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Immunology and Infection

抗原驱动结肠炎模型的开发由抗原呈递细胞T细胞抗原研究的介绍

doi: 10.3791/54421 Published: September 18, 2016

Introduction

肠道是暴露于外部环境的人体最大的表面上。居民微生物的广大阵列殖民人体的肠道内形成的肠道菌群(或微生物)。这估计是由最多百万亿微生物细胞和构成生物学1-3知人口最稠密的细菌栖息地之一。在GIT细菌定植肠道的利基在那里生存繁衍4。作为回报,菌群赋予了未编码它的基因组中1个附加的功能特征的主机。例如微生物群刺激上皮细胞的增殖,通过自身产生承载不能生产维生素,调节代谢和防止病原体4-6。鉴于这种有利的关系,一些作者认为人是“超生物体”或“holobionts”是细菌和人类基因7,8的混合。鉴于(人)主机上的微生物的有利影响,肠道免疫系统需要耐受共生微生物,使他们能够管腔存在,而且杀了,从腔侧9-11入侵的病原体。肠道免疫系统已开发机制无害的和潜在有害的管腔微生物来区分;然而这些机制尚未很好地理解12。维护肠道完整性要求严格调节免疫稳态保持宽容和豁免权13之间的平衡。在免疫稳态不平衡有助于肠道疾病的诱导如炎性肠病(IBD)3,14。

有两种主要类型的IBD:克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。患者与这些疾病通常患有直肠出血,严重腹泻和腹痛15,16。 IBD的单一原因仍未知的,但遗传因素,环境因素和错调免疫反应的组合可能是疾病发展的15关键事件。

鸡传染性法氏囊病动物模型已经使用了超过50年。在过去几十年中新的IBD模型系统已被开发来测试关于IBD 17,18的发病机制中的各种假说。慢性结肠炎的最佳表征的模型是诱导T细胞稳态19,20的破坏的T细胞转移模型。该模型涉及到从免疫活性小鼠转印幼稚T细胞分化成缺乏T和B细胞(如RAG - / -和SCID小鼠)的主机16,21。疾病在该模型的发展是通过评估腹泻的存在下,体力活动减少和体重的损失为3-10周监测。这就是所谓的消耗综合征16。相比于健康小鼠移植主机的结肠组织是thickeR,短重16。使用T细胞转移模型中,也可以理解的T细胞群如何不同可以向IBD 22的发病机制。 T细胞转移模型不分析抗原特异性方式在疾病过程中APC和T细胞之间的相互作用。它已经表明,骨髓细胞和淋巴样细胞之间的相互作用可能是负责肠道炎症23的发展。尽管IBD的许多方面都得到了澄清,仍然需要清楚地理解,导致疾病发展的初始事件。

它已经表明,在不存在的微生物转移结肠炎不能建立24。最近,一些理论认为IBD可以针对共生细菌25的免疫应答的结果。作者也提出了共生菌是必不可少的诱发炎症在远端肠26,在无菌(GF)的动物的肠道免疫系统通常受损27,28,但这些小鼠中完全胜任肠道免疫系统29的发展无特定病原体动物细菌结果的混合物的定植。因此,该微生物群似乎是在IBD的发病机理的一个关键因素,无论是作为可诱发或防止肠炎症30,31的发展的机制。当前理论认为IBD是微生物不平衡,称为生态失调,遗传倾向的患者32的结果,但是它是目前尚不清楚,如果生态失调是原因或疾病12的结果。考虑到微生物在IBD的发展中的作用, 在体外实验表明,CD4 + T细胞可以通过肠道细菌33,34脉冲式装甲运兵车被激活。

此外,已经表明,从抗原不同共生细菌物种,例如大肠杆菌大肠杆菌,类杆菌,真杆菌变形杆菌 ,能够激活CD4 + T细胞35。这表明,细菌抗原给T细胞的呈现是重要的,对IBD的发展。为了减少通过在疾病过程中的微生物衍生的多种抗原的复杂性,在大肠杆菌菌株已创建产生该OVA抗原。转移结肠炎诱导OVA特异性T细胞注射到RAG - / -动物的OVA表达E.殖民大肠杆菌

