Introduction
De darm is het grootste vlak van het lichaam dat is blootgesteld aan de externe omgeving. Enorme arrays van de ingezeten microben koloniseren de menselijke darm de darmflora (of microflora) te vormen. Dit is naar schatting bestaan uit maximaal 100000000000000 microbiële cellen en vormt een van de meest dichtbevolkte bacteriële habitats in de biologie 1-3 bekend. In het GIT bacteriën koloniseren een intestinale niche waar ze kunnen overleven en zich vermenigvuldigen 4. In ruil daarvoor, de microbiota schenkt de gastheer met extra functionele kenmerken niet gecodeerd op zijn genoom 1. Bijvoorbeeld de microbiota stimuleert de proliferatie van epitheelcellen, produceert vitaminen die gastheer kan produceren op zichzelf metabolisme reguleert en beschermt tegen pathogenen 4-6. Gezien deze voordelige relatie, hebben sommige auteurs gesuggereerd dat de mens zijn "super-organismen" of "holobionts", dat zijn een mix van bacteriële en menselijke genen 7,8. Gezien de gunstige invloed van de microbiota van de (menselijke) gastheer, de intestinale immuunsysteem moet commensal microben tolereren om hun bestaan in het lumen mogelijk te maken, maar ook de dood van de ziekteverwekkers die binnenvallen van luminale kant 9-11. De intestinale immuunsysteem mechanismen om onderscheid te maken tussen onschadelijke en potentieel schadelijke microben luminaal ontwikkeld; Maar deze mechanismen zijn nog niet goed begrepen 12. Handhaven intestinale integriteit vereist een strak gereguleerd immuunhomeostase het evenwicht tussen tolerantie en immuniteit 13 houden. Een onbalans bij immuun homeostase bij aan de inductie van intestinale ziekten zoals inflammatoire darmziekten (IBD) 3,14.
Er zijn twee belangrijke types van IBD: ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC). Patiënten met deze ziekten vaak lijden aan rectaal bloeden, ernstige diarree en buikpijn 15,16. De oorzaak van IBD is nog steedsonbekend, maar een combinatie van genetische factoren, omgevingsinvloeden en ontregelde immuunreacties kunnen de belangrijkste gebeurtenis ziekteontwikkeling 15 zijn.
Diermodellen voor IBD zijn al meer dan 50 jaar. In de afgelopen decennia nieuwe IBD modelsystemen ontwikkeld om de verschillende hypothesen met betrekking tot de pathogenese van IBD 17,18. De meest bestudeerde van chronische colitis is de T-celoverdracht model verstoring van T-cel homeostase 19,20 induceert. Dit model gaat overbrengen naïeve T-cellen van muizen in immunocompetente gastheer die T- en B-cellen (bijvoorbeeld RAG - / - muizen en SCID) missen 16,21. De ontwikkeling van de ziekte in dit model wordt gecontroleerd 3-10 weken door onderzoek van de aanwezigheid van diarree, verminderde fysische activiteit, en verlies van lichaamsgewicht. Dit wordt zo genoemd het wasting syndroom 16. In vergelijking met de gezonde muizen de dikke weefsel van getransplanteerde gastheren is Thicker, korter en zwaarder 16. DE T celoverdracht model, is het mogelijk om te begrijpen hoe verschillende T cel populaties kan bijdragen tot de pathogenese van IBD 22. De T celoverdracht model niet de interactie tussen APC en T-cellen in het ziekteproces analyseren een antigeen-specifieke wijze. Het is aangetoond dat een interactie tussen myeloïde cellen en lymfoïde cellen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van darmontsteking 23 zijn. Hoewel veel aspecten van IBD zijn opgehelderd, de initiële gebeurtenissen die leiden tot de ontwikkeling van de ziekte moet nog duidelijk worden begrepen.
