Introduction
El intestino es la mayor superficie del cuerpo que está expuesta al ambiente externo. matrices extensas de microbios residentes colonizan el intestino humano para formar la microbiota intestinal (o microflora). Se estima que esto constar de hasta 100 billones de células microbianas y constituye uno de los hábitats bacterianas más densamente poblados conocidos en la biología 1-3. En el GIT bacterias colonizan un nicho intestinal donde sobreviven y se multiplican 4. A cambio, la microbiota dota a la máquina con características funcionales adicionales no codificadas en su genoma 1. Por ejemplo, la microbiota estimula la proliferación de las células epiteliales, produce vitaminas que alberga no puede producir por sí mismos, regula el metabolismo y protege contra patógenos 4-6. Dada esta relación beneficiosa, algunos autores han sugerido que los humanos son "súper-organismos" o "holobionts" que son una mezcla de genes bacterianos y humanos 7,8. Dado el impacto beneficioso de la microbiota en el host (humana), el sistema inmune intestinal necesita para tolerar los microbios comensales para permitir su existencia en la luz, sino también matar a los patógenos que invaden desde el lado luminal 9-11. El sistema inmune intestinal ha desarrollado mecanismos para distinguir entre los microbios inofensivos luminales y potencialmente dañinos; sin embargo, estos mecanismos no están todavía bien entendidas 12. El mantenimiento de la integridad intestinal requiere una homeostasis inmune estrechamente regulado para mantener el equilibrio entre la tolerancia y la inmunidad 13. Un desequilibrio en la homeostasis inmune contribuye a la inducción de enfermedades intestinales tales como la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) 3,14.
Hay dos tipos principales de IBD: la enfermedad de Crohn (CD) y la colitis ulcerosa (UC). Los pacientes con estas enfermedades por lo general sufren de sangrado rectal, diarrea y dolor abdominal 15,16. La causa de la EII es todavíadesconocido, pero una combinación de factores genéticos, factores ambientales y las respuestas inmunes dysregulated podría ser el evento clave para el desarrollo de la enfermedad 15.
Los modelos animales de EII se han utilizado durante más de 50 años. En las últimas décadas nuevos sistemas modelo de EII se han desarrollado para probar las diversas hipótesis relativa a la patogénesis de la EII 17,18. El modelo mejor caracterizado de colitis crónica es el modelo de transferencia de células T que induce la interrupción de la homeostasis de células T 19,20. Este modelo implica la transferencia de células T vírgenes de ratones inmunocompetentes en huéspedes que carecen de T y células B (como RAG - / - y ratones SCID) 16,21. El desarrollo de la enfermedad en este modelo se supervisa durante 3-10 semanas mediante la evaluación de la presencia de diarrea, la reducción de la actividad física, y la pérdida de peso corporal. Esto se llama así el síndrome de desgaste 16. En comparación con los ratones sano el tejido del colon de los ejércitos trasplantados es Thicker, más corto y más pesado 16. Usando el modelo de transferencia de células T, es posible comprender cómo los diferentes poblaciones de células T pueden contribuir a la patogénesis de la EII 22. El modelo de transferencia de células T no analiza las interacciones entre APCs y células T en el proceso de la enfermedad de una manera específica de antígeno. Se ha demostrado que la interacción entre las células mieloides y células linfoides podría ser responsable del desarrollo de la inflamación intestinal 23. Aunque no se han aclarado muchos aspectos de la EII, los eventos iniciales que conducen al desarrollo de la enfermedad todavía tienen que ser claramente entendido.
Se ha demostrado que, en ausencia de colitis transferencia microbiota no se puede establecer 24. Recientemente, varias teorías sugieren que la EII podría ser el resultado de una respuesta inmunitaria contra bacterias comensales 25. también han propuesto Autores que las bacterias comensales son esenciales para inducir la inflamación en el intestino distal26. En libre de gérmenes (GF), los animales del sistema inmunitario intestinal es generalmente deteriorada 27,28, pero una colonización de estos ratones con una mezcla de específico libres de patógenos bacterias resultados en el desarrollo del sistema inmunitario intestinal totalmente competente 29. Por lo tanto, la microbiota parece ser un elemento clave en la patogénesis de la EII, ya sea como un mecanismo que predispone a o protege contra el desarrollo de la inflamación intestinal 30,31. Las teorías actuales sugieren que la EII es el resultado de un desequilibrio microbiano, llamada disbiosis, en pacientes predispuestos genéticamente 32, pero no es claro aún si el disbiosis es la causa o la consecuencia de la enfermedad 12. Teniendo en cuenta el papel de los microorganismos en el desarrollo de la EII, en experimentos in vitro mostraron que las células T CD4 + se pueden activar por APCs pulsadas con bacterias intestinales 33,34.