这种模型是基于最近的证据表明,CX 3 CR1 +国会议员,在结肠固有层(CLP)36的主要细胞亚群,与CD4 + T细胞转移过程中相互作用肠炎37。国会议员采样为颗粒性抗原肠腔,如细 ​​菌,使用他们的树突36,38,39。以往的研究表明,国会议员也可以占用可溶性抗原,如OVA,引入到肠腔40,41。给出的丰度的CX 3 CR1 +国会议员中电的,可能的是这些细胞可以品尝管腔细菌和与CD4的T细胞相互作用。小鼠共焦成像与大肠杆菌定植OVA特异性CD4 + T细胞移植大肠杆菌 CFP-OVA,表明CX 3 CR1 +国会议员都在抗原驱动结肠炎的发展过程中与OT-II CD4 + T细胞接触。这种模式使肠道装甲运兵车和具体仅在肠腔特定的抗原表达细菌性T细胞的抗原呈递过程的研究。

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Protocol

小鼠繁殖并保存在乌尔姆大学(德国乌尔姆)的动物设施无特定病原体(SPF)的条件下。所有的动物实验是根据当地的动物使用和保护委员会和国家动物福利法的指导进行。

1. pCFP-OVA质粒的构建

  1. 扩增使用引物Ova_SpeI_fw(3'- GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5')和Ova_ClaI_rev(3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5')37使用质粒的pCI-OVA(氨苄青霉素抗性)42作为模板的完整大小的OVA基因。克隆PCR产物( OVA编码序列)转换成使用引物和载体的SpeI位和ClaⅠ位限制位点,得到OVA特异性质粒市售噬菌体中间载体。
  2. 用质粒垫1强组成型启动子P 一起放大CFP编码基因)43作为模板和引物CFP_SacII_fw(3'- GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5')和CFP_SpeI_rev(3'- GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5')37。
  3. 克隆在CFP编码基因导入使用引物和载体37的SpeI位和SacI限制性位点的OVA特异性质粒(氨苄青霉素抗性)。这引入了从OVA编码序列在CFP编码之间6个甘氨酸残基的间隔物。

2. 大肠杆菌 pCFP-OVA建设

  1. 在旋转摇床上生长的大肠杆菌菌株DH10B于100ml的Luria BERTANI(LB)培养基中需氧的在37℃下过夜。
  2. 混合800微升的细菌培养用200μl甘油在-80℃以创建甘油和存储。
  3. 从甘油加入50μl大肠杆菌菌株DH10B的5ml LB培养基中,并在37℃下需氧生长它们在旋转振荡器OVErnight。
  4. 在旋转摇传送培养在挡板1升锥形瓶中用250毫升LB培养基在37℃。
  5. 在600nm处生长的细菌的光学密度(OD 600) 的0.5,然后冷却在冰上培养30分钟。离心细菌在5000 xg离心在4℃下10分钟。
  6. 重悬细菌与5000 xg离心100ml冰水冷无菌H 2 O和离心机细菌的10分钟,在4℃下重悬的细菌用100ml冰冷的10%甘油和离心机细菌在5000 xg离心10分钟在4℃下。重复此最后步骤两次。
  7. 在最后的洗涤步骤后,重悬细菌在700微升10%的甘油。冷冻在液氮中并储存50微升等分试样在-80℃。
  8. 在冰上解冻并转移50微升等分试样到预先冷却的电穿孔杯中(2毫米电极距离)。
  9. 添加5微升质粒DNA(100毫微克)与50微升大肠杆菌大肠杆菌 aliquoTS。与单个脉冲在25μF,200欧姆(Ω)和2.5千伏执行电穿孔。
  10. 悬浮的细菌在1ml预热SOC培养基(5克/升酵母提取物,2g / L胰蛋白胨,10mM的氯化钠,2.5mM的氯化钾,10mM氯化镁,10mM的硫酸镁)并孵育在37℃下需氧1小时。
  11. 在LB琼脂平板上平板菌补充有氨苄青霉素100微克/毫升(加100微升100毫克/毫升的氨苄青霉素的库存,以100毫升的LB琼脂),并孵育过夜需氧在37℃。
  12. 接单菌落并重新条纹它们在补充有氨苄青霉素100微克/毫升的LB琼脂平皿上。隔夜孵育有氧37℃。
  13. 接单菌落,并在10毫升LB培养基补充有氨苄青霉素100微克/毫升为质粒分离生长过夜它们。使用市售的质粒微型制备试剂盒和洗脱质粒DNA利用根据制造商30微升的dh 2 O(蒸馏水)'的规程。验证通过限制性分析和DNA测序37,42,43质粒。
  14. 设置E的阳性克隆的培养大肠杆菌 pCFP-OVA在100ml LB培养基中补充有氨苄青霉素100微克/毫升。在37℃下需氧生长于旋转摇床上过夜。
  15. 混合800微升用200μl纯甘油和存储的细菌培养物在-80℃。
  16. 离心过夜培养的其余部分在5000 xg离心在室温(RT)下10分钟,并且重悬沉淀在磷酸盐缓冲盐水(PBS)。放置10微升悬浮液到载玻片,并用盖玻片覆盖。
  17. 观察样品在标准荧光显微镜来确认CFP-OVA的表达荧光(CFP激发在450nm,在480nm处发射)。分析开始放大400X的细菌。
  18. 离心机1毫升细菌从过夜培养物在5000×g离心10分钟,室温。悬浮颗粒在40微升PBS中并在95℃下进行10分钟煮沸。
  19. 离心样品以30,000×g离心10分钟,用上清液进行Western印迹分析37。使用稀释1兔子饲养抗OVA多克隆抗体:400。