Aangetoond is dat bij het uitblijven van microbiota overdracht colitis kan niet worden vastgesteld 24. Onlangs heeft een aantal theorieën komt IBD gevolg van een immuunrespons tegen commensale bacteriën 25 zijn. Auteurs hebben voorgesteld dat commensale bacteriën noodzakelijk om ontsteking te induceren in de distale darm26. In kiemvrij (GF) dieren de intestinale immuunsysteem verzwakte 27,28, maar een kolonisatie van deze muizen met een mengsel van specifiek-pathogeenvrije bacteriën resulteert in de ontwikkeling van de volledig competent intestinaal immuunsysteem 29. Vandaar de microbiota lijkt een sleutelelement in de pathogenese van IBD, hetzij als een mechanisme dat predisponeert voor of beschermen tegen de ontwikkeling van darmontsteking 30,31. Huidige theorieën komt IBD is een gevolg van microbiële onbalans, genoemd dysbiose in genetische aanleg 32 patiënten, maar het is niet duidelijk of de dysbiosis de oorzaak of gevolg van de ziekte 12. Gezien de rol van micro-organismen in de ontwikkeling van IBD, in vitro experimenten toonden aan dat CD4 + T-cellen kunnen worden geactiveerd door APCs gepulst met darmbacteriën 33,34.
Bovendien is aangetoond dat antigenen vanverschillende commensale bacteriën, zoals E. coli, Bacteroides, Eubacterium en Proteus, kunnen CD4 + T-cellen 35 activeren. Dit geeft aan dat de presentatie van bacteriële antigenen aan T-cellen van belang is voor de ontwikkeling van IBD. De complexiteit van meerdere antigenen verkregen door de microflora in de ziekte te verminderen, heeft E. coli stam gecreëerd die het OVA antigen produceert. Overdracht colitis werd geïnduceerd door injectie van OVA-specifieke T-cellen in RAG - / - dieren gekoloniseerd met OVA tot expressie E. coli.
Dit model is gebaseerd op de recente aanwijzingen dat CX 3 CR1 + Kamerleden, een grote mobiele subgroep in het colon lamina propria (CLP) 36, zijn interactie met CD4 + T-cellen tijdens de overdracht colitis 37. MPs proeven het darmlumen voor deeltjesvormig antigeen, zoals bacteriën, met behulp van hun dendrieten 36, 38,39. Vorige studiesaangetoond dat MPs ook kan opnemen oplosbare antigenen, zoals OVA, ingebracht in het darmlumen 40,41. Gezien de overvloed van CX 3 CR1 + MPs in de CLP, is het mogelijk dat deze cellen luminale bacteriën monster en interactie met CD4 T-cellen. Confocale beeldvorming van muizen getransplanteerd met OVA-specifieke CD4 + T-cellen gekoloniseerd met E. coli CFP-OVA, blijkt dat CX 3 CR1 + MPs in contact met OT-II CD4 + T-cellen tijdens de ontwikkeling van antigeen gedreven colitis. Dit model maakt de studie van de antigeenpresentatie proces tussen intestinale APC's en T-cellen die specifiek alleen voor specifieke antigeen expressie bacteriën in het darmlumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De muizen werden gefokt en onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in het dier faciliteit van Ulm University (Ulm, Duitsland) gehouden. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het plaatselijke dierenasiel gebruik en onderhoud commissie en de Nationale Animal Welfare Law.
1. De bouw van de pCFP-OVA Plasmid
- Versterken de volledige grootte OVA gen met de primers Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') en Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 met behulp van vector pCI-OVA (ampicilline resistente) 42 als een matrijs. Kloon het PCR product (de OVA coderende sequentie) in een in de handel verkrijgbaar faag mid-vector met behulp Spel en Clal restrictieplaatsen van de vector en primers aan de specifieke OVA-plasmide verkregen.
- Versterken de GVB-coderende gen samen met de sterke constitutieve promotor P hyper behulp van plasmide pad 1 43 als een matrijs en primers CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') en CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
- Kloon de CFP-coderende gen in de specifieke OVA-plasmide (ampicilline resistente) met de Spel en SacI restrictieplaatsen van de vector primers en 37. Dit introduceert een spacer van 6 glycine residu's tussen de GVB-codering van OVA-coderende sequentie.
2. Constructie van E.coli pCFP-OVA
- Kweek E. coli stam DH10B in 100 ml Luria Bertani (LB) -medium aeroob bij 37 ° C op een roterende schudder overnacht.