Por otra parte, se ha demostrado que los antígenos dediferentes especies de bacterias comensales, tales como E. coli, Bacteroides, Eubacterium y Proteus, son capaces de activar células T CD4 + 35. Esto indica que la presentación de antígenos bacterianos a las células T es de importancia para el desarrollo de la EII. Para reducir la complejidad de múltiples antígenos derivados por la microflora en el proceso de la enfermedad, una cepa de E. coli ha sido creado que produce el antígeno OVA. La colitis transferencia fue inducida por la inyección de células T específicos de OVA en RAG - / - animales colonizados con OVA-expresión de E. coli.
Este modelo se basa en la evidencia reciente sugiere que la CX 3 CR1 + parlamentarios, un subconjunto de células importante en la lámina propia del colon (CLP) 36, están interactuando con las células T CD4 + durante la transferencia de la colitis 37. Los diputados de la muestra La luz intestinal para el antígeno de partículas, tales como bacterias, utilizando sus dendritas 36, 38,39. Estudios previosdemostró que los parlamentarios también puede tomar hasta antígenos solubles, tales como OVA, introducidos en el lumen intestinal 40,41. Dada la abundancia de CX 3 CR1 + parlamentarios en el CLP, es posible que estas células pueden degustar las bacterias luminales e interactuar con las células T CD4. Confocal de imágenes de los ratones trasplantados con células T CD4 + específicos de OVA colonizados con E. coli CFP-OVA, muestran que CX 3 CR1 + MPs están en contacto con las células OT-II T CD4 + durante el desarrollo de colitis antígeno impulsado. Este modelo permite el estudio del proceso de la presentación del antígeno entre APCs intestinales y células T específicas únicamente para determinados bacterias que expresan el antígeno en la luz intestinal.
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Protocol
Los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en las instalaciones de animales de la Universidad de Ulm (Ulm, Alemania). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la utilización de animales local y el comité de cuidado y la Ley Nacional de Protección de los Animales.
1. Construcción del plásmido pCFP-OVA
- Amplificar el gen de tamaño OVA completa usando los cebadores Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') y Ova_ClaI_rev (3' GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5 ') 37 utilizando el plásmido pCI-OVA 42 como una plantilla (resistente a la ampicilina). Clonar el producto de PCR (es decir, la secuencia que codifica OVA) en un fago mediados de vector disponible en el mercado usando SpeI y ClaI restricciones sitios de los cebadores y vector para producir el plásmido OVA-específico.
- Amplificar el gen codificante PPC junto con el promotor constitutivo fuerte P hiper utilizando el plásmido Dap 1 43 como una plantilla y cebadores CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') y CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
- Clonar el gen de CFP-codificación en el OVA-plásmido específico (resistente a la ampicilina) usando los sitios de restricción SpeI y SacI de los cebadores y vector 37. Esto introduce un espaciador de 6 residuos de glicina entre el CFP-codificación de la secuencia de OVA-codificación.
2. Construcción de E. coli pCFP-OVA
- Crecer E. coli cepa DH10B en 100 ml de Luria Bertani (LB) aeróbicamente a 37 ° C en un agitador rotatorio durante la noche.
- Mezclar 800 l de cultivo bacteriano con 200 l de glicerol para crear stock de glicerol y se almacena a -80 ° C.
- Añadir 50 l de E. coli cepa DH10B de stock de glicerol en 5 ml de medio LB y crecer aeróbicamente a 37 ° C en un agitador rotatorio ovedejarían de.
- La transferencia de la cultura en un matraz de 1 L con deflectores Erlenmeyer con 250 ml de medio LB a 37 ° C en un movimiento rotatorio.
- Cultivar las bacterias hasta una densidad óptica a 600 nm (OD 600) de 0,5 y, a continuación enfriar el cultivo en hielo durante 30 min. Centrifugar las bacterias a 5.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Bacterias Resuspender con 100 ml de H2O estéril frío de hielo y centrifugar las bacterias a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. bacterias Resuspender con 100 ml de helado de 10% de glicerol y centrifugar las bacterias a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este último paso dos veces.
- Después de la etapa de lavado final, resuspender las bacterias en 700 l de 10% de glicerol. Congelar 50 ml de alícuotas en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.
- Descongelar una alícuota de 50 l en el hielo y la transferencia en una cubeta de electroporación previamente enfriada (2 mm de distancia entre electrodos).
- Añadir 5 l de ADN de plásmido (100 ng) a la 50 l E. aliquo colits. Realizar electroporación con un solo pulso a 25 mF, 200 ohmios (Ω) y 2,5 kV.