3. OT-II的生成/小鼠红

  1. 为了产生OT-II /红小鼠37交叉与雌性/雄性小鼠表达红色荧光蛋白的男/女OT-II小鼠(两种菌株市售)。

4.脾细胞分离

  1. 通过任何卤代醚吸入安乐死通过颈脱位对OT-II /红色小鼠麻醉后(最多5%为诱导)商购获得。
  2. 用剪刀剪下鼠标的左上腹部。根据本腹部有脾(用暗红色椭圆形状)。用剪刀和镊子将其删除。
    1. 提取OT-II /红小鼠脾脏并通过它通过100微米的细胞滤网定位在用1ml注射器的柱塞,以获得单细胞悬浮液的50ml管中。洗过滤两次10mL的PBS补充有1%热灭活的胎牛血清(FBS)。
  3. 离心细胞悬浮液在390×g离心在RT 5分钟。重悬沉淀用5ml预温裂解缓冲液(144毫氯化铵 ,17毫摩尔Tris,pH值= 7.2)的裂解红血细胞。孵育在37℃下10分钟。
  4. 洗样品用25毫升的PBS补充有1%FBS的。离心在390×g离心在RT 5分钟。重悬沉淀在10ml PBS中补充有1%FBS的。
  5. 算使用Neubauer计数室中的细胞。混合10微升细胞悬浮液与10微升0.4%台盼蓝溶液。孵育1-2分钟。
    1. 用10微升染色的细胞填充血细胞计数器室。算上在显微镜下细胞的四个1×1毫米2的广场之一腔和determin的È每平方细胞的平均数量。活细胞出现白色,死细胞呈现蓝色。为了确定细胞的数目/ ml的稀释的因子相乘细胞数。如果2-4象限被计算,通过象限数分裂。

