являются флуоресцентные и палочковидные (типичная форма кишечной палочки).
Предлагаемый антиген-управляемый колиты опирается на наблюдении , что CX 3 CR1 + депутаты образца синантропных бактерий в просветные стационарном состоянии и при воспалительных условиях 36,37. Индукция ответов Т - клеток в антиген-модель на основе колита была продемонстрирована весьма активированном фенотипа ОТ-II CD4 + Т - клеток из двоеточием СХ 3 CR1 GFP / + х КГР - / - мышей , зараженных с антигеном, по сравнению с Т - клетками , выделенными из CX 3 CR1 GFP / + х КГР
Конфокальной визуализации позволяет предположить , что CX 3 CR1 + фагоциты расположены близко к эпителию кишечника , так что они могут попробовать E. PCFP палочка-OVA и взаимодействовать с OT-II / красный + CD4 + Т - клеток. После того, как CX 3 CR1 + фагоциты взяли пробы E. PCFP палочка-OVA полостную антиген доставляется к CD103 + дендритные клетки (DC) с помощью CX 3 CR1 + фагоцитов. CD103 + контроллеры домена способны мигрировать к мезентериального лимфатического узла (МЛН) до простых CD4 Т - клеток 37,52. Загрунтованные Т - клетки собираются в CX , где CLP 3 CR1 + фагоциты показать антиген OVA на еffector Т-клетки, чтобы вызвать воспаление. Поставка и презентация антигена CX 3 CR1 + фагоциты может стать ключевым событием в развитии колита.
Способность индуцировать колита с определенной бактерии , выражающего специфический антиген дает возможность изучить необходимые условия для развития колита 24. Эта модель показывает , что конкретный ответ на антигенный пептид (OVA выражается E.coli) достаточна , чтобы вызвать воспаление кишечника в КГР - / - хостов, предполагая , что Т - клетки могут реагировать на специфический антиген из кишечной микрофлоры. Один антиген может вызвать воспаление кишечника в моделях на животных, но оно не может предположить, что единичные антигены являются причиной человеческого IBD. Кроме того, в модели колита передачи существуют наивные CD4 + Т - клетки , которые обладают неизвестной специфичностью и , следовательно , могут быть реактивными к множественным, как еще неидентифицированных антигенов, измикробиота. Основные анализ и исследования необходимы, чтобы лучше уточнить роль специфического антигена в патогенезе воспаления слизистой оболочки.
В последние годы использование различных животной модели колита привело к расширению знаний о патогенезе IBD 53. Тем не менее, из - за сложности и патогенез заболевания, существует не окончательное излечение 54. С помощью описанной модели, можно обратить внимание на несколько аспектов IBD, которые недостаточно хорошо еще прояснены, такие, как (I) взаимодействие между моноцитами и дендритных клеток, (II) миграция кишечной ГЦ в MLN, (III), представление антигена, (IV) самонаведения эффекторных Т - клеток из MLN в собственной пластинке слизистой оболочки и (v) активации эффекторных Т - клеток в собственной пластинке слизистой оболочки с помощью CX 3 CR1 + фагоцитов. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования , чтобы подтвердить , если CX 3 CR1 + фагоцитов / взаимодействие CD4 + Т - клеток играет ключевую роль вВБК патогенез. Мыши не могут быть по- настоящему представителем людей , и это необходимо иметь в виду , когда мышиные модели используются для изучения человеческого IBD 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan | ||
| DNase I recombinant | 4536282001 |
References
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
- Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
- Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
- Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
- Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
- Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
- Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111 (2011).
- Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
- Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
- Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
- Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
- Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
- Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
- Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
- Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
- Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
- Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
- Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
- Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
- Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
- Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
- Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
- van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
- Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
- Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
- Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
- Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
- Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
- Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
- Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
- Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
- Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
- Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
- Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
- Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
- Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
- Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
- Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
- Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
- Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
- Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
- Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404 (2012).
- Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).