- bacterias resuspender en 1 ml pre-calentado medio SOC (/ L de extracto de 5 g de levadura, 2 g / L de triptona, cloruro de sodio 10 mM, cloruro de potasio 2,5 mM, cloruro de magnesio 10 mM, sulfato de magnesio 10 mM) y se incuba a 37 ° C aeróbicamente durante 1 hr.
- las bacterias de la placa sobre placas de agar LB suplementadas con ampicilina 100 mg / ml (añadir 100 l de una 100 mg / ml de ampicilina social a 100 ml de LB-agar) y se incuba durante la noche aeróbicamente a 37 ° C.
- Recoger colonias individuales y las vuelve a la racha en placas de agar LB suplementadas con ampicilina 100 mg / ml. Incubar toda la noche aeróbicamente a 37 ° C.
- Recoger colonias individuales y crecer durante la noche en 10 ml de medio LB suplementado con ampicilina 100 mg / ml para el aislamiento del plásmido. Utilice mini kit de preparación de plásmido disponible en el mercado y eluir ADN plásmido con 30 dH l 2 O (agua destilada) de acuerdo con el fabricante; S protocolo. Verificar plásmidos mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN 37,42,43.
- Establecer una cultura de clones positivos de E. coli pCFP-OVA en 100 ml de medio LB suplementado con ampicilina 100 mg / ml. Crecer aeróbicamente a 37 ° C durante la noche en un agitador rotatorio.
- Mezclar 800 l de cultivo bacteriano con 200 l de glicerol puro y se almacena a -80 ° C.
- Centrifugar el resto del cultivo durante la noche a 5000 xg durante 10 min a temperatura ambiente (RT) y resuspender el pellet en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Colocar 10 l de la suspensión sobre portaobjetos de vidrio y se cubre con un cubreobjetos.
- Observar las muestras en un microscopio de fluorescencia estándar para confirmar la expresión de la fluorescencia CFP-OVA (excitación PPC a 450 nm, emisión a 480 nm). Analizar las bacterias comienzan con una ampliación de 400X.
- Centrifugar 1 ml de bacterias a partir de cultivos de una noche en 5000 xg durante 10 min, RT. Resuspender el precipitado en 40 l dePBS y hierven a 95 ° C durante 10 min.
- Centrifugar las muestras a 30.000 xg durante 10 min y el uso de los sobrenadantes para análisis de transferencia de Western 37. Utilice el anticuerpo policlonal anti-OVA de conejo levantado diluido 1: 400.
3. Generación de OT-II / Ratones Red
- Cruzar una hembra de ratón macho / OT-II con un ratón hembra / macho que expresa la proteína fluorescente roja (ambas cepas comercialmente disponible) con el fin de generar los ratones OT-II / Red 37.
El aislamiento de la célula 4. Spleen
- La eutanasia a la OT-II / ratones Red por dislocación cervical después de la anestesia por inhalación de cualquier éter halogenado (hasta 5% para la inducción) disponible comercialmente.
- Use las tijeras para cortar la parte abdominal superior, izquierda del ratón. En virtud de esta parte abdominal existe el bazo (forma oval con un color rojo oscuro). Use las tijeras y pinzas para quitarla.
- Extraer el bazo de los ratones rojos / OT-II y pasarla a través de un 100filtro de células micras coloca en un tubo de 50 ml usando el émbolo de una jeringa de 1 ml con el fin de obtener una suspensión de una sola célula. Se lava el filtro dos veces con 10 ml de PBS suplementado con suero 1% inactivado por calor fetal bovino (FBS).
- Centrifugar la suspensión celular a 390 xg durante 5 min a TA. Resuspender el precipitado con 5 ml de tampón de pre-calentado de lisis (144 mM NH 4 Cl, Tris 17 mM, pH = 7,2) para lisar las células rojas de la sangre. Incubar 10 minutos a 37 ° C.
- Lavar la muestra con 25 ml de PBS suplementado con 1% de FBS. Centrifugar a 390 xg durante 5 min a TA. Resuspender el precipitado en 10 ml de PBS suplementado con 1% de FBS.
- Contar las células utilizando una cámara de recuento Neubauer. Mezclar 10 l de la suspensión de células con 10 l de una solución de azul de tripano al 0,4%. Incubar durante 1-2 minutos.
- Llenar la cámara de hemocitómetro con 10 l de células teñidas. Contar las células bajo el microscopio en cuatro 1 x 1 mm 2 plazas de una de las cámaras y determine el número medio de células por cuadrado. Las células viables aparecen, las células muertas blancas aparecen de color azul. Para determinar el número de células / ml multiplicar el número de células por el factor de dilución. Si 2-4 cuadrantes están siendo contados, dividir por el número de cuadrantes.