5. CD4 + CD62 L + T细胞富集

  1. 丰富使用阴性或阳性选择的原则,通过磁分离试剂盒CD4 + CD62L + T细胞的脾细胞。这里,使用负选择来分离CD4 + T细胞,并使用阳性选择来进一步富集的CD4 + T细胞池中的CD62L +群体。
    注意:在负选择过程,细胞,这将在不分离(此处为:所有的CD4阴性细胞)标记配上磁微珠特异性抗体。在柱洗涤步骤的CD4 + T细胞会穿过柱,以便它们可以EASILY收集。在阳性选择步骤的细胞分离标以加上磁微珠适当抗体。在柱洗涤步骤的标记的细胞会留在柱上,它们可通过从磁场去除柱,并用缓冲液漂洗它被收集。
  2. 对于阴性选择过程,悬浮10 7个总脾细胞在冷PBS中40微升补充有0.5%牛血清白蛋白(BSA)。添加与磁分离试剂盒提供的生物素标记的抗体混合物的10微升(特异性抗体结合的非CD4 + T细胞),并在冰上孵育15分钟。
    1. 添加冷的PBS30μl的补充有0.5%BSA和20微升抗生物素微珠。在冰上孵育20分钟。
    2. 添加到样品10毫升的PBS补充有0.5%BSA和离心机在390×g离心5分钟。重复此步骤两次。重悬细胞于1ml冷PBS补充有0.5%的BS一个。
    3. 将特定于磁场中的阴性选择过程的柱并用3ml冷PBS冲洗补充有0.5%BSA的到柱上。用3ml冷PBS添加细胞悬液到柱上洗3次补充有0.5%BSA的。
    4. 在390×g离心5分钟的流出物的离心机的细胞。流出物穿过该列包含未标记的CD4 + T细胞。重悬在1ml的PBS中补充有0.5%BSA的沉淀和计数细胞。
    5. 算使用Neubauer计数室中的细胞。混合10微升细胞悬浮液与10微升0.4%台盼蓝溶液。孵育1-2分钟。
      1. 用10微升染色的细胞填充血细胞计数器室。算在显微镜下的细胞中四个1×1毫米2平方一个腔室,并确定每平方细胞的平均数量。活细胞出现白色,死细胞呈现蓝色。为了确定细胞/ mL乘法CEL的数目L请稀释因子数量。如果2-4象限被计算,通过象限数分裂。
  3. 对于正的选择过程中,添加每10 7预富集的CD4 + T细胞分数为10微升CD62L微珠。在冰上孵育15分钟。
    1. 添加到样品10毫升的PBS补充有0.5%BSA和离心机在390×g离心5分钟。重复此步骤两次。重悬在500微升冷PBS补充有0.5%BSA的。
    2. 放置用于负选择过程的特定列中的磁场,并用冷的PBS 500微升补充有0.5%BSA的到柱上冲洗。添加细胞悬浮液上柱洗3次用500微升冷PBS补充有0.5%BSA的。
    3. 从磁场中删除列,并将其放置在合适的收集管。加入1毫升的PBS补充有0.5%BSA的上柱并冲洗掉 CD4 + CD62L + T细胞■通过力推活塞入列保留在列。
      注:将分离 CD4 + CD62L + T细胞现在准备用于下游应用中,例如在体内实验。根据来自CD4 + CD62L + T细胞分离试剂盒制造商的指示,在微珠没有毒性。由于小尺寸(约50纳米),它们不活化细胞,它们将不会饱和的细胞表面表位。因此,分离的细胞可以转移到免疫缺陷小鼠中诱导结肠炎37,44,45。
    4. 算使用Neubauer计数室中的细胞。混合10微升细胞悬浮液与10微升0.4%台盼蓝溶液。孵育1-2分钟。
      1. 用10微升染色的细胞填充血细胞计数器室。算在显微镜下的细胞中四个1×1毫米2平方一个腔室,并确定每平方细胞的平均数量。活细胞APPEAR白色,死细胞呈现蓝色。为了确定细胞的数目/ ml的稀释的因子相乘细胞数。如果2 - 4象限被计算,通过象限数除以。

6.感应抗原驱动结肠炎

  1. 注入腹膜内3×10 5个的OT-II /红色 CD4 + CD62L + T细胞到CX 3 CR1 GFP / + X RAG - / -小鼠。抗原特异性结肠炎的诱导,辖E.大肠杆菌 pCFP-OVA在灌胃或口服滴注门牙后面的剂量在每只动物100μl的PBS中1×10 8菌落形成单元(CFU)的每隔一天。
  2. 监测,每周两次体重移植小鼠和它们的临床状况(在小鼠的粪便,粪便稠度和活动的血存在下)。

7.组织样本进行组织病理学检查

  1. 取组织样品从第È大小鼠小肠,固定在中性缓冲的福尔马林(10%)和嵌入在石蜡如前所述36,46。
  2. 第一个切片石蜡样品,安装在幻灯片,并进行H&E染色47,48。
  3. 归类大肠的组织学如先前47,48出版:正常(0分);轻度结肠炎(1分),中度结肠炎(2分)和重度结肠炎(3分)。