- Meng 800 gl bacteriekweek met 200 pl glycerol glycerol en opslag te creëren bij -80 ° C.
- Voeg 50 pl E.coli stam DH10B uit glycerol voorraad in 5 ml LB medium en groeien ze aëroob bij 37 ° C op een roterende schudinrichting overnight.
- Breng de kweek in een van schotten 1 L erlenmeyer met 250 ml LB-medium bij 37 ° C in een roterende schudden.
- Groeien bacteriën tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van 0,5 en dan chill de cultuur op ijs gedurende 30 min. Centrifugeer de kiemen bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer bacteriën met 100 ml van ijskoud steriel H2O en gecentrifugeerd bij 5000 xg bacteriën gedurende 10 minuten bij 4 ° C Resuspendeer bacteriën met 100 ml ijskoude 10% glycerol en centrifugeer de kiemen bij 5000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Herhaal deze laatste stap twee keer.
- Na de laatste wasstap, resuspendeer bacteriën in 700 pi 10% glycerol. Freeze 50 gl aliquots in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.
- Ontdooi een 50 pi aliquot op ijs en overbrengen in een voorgekoeld elektroporatie cuvette (2 mm elektrodeafstand).
- Voeg 5 ul plasmide-DNA (100 ng) met de 50 pl E. coli aliquots. Voer elektroporatie met een enkele puls bij 25 uF, 200 ohm (Ω) en 2,5 kV.
- Resuspendeer bacteriën in 1 ml voorverwarmde SOC medium (5 g / l gistextract, 2 g / l trypton, 10 mM natriumchloride, 2,5 mM kaliumchloride, 10 mM magnesiumchloride, 10 mM magnesiumsulfaat) en incubeer bij 37 ° C aëroob gedurende 1 uur.
- Plaat bacteriën op LB-agarplaten gesupplementeerd met ampicilline 100 ug / ml (voeg 100 ul van een 100 mg / ml ampicilline bouillon aan 100 ml LB-agar) en incubeer overnacht aëroob bij 37 ° C.
- Pick enkele kolonies en opnieuw streak ze in LB-agarplaten gesupplementeerd met ampicilline 100 ug / ml. Incubeer overnacht aëroob bij 37 ° C.
- Pick enkele kolonies en groeien ze overnacht in 10 ml LB medium aangevuld met ampicilline 100 ug / ml voor plasmide-isolatie. Gebruik in de handel verkrijgbare plasmide mini prep kit en elueer plasmide DNA met 30 pi dH 2 O (gedestilleerd water) volgens de fabrikant '; S protocol. Controleer plasmiden door restrictie-analyse en DNA-sequencing 37,42,43.
- Het opzetten van een cultuur van positieve klonen van E. coli pCFP-OVA in 100 ml LB medium aangevuld met ampicilline 100 ug / ml. Grow aëroob bij 37 ° C op een roterende shaker 's nachts.
- Meng 800 gl bacteriekweek met 200 pi zuivere glycerol en bewaar bij -80 ° C.
- Centrifugeer de rest van de kweek gedurende de nacht bij 5000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT) en resuspendeer de pellet in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Breng 10 ul van de suspensie op glasplaatje en bedek het met een dekglaasje.
- Let op de monsters in een standaard fluorescentie microscopie om de expressie fluorescentie van de GVB-OVA (GVB excitatie bij 450 nm, emissie bij 480 nm) te bevestigen. Analyseer de bacteriën beginnen met vergroting 400X.
- Centrifuge 1 ml bacteriën overnacht kweken bij 5000 xg gedurende 10 min, RT. Resuspendeer de pellet in 40 glPBS en kookt bij 95 ° C gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer de monsters bij 30.000 xg gedurende 10 min en de supernatanten gebruikt voor Western blot-analyse 37. Gebruik de-konijn verhoogde anti-OVA polyklonaal antilichaam verdund 1: 400.