Enriquecimiento de la célula 5. CD4 + CD62 + T L
- Enriquecer células del bazo para las células T CD4 + CD62L + a través de kit de aislamiento magnético utilizando los principios de la selección negativa o positiva. A continuación, utilice la selección negativa para aislar las células T CD4 + y utilizar la selección positiva para enriquecer aún más para el CD62L + población dentro de la reserva de células T CD4 +.
NOTA: En el procedimiento de selección negativa, las células, las cuales serán no aislados (aquí: Todas las células CD4 negativos) están marcadas con anticuerpos específicos, junto con microperlas magnéticas. Durante el lavado de la columna de los pasos de las células T CD4 + se pasan a través de la columna de modo que puedan ser EASILy recogido. En las células del procedimiento de selección positiva que ser aislado son etiquetados con el anticuerpo apropiado junto con microperlas magnéticas. Durante el lavado de la columna pasos las células marcadas se mantendrán en la columna y se pueden recoger mediante la eliminación de la columna del campo magnético y de enjuagar con el tampón. - Para el procedimiento de selección negativa, resuspender 10 7 células totales del bazo en 40 l de PBS frío suplementado con albúmina de suero bovino 0,5% (BSA). Añadir 10 l de biotina marcado con cóctel de anticuerpos suministrado con el kit de aislamiento magnético (anticuerpos específicos de unión a las células T no CD4 +) y se incuba 15 min en hielo.
- Añadir 30 l de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA y 20 l de microperlas anti-biotina. Incubar 20 minutos en hielo.
- Añadir a la muestra 10 ml de PBS suplementado con 0,5% de BSA y centrifugar a 390 xg durante 5 min. Repita este paso dos veces. Resuspender las células en 1 ml de PBS frío suplementado con 0,5% BSA.
- Colocar la columna específica para el procedimiento de selección negativa en el campo magnético y enjuague con 3 ml de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA en la columna. Añadir la suspensión celular en la columna y lavar 3 veces con 3 ml de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA.
- Centrifugar las células del efluente a 390 xg durante 5 min. Paso del efluente a través de la columna contiene células T CD4 + no marcados. Resuspender el precipitado en 1 ml de PBS suplementado con 0,5% de BSA y contar las células.
- Contar las células utilizando una cámara de recuento Neubauer. Mezclar 10 l de la suspensión de células con 10 l de una solución de azul de tripano al 0,4%. Incubar durante 1-2 minutos.
- Llenar la cámara de hemocitómetro con 10 l de células teñidas. Contar las células bajo el microscopio en cuatro 1 x 1 mm 2 plazas de una de las cámaras y determinar el número medio de células por cuadrado. Las células viables aparecen, las células muertas blancas aparecen de color azul. Para determinar el número de células / ml se multiplican cell número por el factor de dilución. Si 2-4 cuadrantes están siendo contados, dividir por el número de cuadrantes.
- Para el procedimiento de selección positiva, añadir 10 l de microperlas de CD62L por 10 7 fracción de células T CD4 + pre-enriquecido. Incubar 15 minutos en hielo.
- Añadir a la muestra 10 ml de PBS suplementado con 0,5% de BSA y centrifugar a 390 xg durante 5 min. Repita este paso dos veces. Resuspender en 500 l de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA.
- Colocar la columna específica para el procedimiento de selección negativa en el campo magnético y enjuague con 500 l de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA en la columna. Añadir la suspensión celular en la columna y lavar 3 veces con 500 l de PBS frío suplementado con 0,5% de BSA.
- Retirar la columna del campo magnético y colocarlo en un tubo de recogida adecuado. Añadir 1 ml de PBS suplementado con 0,5% de BSA en la columna y eliminar las células CD4 + T + CD62Ls retenida en la columna presionando firmemente el émbolo en la columna.
NOTA: Los aislados + células T CD4 + CD62L son ahora listo para aplicaciones posteriores, como los experimentos in vivo. De acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de aislamiento de células CD4 + T + CD62L, las microperlas no son tóxicos. Debido al pequeño tamaño (alrededor de 50 nm), que no se activan las células y no van a saturar epítopos de la superficie celular. Por lo tanto las células aisladas pueden ser transferidos a ratones inmunodeficientes para inducir colitis 37,44,45. - Contar las células utilizando una cámara de recuento Neubauer. Mezclar 10 l de la suspensión de células con 10 l de una solución de azul de tripano al 0,4%. Incubar durante 1-2 minutos.