8.隔离肠粘膜固有层细胞

  1. 通过颈椎脱位通过任何卤代醚吸入麻醉后(最多5%为诱导)市售安乐死移植小鼠。
  2. 将动物打倒肚皮朝上。使用镊子向前抢皮肤尿道口。用剪刀剪开皮肤沿腹股沟到胸部腹中线。拉背部的皮肤两侧。
  3. 透过透明的腹腔壁肌肉和切开放的体腔。确定从肛门进入盲肠49结肠。切2四肢,不受任何脂肪组织。
  4. 纵向打开使用夹层剪刀结肠。使用镊子撼结肠组织中含有25毫升的PBS培养皿补充有1%FBS的以除去碎片和粘液。切结肠到5 - 8 mm产品件。
  5. 放置在含有20毫升洗涤缓冲液的50ml管中的结肠段。所述洗涤缓冲液包含500毫升DPBS,10mM的HEPES和5mM的乙二胺四乙酸(EDTA)。
  6. 涡管在最大速度30秒。
  7. 用200rpm振荡10分钟孵育的水浴结肠段管中在37℃。
  8. 培养后,涡管在最大速度30秒。
  9. 丢弃上清液,然后将组织样本中含有20毫升洗涤缓冲液的一个新的50ml管中。重复步骤6-9三次
  10. 丢弃在Supernatants并将组织样品中含有25毫升的PBS的培养皿。使用镊子轻轻摇动组织样品在陪替氏培养皿几秒钟以除去残余的上皮细胞。重复此步骤三次。
  11. 切结肠组织成2×2mm的2块和在10ml罗斯韦尔园区纪念研究所(RPMI)与来自溶组织梭菌0.5毫克/毫升胶原酶类型八和10U / ml的DNA酶I的培养基中孵育消化它们。
  12. 涡管在最大速度30秒。
  13. 用200rpm振荡35分钟孵育的水浴结肠片段,在37℃和涡管为在最大速度30秒,每5分钟。
  14. 在孵育结束时涡管在最大速度30秒。
  15. 通过使它们通过设置在一个新的50ml管中70微米的细胞滤网收集消化的片段。
  16. 通过加入20ml的DPBS和离心机在400克5分钟洗涤样品。然后悬浮ŧ他的细胞在1毫升的DPBS。
  17. 算使用Neubauer计数室中的细胞。混合10微升细胞悬浮液与10微升0.4%台盼蓝溶液。孵育1-2分钟。
    1. 用10微升染色的细胞填充血细胞计数器室。算在显微镜下的细胞中四个1×1毫米2平方一个腔室,并确定每平方细胞的平均数量。活细胞出现白色,死细胞呈现蓝色。为了确定细胞的数目/ ml的稀释的因子相乘细胞数。如果2-4象限被计算,通过象限数分裂。

9.外染色的FCM分析

  1. 离心390×g的中电细胞5分钟。重悬细胞于1ml的FACS A的(PBS补充有1%BSA和0.1%叠氮化钠)
    注:叠氮化钠是剧毒。它可引起低血压,低体温,头痛抽搐甚至死亡。稀叠氮化钠溶液(0.1%至1.0%),通常不呈现非凡危险给用户,但它们的眼睛和皮肤的刺激物。因此,使用叠氮化钠只有在化学罩,而穿着实验室外套和一个双对一次性丁腈橡胶手套。
  2. 孵育15分钟,将细胞在室温用FACS A.稀释单克隆抗体(mAb)2.4G2针对FcγRIII/ II CD16 / CD32(0.5-1微克单抗/ 10 6个细胞)
  3. 加入200μlFACS A的在390×g的细胞和离心5分钟。重复此步骤两次。孵育将细胞与0.5在4℃纳克相关mAb的/ 10 6个细胞20分钟。稀释FACS A.抗体
  4. 加入200μlFACS A的在390×g的细胞和离心5分钟。重复此步骤两次。重悬的样品在100μl的FACS A的
  5. 从CX 3分析T细胞CR1 GFP / + X RAG - / -与OT-II /红色的CD4 T细胞在流式细胞仪37的流动重组小鼠。