3. Productie van OT-II / Rode Muizen
- Cross een man / vrouw OT-II muis met een vrouwelijke / mannelijke muizen tot expressie rood fluorescerend eiwit (beide stammen in de handel verkrijgbaar) om de OT-II / Red 37 muizen te genereren.
4. Spleen Cell Isolation
- Euthanize de OT-II / Red muizen door cervicale dislocatie na verdoving door inhalatie van elke gehalogeneerde ether (tot 5% voor inductie) commercieel verkrijgbaar.
- Knip met een schaar de linker superieure buikgedeelte van de muis gesneden. Op grond van deze abdominale deel is er de milt (ovale vorm met een donker-rode kleur). Gebruik een schaar en pincet om het te verwijderen.
- Pak de milt van de OT-II / Red muizen en doorgeven door een 100um zeef cel geplaatst op een 50 ml buis met behulp van de zuiger van een 1 ml spuit teneinde een enkel celsuspensie te verkrijgen. Was het filter tweemaal met 10 ml PBS aangevuld met 1% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS).
- Centrifugeer de celsuspensie bij 390 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet met 5 ml voorverwarmde lysisbuffer (144 mM NH4Cl, 17 mM Tris, pH = 7,2) om de rode bloedcellen te lyseren. Incubeer 10 min bij 37 ° C.
- Was het monster met 25 ml PBS aangevuld met 1% FBS. Centrifugeer bij 390 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in 10 ml PBS aangevuld met 1% FBS.
- Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min.
- Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Tellen cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 vierkantjes van één kamer en determine het gemiddeld aantal cellen per vierkante. Levensvatbare cellen lijken wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen te bepalen / ml aantal cellen te vermenigvuldigen met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten worden geteld, te delen door het aantal kwadranten.
5. CD4 + CD62 L + T Cell Verrijking
- Verrijken miltcellen voor CD4 + CD62L + T cellen via magnetische isolatie kit volgens de principes van negatieve of positieve selectie. Hier, Gebruik negatieve selectie aan CD4 + T-cellen te isoleren en te gebruiken positieve selectie verder te verrijken in de CD62L + populatie in de CD4 + T-cel pool.
Opmerking: In de negatieve selectieprocedure, de cellen, die niet geïsoleerd worden (hier: alle CD4 negatieve cellen) gelabeld met specifieke antilichamen gekoppeld aan magnetische microkralen. Tijdens de kolom wasstappen zullen de CD4 + T-cellen door de kolom passeren zodat ze kunnen worden easily verzameld. In de positieve selectieprocedure cellen geïsoleerd worden gelabeld zijn met geschikte antilichaam gekoppeld aan magnetische microkralen. Tijdens de kolom wasstappen de gemerkte cellen blijft in de kolom en ze kunnen worden verzameld door het verwijderen van de kolom uit het magnetische veld en spoelen met buffer. - Voor de negatieve selectieprocedure, resuspendeer 10 7 totale miltcellen in 40 ul koude PBS aangevuld met 0,5% runderserumalbumine (BSA). Voeg 10 ul met biotine gelabelde antilichaam cocktail met de magnetische isolatie kit (specifieke antilichamen die niet-CD4 + T-cellen) en incubeer 15 min op ijs.
- Voeg 30 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA en 20 pl anti-biotine microbolletjes. Incubeer 20 min op ijs.
- Voeg aan het monster 10 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA en centrifugeer bij 390 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap twee keer. Resuspendeer de cellen in 1 ml koude PBS aangevuld met 0,5% BSEEN.
- Plaats de kolom specifiek voor de negatieve selectieprocedure in het magnetische veld en spoelen met 3 ml koude PBS aangevuld met 0,5% BSA op de kolom. Voeg de celsuspensie op de kolom en was 3 maal met 3 ml koude PBS aangevuld met 0,5% BSA.
- Centrifugeer cellen van het effluent bij 390 xg gedurende 5 minuten. Effluent passeren door de kolom bevat ongelabelde CD4 + T-cellen. Resuspendeer de pellet in 1 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA en tel de cellen.
- Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min.
- Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Aantal cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 velden van de ene kamer en moet het gemiddelde aantal cellen per vierkant. Levensvatbare cellen lijken wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen / mL vermenigvuldigen cel bepalenl aantal met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten worden geteld, te delen door het aantal kwadranten.