- Llenar la cámara de hemocitómetro con 10 l de células teñidas. Contar las células bajo el microscopio en cuatro 1 x 1 mm 2 plazas de una de las cámaras y determinar el número medio de células por cuadrado. Las células viables appeaR, las células muertas blancas aparecen de color azul. Para determinar el número de células / ml multiplicar el número de células por el factor de dilución. Si 2 - 4 cuadrantes están siendo contados, dividir por el número de cuadrantes.
6. La inducción de la colitis impulsado por el antígeno
- Se inyecta por vía intraperitoneal 3 x 10 5 células T OT-II / rojo CD4 + CD62L en CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratones. Para la inducción de la colitis específica de antígeno, administrar E. coli pCFP-OVA cada segundo día a una dosis de unidad de formación de colonias de 1 x 10 8 (CFU) en 100 l de PBS por animal por sonda o instilación oral, detrás de los incisivos.
- Supervisar dos veces por semana el peso corporal de los ratones trasplantados y su condición clínica (presencia de sangre en las heces, consistencia de las heces y la actividad de los ratones).
7. Las muestras de tejido para el examen histopatológico
- Tomar muestras de tejido de The intestino grueso de los ratones, fijar en formalina tamponada neutra (10%) y de inserción en parafina como se ha descrito previamente 36,46.
- Sección las muestras de parafina en un microtomo, se montan en portaobjetos, y llevar a cabo la tinción con 47,48.
- Categorizar la histología del intestino grueso según lo publicado anteriormente 47,48: normal (puntuación 0); La colitis leve (puntuación 1), la colitis moderada (puntuación 2) y la colitis severa (puntuación 3).
8. Aislamiento de células de la lámina propia del colon
- La eutanasia a los ratones trasplantados por dislocación cervical después de la anestesia por inhalación de cualquier éter halogenado (hasta 5% para la inducción) disponible comercialmente.
- Colocar el animal hacia abajo con el vientre hacia arriba. El uso de fórceps para agarrar la piel en sentido anterior a la abertura de la uretra. Use las tijeras para cortar la piel a lo largo de la línea media ventral desde la ingle hasta el pecho. Tire de la piel hacia atrás en los lados.
- Corte a través de la pared muscular peritoneal transparente yla apertura de la cavidad corporal. Identificar los dos puntos que va desde el ano hasta el ciego 49. Cortar las 2 extremidades y liberar el tejido de grasa.
- Abrir longitudinalmente el colon usando unas tijeras de disección. Utilice unas pinzas para agitar el tejido del colon en una placa de Petri que contiene 25 ml de PBS suplementado con FBS al 1% para eliminar los residuos y las mucosas. Cortar los dos puntos en 5 - 8 mm piezas.
- Coloque los segmentos de colon en un tubo de 50 ml que contiene 20 ml del tampón de lavado. El tampón de lavado contiene 500 ml de DPBS, 10 mM de Hepes y ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA).
- Vortex el tubo durante 30 segundos a velocidad máxima.
- Incubar el tubo con los segmentos de colon en un baño de agua a 37 ° C con 200 rpm agitación durante 10 min.
- Después de la incubación, agite el tubo durante 30 segundos a velocidad máxima.
- Desechar los sobrenadantes y colocar las muestras de tejido en un nuevo tubo de 50 ml que contiene 20 ml del tampón de lavado. Repita los pasos 6-9 tres veces
- Desechar los supernatants y colocar las muestras de tejido en una placa de Petri que contiene 25 ml de PBS. Utilice unas pinzas para sacudir suavemente las muestras de tejido en la placa de Petri durante unos segundos para eliminar las células epiteliales residuales. Repita este paso tres veces.
- Cortar los tejidos del colon en 2 x 2 mm 2 piezas y digerir por incubación en 10 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio con 0,5 mg / ml de colagenasa tipo VIII de Clostridium histolyticum y 10 U / ml de ADNasa I.
- Vortex el tubo durante 30 segundos a velocidad máxima.
- Incubar los fragmentos de colon en un baño de agua a 37 ° C con agitación 200 rpm durante 35 minutos y agitar el tubo durante 30 segundos a velocidad máxima cada 5 minutos.
- Al final de la incubación vórtice el tubo durante 30 segundos a velocidad máxima.
- Recoger los fragmentos digeridos pasándolos a través de un filtro de células de 70 micras colocada en un nuevo tubo de 50 ml.
- Lavar la muestra mediante la adición de 20 ml de DPBS y centrifugar a 400 g durante 5 min. A continuación, volver a suspender tél células en 1 ml de DPBS.