10.共聚焦显微镜分析

  1. 分析重组或不与OT-II /红色 CD4 + CD62L + T细胞的CX 3 CR1 GFP / +小鼠的结肠和口服喂养每隔一天用大肠杆菌的1×10 8 CFU 大肠杆菌菌株DH10B pCFP-OVA。
  2. 取下用剪刀和镊子小鼠结肠。打开它使用纵向解剖剪刀。
  3. 切割用剪刀一个5-8毫米一块结肠样品,放到玻片,用盖玻片覆盖。
  4. 以40 / 1.30的倍率分析用共焦显微镜的结肠样品。
  5. 检测在CX 3 CR1 +国会议员,标记有绿色荧光蛋白(GFP),使用一个滤波器与在488nm激发和发射在509处设置的。
  6. 检测表达使用过滤器在58与554纳米的激发和发射设置红蛋白的CD4 + T细胞6纳米。
  7. 使用过滤器以在450nm激发和发射在480nm设置检测大肠杆菌 pCFP-OVA。
  8. 定义感兴趣的区域,并产生如先前所述50进行的共定位分析散点图。使用2种不同的公式:按曼德斯和Pearson的系数的重叠系数。

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Representative Results

要建立抗原驱动结肠炎模型中的E.大肠杆菌菌株 已构建了包含在其中在强组成型启动子P 图1A)的控制被表示为在CFP的基因融合到为鸡卵清蛋白和所述融合构建体的编码序列的质粒。荧光显微镜显示重组大肠杆菌大肠杆菌 pCFP-OVA,但不是亲本大肠杆菌大肠杆菌 DH10B,表达CFP( 图1B)。 CFP-OVA-生产E.大肠杆菌是能够激活体外的OT-II细胞和诱导的IFN-γ产生相反大肠杆菌大肠杆菌菌株表达CFP只( 图2)。 图3A示出的CX 3 CR1 GFP / +小鼠的结肠组织与E.供给体外三维共焦成像大肠杆菌 pCFP-OVA。E.大肠杆菌 pCFP-OVA能与CX 3 CR1 +吞噬靠近肠上皮细胞和结肠隐窝内检测共定位。为了确定E的相对比例大肠杆菌 pCFP-OVA所限定的CX 3 CR1 +吞噬细胞,蓝色和绿色荧光强度被散射印迹确定内化。的分析表明,CX 3 CR1 +细胞取样E的11.9±1.5% 大肠杆菌 pCFP-OVA在结肠中( 3B)。在OT-II /红色动物检测,CD4 + T细胞的特征在于红色表达和Vβ通过流式细胞术( 图4)示出5.1的表达。 图5A示出的一般概述抗原驱动结肠炎模型。 OT-II /红+ CD4 + T CD62L +细胞继转移到CX 3 CR1 GFP / + X RAG - / -收件人然后每隔一天管饲与E.大肠杆菌pCFP-OVA。当与挑战E.大肠杆菌 pCFP-OVA,转移CX 3 CR1 GFP / + X RAG - / -小鼠失去体重和发展结肠炎( 图5B)的临床症状图6显示了体外 3D结肠组织7,14天和21天之后的共聚焦成像。杂CX的重建3 CR1 GFP / + X RAG - / -收件人与OT-II /挑战与E.+细胞大肠杆菌 pCFP-OVA。细胞移植后七天只有少数CX 3 CR1 +巨噬细胞已经采样E.大肠杆菌 pCFP-OVA和OT-II /未检出红+细胞。细胞移植后14天,即CX E.抽样CR1 3 + ​​巨噬细胞大肠杆菌 pCFP-OVA分别靠近OT-II /红+细胞。细胞之后二十一天传送大量的CX的已采样的大肠杆菌 3 CR1 +细胞大肠杆菌 pCFP-OVA和OT-II / RED +细胞,分散在整个电靠近CX 3 CR1 +巨噬细胞。

图1
图1:CFP-OVA产 E. pCFP-OVA的大肠杆菌 。(A)与地图相关的限制性酶切位点,编码OVA和亮蓝色荧光蛋白CFP基因。 (B)明场和野生型大肠杆菌的荧光显微图像大肠杆菌 DH10B,E.大肠杆菌 DH10B pCFP和E.大肠杆菌 DH10B pCFP-OVA。比例尺:10微米请点击此处查看该图的放大版本。