- Voor de positieve selectieprocedure, voeg 10 ul van CD62L microkralen per 10 7 voorverrijkte CD4 + T celfractie. Incubeer 15 min op ijs.
- Voeg aan het monster 10 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA en centrifugeer bij 390 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap twee keer. Resuspendeer in 500 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA.
- Plaats de bepaalde kolom van de negatieve selectieprocedure in het magnetische veld en spoelen met 500 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA op de kolom. Voeg celsuspensie op de kolom en was 3 maal met 500 ul koud PBS aangevuld met 0,5% BSA.
- Verwijder de kolom uit het magnetische veld en plaats het op een geschikte collectie buis. Voeg 1 ml PBS aangevuld met 0,5% BSA op de kolom en spoel CD4 + CD62L + T cels vastgehouden in de kolom door stevig op de zuiger in de kolom.
OPMERKING: De geïsoleerde CD4 + CD62L + T cellen zijn nu klaar voor verdere toepassingen, zoals in vivo experimenten. Volgens de instructies van de fabrikant van de CD4 + CD62L + T cellen isolatiekit de microkralen niet toxisch. Vanwege de geringe omvang (ongeveer 50 nm), doen ze niet cellen te activeren en zij zullen niet te verzadigen celoppervlak epitopen. Dus de geïsoleerde cellen kunnen worden overgebracht in immunodeficiënte muizen colitis 37,44,45 induceren. - Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min.
- Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Aantal cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 velden van de ene kamer en moet het gemiddelde aantal cellen per vierkant. Levensvatbare cellen appear wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen te bepalen / ml aantal cellen te vermenigvuldigen met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten is berekend, delen door het aantal kwadranten.
6. Inductie van Antigen-driven Colitis
- Injecteren intraperitoneaal 3 x 10 5 OT-II / Red CD4 + CD62L + T cellen in CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - muizen. Voor inductie van antigenspecifieke colitis toedienen E. coli pCFP-OVA om de dag met een dosis van 1 x 10 8 kolonievormende eenheid (CFU) in 100 pl PBS per dier sonde of orale instillatie achter de snijtanden.
- Monitor tweemaal per week het lichaamsgewicht van getransplanteerde muizen en hun klinische toestand (aanwezigheid van bloed in de ontlasting, ontlasting en de activiteit van muizen).
7. Tissue Monsters voor histopathologisch onderzoek
- Neem weefselmonsters van the dikke darm van muizen, vast te stellen in neutraal gebufferde formaline (10%) en insluiten in paraffine zoals eerder beschreven 36,46.
- Section de paraffine monsters op een microtoom, monteren op dia's, en het uitvoeren van de H & E stain 47,48.
- Categoriseren de histologie van de dikke darm, zoals eerder 47,48 gepubliceerd: normaal (score 0); milde colitis (score 1), matige colitis (score 2) en ernstige colitis (score 3).
8. Isolatie van de dikke darm Lamina Propria Cells
- Euthanaseren getransplanteerde muizen door cervicale dislocatie na verdoving door inhalatie van elke gehalogeneerde ether (tot 5% voor inductie) commercieel verkrijgbaar.
- Plaats het dier af met de buik naar boven. Gebruik een tang om de huid naar voren te grijpen om de urethra opening. Gebruik schaar om het huidsnede langs de ventrale middellijn van de lies tot de borst. Trek de huid weer aan de zijkanten.
- Snijd door de doorzichtige peritoneale spierwand enopenstelling van de lichaamsholte. Identificeer de colon die gaat van de anus tot de blindedarm 49. Snijd de 2 extremiteiten en bevrijden van het weefsel van een vet.
- Open de colon langsrichting met een dissectie schaar. Gebruik een pincet om het darmweefsel schud in een petrischaal met 25 ml PBS aangevuld met 1% FBS om vuil en slijm te verwijderen. Snijd de dikke darm in 5-8 mm stuks.
- Plaats de colon segmenten in een 50 ml buis met 20 ml van de wasbuffer. The Wash buffer bevat 500 ml DPBS, 10 mM Hepes en 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA).
- Vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid.
- Incubeer de buis met het colon segmenten in een waterbad bij 37 ° C met 200 rpm schudden gedurende 10 minuten.
- Na de incubatie vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid.
- Gooi de supernatanten en plaats de weefselmonsters in een nieuwe 50 ml buis met 20 ml van de wasbuffer. Herhaal stappen 6-9 driemaal
- Gooi de supernatants en plaats de weefselmonsters in een petrischaal met 25 ml PBS. Gebruik een pincet om voorzichtig de weefselmonsters te schudden in de petrischaal gedurende enkele seconden om de resterende epitheliale cellen te verwijderen. Herhaal deze stap drie keer.
- Snijd colonic weefsels in 2 x 2 mm stukjes 2 en verteren door incubatie in 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium met 0,5 mg / ml collagenase type VIII van Clostridium histolyticum en 10 U / ml DNasel.
- Vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid.
- Incubeer de colon fragmenten in een waterbad bij 37 ° C met 200 rpm schudden gedurende 35 min en vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid om de 5 min.
- Aan het einde van de incubatie vortex de buis gedurende 30 seconden bij maximale snelheid.
- Verzamel de verkregen fragmenten met ze door een 70 um cel zeef geplaatst op een nieuwe 50 ml buis.
- Was het monster door het toevoegen van 20 ml DPBS en centrifugeer bij 400 g gedurende 5 minuten. Dan resuspendeer thij cellen in 1 ml van DPBS.
- Tel de cellen met behulp van een Neubauer telkamer. Mix 10 ul van de celsuspensie met 10 ul van een 0,4% trypan blauwe oplossing. Incubeer gedurende 1-2 min.
- Vul het hemocytometer kamer met 10 ul van gekleurde cellen. Aantal cellen onder de microscoop in vier 1 x 1 mm 2 velden van de ene kamer en moet het gemiddelde aantal cellen per vierkant. Levensvatbare cellen lijken wit, dode cellen blijken blauw. Om het aantal cellen te bepalen / ml aantal cellen te vermenigvuldigen met een factor van verdunning. Als 2-4 kwadranten worden geteld, te delen door het aantal kwadranten.
9. Extracellulaire kleuring voor FCM Analyse
- Centrifuge de CLP-cellen 5 min bij 390 x g. Resuspendeer de cellen in 1 ml FACS A (PBS aangevuld met 1% BSA en 0,1% natriumazide)
OPMERKING: Natriumazide is zeer giftig. Het kan hypotensie, hypothermie, hoofdpijn convulsies of de dood veroorzaken. Verdunde oplossing van natriumazide (00,1-1,0%) meestal niet bijzonder gevaar voor de gebruiker, maar zij zijn ogen en huid irriterend. Gebruik daarom natriumazide alleen in de chemische kap terwijl het dragen van een laboratorium jas en een dubbele paar disposable nitril handschoenen. - Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met het monoklonale antilichaam (mAb) tegen de 2.4G2 FcyRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 ug mAb / 10 6 cellen) verdund in FACS A.
- Voeg 200 ul FACS A aan de cellen en centrifugeer 5 min bij 390 x g. Herhaal deze stap twee keer. Incubeer de cellen met 0,5 ng / 10 6 cellen van de toepasselijke mAb gedurende 20 min bij 4 ° C. Verdun de antilichamen in FACS A.
- Voeg 200 ul FACS A aan de cellen en centrifugeer 5 min bij 390 x g. Herhaal deze stap twee keer. Resuspendeer de monsters in 100 ui FACS A.
- Analyseer T-cellen van CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - muizen gereconstitueerd met OT-II / Red CD4 T-cellen in de flowcytometer 37.
10. Confocale microscopie Analyse
- Analyseer de dikke darm van de CX 3 CR1 GFP / + muizen opgelost of niet met de OT-II / Red CD4 + CD62L + T-cellen en mondeling gevoerd om de dag met 1 x 10 8 CFU E. coli-stam DH10B pCFP-OVA.