- Contar las células utilizando una cámara de recuento Neubauer. Mezclar 10 l de la suspensión de células con 10 l de una solución de azul de tripano al 0,4%. Incubar durante 1-2 minutos.
- Llenar la cámara de hemocitómetro con 10 l de células teñidas. Contar las células bajo el microscopio en cuatro 1 x 1 mm 2 plazas de una de las cámaras y determinar el número medio de células por cuadrado. Las células viables aparecen, las células muertas blancas aparecen de color azul. Para determinar el número de células / ml multiplicar el número de células por el factor de dilución. Si 2-4 cuadrantes están siendo contados, dividir por el número de cuadrantes.
9. La tinción extracelular de Análisis FCM
- Se centrifuga la CLP células 5 min a 390 x g. Resuspender las células en 1 ml de FACS A (PBS suplementado con 1% de BSA y azida sódica al 0,1%)
NOTA: La azida de sodio es altamente tóxico. Puede causar hipotensión, hipotermia, convulsiones dolor de cabeza o la muerte. Las soluciones diluidas de azida de sodio (00,1 a 1,0%) por lo general no presentan peligros extraordinarias para el usuario, pero son los ojos y de la piel irritantes. Por lo tanto, utilice azida de sodio sólo en el capó química mientras lleva puesto un abrigo de laboratorio y un doble par de guantes de nitrilo desechables. - Se incuban las células durante 15 min a RT con el anticuerpo monoclonal (mAb) 2.4G2 dirigido contra el Fc? RIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 mg de mAb / 10 6 células) diluido en FACS A.
- Añadir 200 l de FACS A a las células y centrifugar 5 min a 390 x g. Repita este paso dos veces. Se incuban las células con 0,5 ng / 10 6 células del mAb relevante durante 20 min a 4 ° C. Diluir los anticuerpos en FACS A.
- Añadir 200 l de FACS A a las células y centrifugar 5 min a 390 x g. Repita este paso dos veces. Resuspender las muestras en 100 l de FACS A.
- Analizar las células T de CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratones reconstituidos con células T CD4 rojo en el citómetro de flujo 37 OT-II /.
Análisis 10. Microscopía Confocal
- Analizar el colon de CX 3 CR1 GFP / + ratones reconstituidos o no con OT-II / Red Cell CD4 + T + CD62L y alimentados por vía oral cada dos días con 1 x 10 8 UFC de E. coli cepa DH10B pCFP-OVA.
- Extirpar el colon de los ratones usando tijeras y pinzas. Abrir longitudinalmente utilizando unas tijeras de disección.
- Corte un pedazo de 5-8 mm de la muestra de colon con unas tijeras, poner en portaobjetos de vidrio y cubrir con cubreobjetos.
- Analizar las muestras de colon con un microscopio confocal con una ampliación de 40 / 1,30.
- Detectar la CX 3 CR1 + MPs, marcado con proteína fluoresceína verde (GFP), utilizando un conjunto de filtros con excitación a 488 nm y emisión a 509 nm.
- Detectar la célula T CD4 + que expresan la proteína rojo utilizando un conjunto de filtros con excitación a 554 nm y emisión a 586 nm.
- Detectar E.coli pCFP-OVA utilizando un conjunto de filtros con excitación a 450 nm y emisión a 480 nm.
- Definir un área de interés y generar diagramas de dispersión como se ha descrito previamente 50 para llevar a cabo el análisis de co-localización. Utilice 2 fórmulas diferentes: El coeficiente de superposición de acuerdo con Manders y el coeficiente de Pearson.