图2
2:OT与CFP-OVA刺激-II细胞产生IFN-γ,从脾分离后,OT-II细胞用E的指示数字刺激大肠杆菌 DH10B pCFP-OVA。细菌细胞灭活以下用5微克/毫升庆大霉素2小时培养。培养72小时后,收集上清和IFN-γ的浓度通过ELISA测定。实验在以平均值±SEM一式三份和数据进行。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
3:CX 3 CR1 + 吞噬细胞样品 E.大肠杆菌 pCFP-OVA。(A)CX CR1 3中电组织GFP / +小鼠饲喂1×10 8 大肠杆菌大肠杆菌 pCFP-OVA 7天,通过体外共焦显微镜分析。放大倍数40X / 1.30。比例尺= 30微米。 (B)的内化大肠杆菌的百分比大肠杆菌 pCFP-OVA定量和数据表示为平均值±SEM表示。在Mann-Whitney检验P <0.05为差异有统计学显著。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
4:OT-II /红+ CD4 + T细胞 的表征 (A)中的OT-II的转基因动物用表达红色荧光蛋白的动物,得到的OT-II在划线/红+细胞。 OT-II /红+细胞从OT-II /红色的脾中分离 转基因动物,染色CD4和Vß5.1并通过流式细胞仪分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5:OVA驱动的传输结肠炎 (A)抗原驱动结肠炎模型的示意图 OT-II /红+ CD4 + T CD62L +细胞继转移到CX 3 CR1 GFP / + X RAG - / -小鼠和主机灌胃每隔一天与E.大肠杆菌 pCFP-OVA。所指示的基团的(B)的体重是每周两次测量。平均值±SEM体重减轻(%)提出。在Mann-Whitney检验P <0.05为差异显著。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
6:CX 3 CR1 + 国会议员通信用的OT-II细胞在OVA驱动转移结肠炎 (A)的结肠组织样品通过体外三维共焦成像在7第14天,和21的OT-II /红色的转印后检查+ CD4 + T CD62L +细胞的CX 3 CR1 GFP / + X RAG - / -收件人。放大倍数40X / 1.30。比例尺= 30微米。

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Discussion

与所有其他的模式,上述的抗原驱动结肠炎模型可呈现在执行该技术的研究者必须意识到几个问题。当注射OT-II /红+ CD4 + T CD62L +细胞在主机上,研究者必须非常温柔细心针插入腹腔。不这样做可能会导致在小鼠可能导致死亡,或这将不会引起任何疾病的细胞的皮下给药的肠的撕裂。

通常情况下,老鼠会在细胞转移后的第一周体重增加。研究者应当在每个重量时间点,同时权衡小鼠和使用在整个过程中同样重的平衡。有时实验小鼠中,尤其是当在实验开始时其重量低于18克,不发展的消耗综合征的任何迹象。然而,这些动物mighŧ还是发展的宏观评价下显著肠道炎症。

当转基因细菌的工作,可发生污染。为了避免这些问题,我们强烈建议检查大肠杆菌通过荧光显微镜来分析,如果细菌荧光并杆状(典型的大肠杆菌形状)表达CFP-OVA。

所提出的抗原从动结肠炎依赖于观察到在稳定状态,并且在炎性病症36,37 CX 3 CR1 +国会议员样品共生管腔细菌。的T细胞应答的抗原驱动结肠炎模型的诱导已经由OT-II CD4 + T细胞的来自CX 3 CR1 GFP的冒号的高度活化的表型表明/ + X RAG - / -与抗原攻击的小鼠,相比,从CX 3 CR1 GFP / + X RAG分离T细胞37挑战。这是与其中先前的研究中,在RAG的OT-II T细胞的过继转移后一致- / -小鼠中,当主机用OVA-表达大肠杆菌攻击结肠炎仅诱导大肠杆菌 51。

共焦成像表明CX 3 CR1 +吞噬细胞的位置靠近肠上皮,以便它们可以品尝E.大肠杆菌 pCFP-OVA 和OT-II /红 + CD4 + T细胞相互作用 。经过3 CX CR1 +巨噬细胞已经采样E.大肠杆菌 pCFP-OVA管腔抗原由CX 3 CR1 +吞噬细胞递送到CD103 +树突细胞(DC)。 CD103 + DC是能够迁移到肠系膜淋巴结(MLN),以总理的CD4 T细胞37,52。激活的T细胞聚集在那里CLP CX 3 CR1 +巨噬细胞显示OVA抗原到effector T细胞以诱导炎症。抗原通过CX递送和呈现3 CR1 +吞噬细胞可以在结肠炎的发展的关键事件。