- Verwijder het colon van muizen met een schaar en pincet. Openen lengterichting met een dissectie schaar.
- Knip een 5-8 mm stuk colon monster met behulp van een schaar, zet op glas dia's en dek af met dekglaasjes.
- Analyseer de colon monsters met een confocale microscoop bij een vergroting van 40 / 1,30.
- Detecteren de CX 3 CR1 + Kamerleden, gelabeld met groene fluoresceïne eiwit (GFP), met behulp van een filter set met excitatie bij 488 nm en emissie bij 509 nm.
- Detecteren van CD4 + T-cel die rood proteïne met een filter set met excitatie bij 554 nm en emissie bij 586 nm.
- Detecteren E.coli pCFP-OVA met een filter set met excitatie bij 450 nm en emissie bij 480 nm.
- Definieer een gebied van belang en het genereren van scatter diagrammen zoals eerder beschreven 50 de co-lokalisatie analyse uit te voeren. Gebruik 2 verschillende formules: de Overlap Coëfficiënt volgens Manders en de Pearson's coëfficiënt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een antigeen gedreven colitis model een E. vestigen coli stam is geconstrueerd dat een plasmide waarin het gen voor het GVB gefuseerd aan de coderende sequentie voor de kippen ovalbumine eiwit en het fusie-construct tot expressie wordt gebracht onder controle van de sterke constitutieve promoter P hyper (Figuur 1A) bevat. Fluorescentiemicroscopie toont dat de recombinante E. coli pCFP-OVA, maar niet de ouderlijke E. coli DH10B, uitdrukt GVB (Figuur 1B). GVB-OVA- producerende E. coli kan OT-II cellen in vitro te activeren en induceert IFN-γ productie in tegenstelling tot een E. coli stam die slechts CFP (figuur 2). Figuur 3A toont ex vivo 3D confocale beeldvorming van het dikke darmweefsel van CX 3 CR1 GFP / + muizen gevoed met E. coli pCFP-OVA. E. coli pCFP-OVA kangedetecteerd worden binnen het colon crypten dicht bij epitheliale cellen en intestinale co-lokaliseert met CX 3 CR1 + fagocyten. Om het relatieve aandeel van E. te bepalen coli pCFP-OVA geïnternaliseerd door gedefinieerd CX 3 CR1 + fagocyten, werden de blauwe en groene fluorescentie intensiteit bepaald door verstrooiing vlekken. Hierbij bleek dat 3 CX CR1 + cellen bemonsterd 11,9 ± 1,5% van E. coli pCFP-OVA gedetecteerd in de dikke darm (Figuur 3B). In OT-II / Red dieren, worden CD4 + T-cellen gekenmerkt door rode expressie en Vp 5,1 expressie aangetoond door flowcytometrie (Figuur 4). Figuur 5A toont een algemeen overzicht van het antigeen gedreven colitis model. OT-II / Red + CD4 + T CD62L + cellen werden adoptief overgebracht naar CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ontvangers die vervolgens werden gavaged elke tweede dag met E.coli pCFP-OVA. Bij provocatie met E. coli pCFP-OVA, overgedragen CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - muizen verliezen lichaamsgewicht en ontwikkelen klinische symptomen van colitis (figuur 5B) Figuur 6 toont ex vivo 3D confocale beeldvorming van dikke darmweefsel 7, 14 en 21 dagen na. reconstructie van heterozygote CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ontvangers met OT-II / Red + cellen uitgedaagd met E. coli pCFP-OVA. Zeven dagen na cel overdracht slechts een paar CX 3 CR1 + fagocyten proefden hebben E. coli pCFP-OVA en OT-II / Red + cellen werden niet gedetecteerd. Veertien dagen na de cel overdracht, CX 3 CR1 + fagocyten dat bemonsterd E. coli pCFP-OVA waren dicht bij OT-II / Red + cellen. Eenentwintig dagen na celoverdracht een groot aantal CX 3 CR1 + cellen die E. proefden coli pCFP-OVA en OT-II / Red + cellen, verspreid over de CLP in de nabijheid van Cx 3 CR1 + fagocyten.