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Representative Results
Para establecer un modelo de colitis antígeno impulsado por una E. coli cepa ha sido construido que contiene un plásmido en el que el gen de la PPC se fusiona a la secuencia codificante para la proteína ovoalbúmina de pollo y la construcción de fusión se expresa bajo el control del promotor constitutivo fuerte P hiper (Figura 1A). Microscopía fluorescente muestra que la E. recombinante coli pCFP-OVA, pero no el parental E. coli DH10B, expresa PPC (Figura 1B). PPC-OVA producida por E. coli es capaz de activar las células OT-II in vitro e inducir la producción de IFN-γ en contraste con una E. coli cepa que expresa PPC solamente (Figura 2). La Figura 3A muestra ex vivo 3D de imagen confocal de tejido del colon de CX 3 CR1 GFP / + ratones alimentados con E. coli pCFP-OVA. E. coli pCFP-OVA puedeser detectado dentro de las criptas colónicas localizadas cerca de las células epiteliales intestinales y co-localiza con CX 3 CR1 + fagocitos. Para determinar la proporción relativa de E. coli pCFP-OVA internalizado por CX 3 CR1 definido + fagocitos, la intensidad de fluorescencia azul y verde se determinaron mediante transferencias de dispersión. El análisis reveló que las células CX 3 CR1 + muestrearon 11,9 ± 1,5% de E. coli pCFP-OVA detectado en el colon (Figura 3B). En OT-II / animales rojos, las células T CD4 + se caracterizan por la expresión de Red y Vβ 5,1 expresión se muestra por citometría de flujo (Figura 4). La Figura 5A muestra una visión general de el modelo de colitis antígeno impulsado. Células OT-II / rojo + T CD4 + CD62L + se transfirieron de forma adoptiva en CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - destinatarios que luego fueron gavaged cada dos días con E.coli pCFP-OVA. Al ser cuestionado con E. coli pCFP-OVA, transfiere CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratones pierden peso corporal y se desarrollan signos clínicos de la colitis (Figura 5B) La figura 6 muestra ex vivo en 3D de imagen confocal de tejido del colon 7, 14 y 21 días después. reconstitución de CX 3 CR1 heterocigóticos GFP / + x RAG - / - receptores con OT-II / células rojas + desafiado con E. coli pCFP-OVA. Siete días después de la transferencia de células sólo unos pocos CX 3 CR1 + fagocitos han muestreado E. coli pCFP-OVA y OT-II / células rojas + no fueron detectados. Catorce días después de la transferencia de células, CX 3 CR1 fagocitos que muestrean + E. coli pCFP-OVA se encuentra cerca de OT-II / células rojas +. Veintiún días después de la transferencia de células de un elevado número de CX 3 CR1 + células que se han tomado muestras de E. coli pCFP-OVA y OT-II / Rcélulas ed +, dispersos a lo largo del CLP en las proximidades de CX 3 CR1 + fagocitos.
Figura 1: PPC-OVA producida por E. coli. (A) Mapa de pCFP-OVA con sitios de restricción relevantes, el gen que codifica OVA y la proteína fluorescente azul brillante PPC. (B) de campo brillante y las imágenes microscópicas fluorescentes de tipo salvaje E. coli DH10B, E. coli DH10B pCFP y E. coli DH10B pCFP-OVA. Barra de escala:. 10 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: OTLas células estimuladas con -II CFP-OVA producir IFN-γ. Después del aislamiento de bazo, células de OT-II se estimularon con los números indicados de E. coli DH10B pCFP-OVA. Las células bacterianas fueron inactivados después de la incubación de 2 horas con 5 mg de gentamicina / ml. Después de 72 horas de cultivo, se recogieron los sobrenadantes y las concentraciones de IFN-gamma determinados por ELISA. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos que se presentan como media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: CX 3 CR1 + fagocitos Muestra E. coli pCFP-OVA. (A) CLP tejido de CX 3 CR1/ + Ratones GFP gavaged con 1 x 10 8 E. coli pCFP-OVA durante 7 días y se analizaron por microscopía confocal ex vivo. Magnificación 40X / 1.30. Barra de escala = 30 micras. (B) El porcentaje de E. interiorizado coli pCFP-OVA cuantifica y datos presentan como media ± SEM. En la prueba de Mann-Whitney p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Caracterización de OT-II / rojo + CD4 + células T (A) OT-II animales transgénicos se cruzaron con los animales que expresan la proteína fluorescente de color rojo para obtener OT-II / rojo +Células. OT-II / células rojas + fueron aisladas de bazos de OT-II / Rojo animales transgénicos, teñidos para CD4 y Vß5.1 y analizadas por citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Transferencia impulsado por OVA Colitis (A) Representación esquemática del modelo de colitis antígeno impulsado.. Células OT-II / rojo + T CD4 + CD62L + se transfirieron de forma adoptiva en CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratones y fueron anfitriones gavaged cada dos días con E. coli pCFP-OVA. Peso (B) Cuerpo de los grupos indicados se midió dos veces por semana. La media ± SEM pérdida de peso corporal (%) se presenta. En la prueba de Mann-Whitneyp <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:. CX 3 CR1 + diputados comunicarse con las células OT-II durante la colitis Transferencia OVA impulsada por las muestras de tejido del colon (A) fueron examinados por ex vivo confocal de imágenes 3D en el día 7, 14 y 21 después de la transferencia de la TO-II / Rojo + CD4 + T CD62L + en las células CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - receptores. Magnificación 40X / 1.30. Barra de escala = 30 micras.