诱发结肠炎表达特异性抗原定义的细菌的能力提供了学习的机会,对结肠炎24的发展的必要条件。此模型表明对抗原肽(OVA由大肠杆菌表达的)的特定的响应是足以诱导肠道炎症在RAG - / -主机,这表明T细胞可以对特定抗原从肠道菌群反应。单个抗原可诱导肠道炎症的动物模型,但它不能被假定单个抗原是人类IBD的起因。此外,在转移结肠炎模型存在具有未知特异性,因此可能是反应性的,以多个身份不明的抗原的幼稚CD4 + T细胞,从菌群。需要大型的分析和研究,以更好地阐明的特定抗原的粘膜炎症的发病机制中的作用。

近年来结肠炎的不同的动物模型的使用,导致在IBD 53的发病机制的知识的膨胀。然而,由于复杂性和该疾病的发病机理,还没有一个明确的治愈54。使用所描述的模型,有可能解决IBD的几个方面没有得到很好的澄清的是,如单核细胞和树突细胞之间(ⅰ)的相互作用,(ⅱ)肠的DC至MLN的迁移,(ⅲ)抗原呈递(ⅳ)由CX 3 CR1 +吞噬细胞从MLN效应T细胞的固有层和(v)的效应T细胞的活化在固有层的归巢。然而,还需要进一步的研究来证实,如果CX 3 CR1 +巨噬细胞/ CD4 + T细胞相互作用中起着关键的作用在IBD发病机制。小鼠不能真正代表人类和这一点必须牢记,当小鼠模型用于研究人类IBD 2。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 244620
Rotary Shake Reiss Laborbedarf e. K. Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes  Peqlab Biotechnologie GmbH 71-2020
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system  BioRad Laboratories GmbH 1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Difco 244510
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5G
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation Kit Roche 11754777001
Agarose Carl Roth GmbH & Co 3810.1
EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 537020 
Gel chamber  PEQLAB Biotechnology GmbH 40-0708
Loading Dye Thermo Fisher R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder  Thermo Fisher SM0312
Ethidium bromide solution Carl Roth GmbH & Co. KG 2218.3
Photo-documentation system  Decon Science Tech GmbH DeVision G 
DNA sequencing  MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS) Biochrom L182-50
Fluorescent microscope  Zeiss HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad Laboratories GmbH 1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue Solution Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane  Macherey-Nagel GmbH & Co. KG 741280
Electro blotter  Biometra GmbH 846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody  Abcam ab181688
Anti-rabbit IgG  HRP Sigma-Aldrich A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc 32132
Forene Abbott 2594.00.00
FBS Invitrogen 10500-064
Falcon Cell Strainers Fischer Scientific  08-771-2
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134-5G
Tris Base Sigma-Aldrich 10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit  Miltenyi Biotec 130-093-227 
MACS LS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Feeding Needle 20G SouthPointe Surgical Supply, Inc FN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128
Paraffin Sigma-Aldrich 1496904
Hematoxylin Sigma-Aldrich H9627
Eosin Y Sigma-Aldrich 230251 
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779 
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium AppliChem A2044, 9050
Sodium azide Sigma-Aldrich 438456
Mouse BD Fc Block BD Pharmingen 553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2  BD Pharmingen 553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5  eBioscience 17-0041-83
FACS Calibur  BD Biosciences
FCS Express V3 software DeNovo
Meta scanning confocal microscope  Zeiss LSM 710 
Zeiss Workstation Zeiss LSM 7
Zeiss ZEM software  Zeiss v4.2.0.121
Maxisorp immuno plates  NUNC, Roskilde 442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase Jackson Immuno Research 016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich 71768-5G
mAb R4-6A2 BD Biosciences 551216
mAb XMG1.2  BD Biosciences 554410
TECAN microplate-ELISA reader Tecan
EasyWin software Tecan
DNase I recombinant 4536282001

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References

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抗原驱动结肠炎模型的开发由抗原呈递细胞T细胞抗原研究的介绍
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Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).More

Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).

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