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Discussion
Al igual que con cualquier otro modelo, el modelo de colitis antígeno impulsado descrito anteriormente puede presentar algunos problemas que el investigador realiza la técnica debe tener en cuenta. Cuando se inyecta el AT-II / rojo + T CD4 + CD62L + células en los ejércitos, el investigador debe ser muy suave y cuidado de insertar la aguja en la cavidad peritoneal. El no hacerlo puede resultar en el desgarramiento del intestino del ratón, que podría conducir a la muerte, o una administración subcutánea de células que no induzcan ninguna enfermedad.
Por lo general, los ratones aumentarán de peso durante la primera semana después de la transferencia de células. El investigador debe pesar los ratones al mismo tiempo en cada punto de tiempo el peso y utilizar la misma balanza a lo largo de todo el procedimiento. A veces, los ratones experimentales, sobre todo cuando su peso al inicio del experimento es inferior a 18 g, no desarrollan ningún signo de la síndrome de desgaste. Sin embargo, estos animales might, desarrollan la inflamación intestinal significativa en evaluación macroscópica.
Cuando se trabaja con bacterias modificadas genéticamente, se pueden producir contaminaciones. Para evitar estos problemas es muy recomendable para comprobar la E. coli expresando PPC-OVA mediante el microscopio de fluorescencia para analizar si las bacterias son fluorescentes y son en forma de barra (la forma típica de E. coli).
El antígeno propuesto impulsado por colitis se basa en la observación de que CX 3 CR1 + MPs bacteria comensal muestra luminales en el estado estacionario y durante condiciones inflamatorias 36,37. La inducción de células T respuestas en el modelo de colitis antígeno impulsado ha sido demostrado por el fenotipo altamente activado de células OT-II T CD4 + a partir de los dos puntos de CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratones estimulados con el antígeno, en comparación con las células T aisladas de la CX 3 CR1 GFP / + x RAG
De formación de imágenes confocal sugiere que los fagocitos CX 3 CR1 + se encuentran cerca del epitelio intestinal de manera que puedan probar E. coli pCFP-OVA e interactuar con las células rojas + T CD4 + OT-II /. Después de fagocitos CX 3 CR1 + han muestreado E. coli pCFP-OVA el antígeno luminal se entrega a las células CD103 + dendríticas (DC) por CX 3 CR1 + fagocitos. CD103 + DC son capaces de migrar a los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) a las células T CD4 prime 37,52. Las células T cebadas se reúnen en el CLP, donde CX 3 CR1 + fagocitos muestran el antígeno OVA al correocélulas ffector T para inducir la inflamación. La entrega y presentación del antígeno por CX 3 CR1 + fagocitos podría ser un evento clave en el desarrollo de la colitis.
La capacidad de inducir la colitis con una bacteria definida que expresa un antígeno específico proporciona la oportunidad de estudiar las condiciones necesarias para el desarrollo de colitis 24. Este modelo muestra que una respuesta específica a un péptido antigénico (OVA expresada por E. coli) es suficiente para inducir la inflamación intestinal en RAG - / - hosts, lo que sugiere que las células T pueden reaccionar a antígeno específico de la microflora intestinal. Un solo antígeno puede inducir inflamación intestinal en los modelos animales pero no se puede suponer que los antígenos individuales son la causa de IBD humana. Por otra parte, en el modelo de colitis de transferencia hay células T CD4 + vírgenes que tienen especificidad desconocida y por lo tanto puede ser reactivo a múltiples, a partir de antígenos aún no identificados, a partir dela microbiota. Se necesitan análisis Major y estudios para aclarar mejor el papel de un antígeno específico en la patogénesis de la inflamación de la mucosa.
En los últimos años el uso de diferentes modelo animal de colitis ha llevado a una expansión en el conocimiento de la patogénesis de la EII 53. Sin embargo, debido a la complejidad y a la patogénesis de la enfermedad, no hay una cura definitiva 54. Utilizando el modelo descrito, es posible hacer frente a varios aspectos de la EII que no están bien aclaradas aún, tales como (i) las interacciones entre los monocitos y las células dendríticas, (ii) la migración de los DC intestinal para el MLN, (iii) la presentación de antígenos, (iv) homing de las células T efectoras de MLN a la lámina propia y (v) activación de células T efectoras en la lámina propia por CX 3 CR1 + fagocitos. Sin embargo, se necesitan más estudios para confirmar si el CX 3 CR1 + fagocitos / interacción de las células T CD4 + juega un papel clave en lala patogénesis de la EII. Los ratones no puede ser verdaderamente representativa de los seres humanos y esto debe ser tenido en cuenta cuando se utilizan modelos de ratón para estudiar la EII humana 2.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan | ||
| DNase I recombinant | 4536282001 |
References
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