Figuur 1: GVB-OVA-producerende E. coli. (A) Kaart van pCFP-OVA met relevante restrictieplaatsen, het gen dat codeert voor OVA en de heldere blauwe fluorescent eiwit GVB. (B) Helder veld en fluorescerende microscopische beelden van het wild-type E. coli DH10B E. coli DH10B pCFP en E. coli DH10B pCFP-OVA. Schaal bar:. 10 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: OT-II Cellen gestimuleerd met CFP-OVA produceren IFN-γ. Na isolatie van milt, OT-II cellen werden gestimuleerd met de aangegeven aantallen E. coli DH10B pCFP-OVA. Bacteriële cellen werden geïnactiveerd na 2 uur incubatie bij 5 ug / ml gentamicine. Na 72 h kweken werden de supernatanten verzameld en IFN-γ-concentraties bepaald met ELISA. De experimenten werden uitgevoerd in drievoud en data gepresenteerd als gemiddelde ± SEM uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: CX 3 CR1 + Fagocyten Sample E. coli pCFP-OVA. (A) CLP weefsel van CX 3 CR1GFP / + muizen gavaged met 1 x 10 8 E. coli pCFP-OVA gedurende 7 dagen en geanalyseerd door ex vivo confocale microscopie. Vergroting 40X / 1.30. Schaal bar = 30 micrometer. (B) Het percentage geïnternaliseerd E. coli pCFP-OVA gekwantificeerd en gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM. In de Mann-Whitney-test p <0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Karakterisering van OT-II / Red + CD4 + T-cellen (A) OT-II transgene dieren werden gekruist met dieren expressie de fluorescerende eiwit OT-II te verkrijgen / Red +cellen. OT-II / Red + cellen werden geïsoleerd uit milten van OT-II / Red transgene dieren, gekleurd voor CD4 en Vß5.1 en geanalyseerd door flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: OVA aangedreven Transfer Colitis (A) Schematische weergave van het antigeen gedreven colitis model.. OT-II / Red + CD4 + T CD62L + cellen werden adoptief overgebracht naar CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - muizen en gastheren waren gavaged elke tweede dag met E. coli pCFP-OVA. (B) Het lichaamsgewicht van de aangegeven groepen werd tweemaal per week gemeten. Gemiddelde ± SEM gewichtsverlies (%) behandeld. In de Mann-Whitney-testp <0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. CX 3 CR1 + MPs communiceren met OT-II cellen tijdens OVA gestuurde Transfer Colitis (A) colon weefselmonsters werden onderzocht door ex vivo 3D confocale beeldvorming op dag 7, 14 en 21 na de overdracht van OT-II / Red + CD4 + T CD62L + cellen in CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ontvangers. Vergroting 40X / 1.30. Schaal bar = 30 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Net als bij elk ander model, kan de antigeen gedreven colitis model hierboven beschreven enkele kwesties die de onderzoeker het uitvoeren van de techniek zich bewust van moet zijn te presenteren. Bij het injecteren van de OT-II / Red + CD4 + T CD62L + cellen in de gastheren, moet de onderzoeker zeer zacht en voorzichtig zijn om de naald in de buikholte. Doet u dit niet kan leiden tot het scheuren van de darm van de muis die kunnen leiden tot de dood, of een subcutane toediening van cellen die geen ziekte veroorzaken.
Typisch zal muizen gewichtstoename tijdens de eerste week na celoverdracht. De onderzoeker moet de muizen af te wegen op hetzelfde tijdstip bij elk gewicht tijdstip en maken gebruik van dezelfde weegschaal gedurende de gehele procedure. Soms de experimentele muizen, vooral wanneer het gewicht bij het begin van het experiment is dan 18 g, geen tekenen van het wasting syndroom ontwikkelen. Echter, deze dieren might nog te ontwikkelen belangrijke darmontsteking onder macroscopische evaluatie.
Bij het werken met genetisch gemodificeerde bacteriën, kan besmetting optreden. Om deze problemen is het sterk aan te raden om de E.coli tot expressie CFP-OVA met behulp van de fluorescentie microscoop om te analyseren of de bacteriën zijn fluorescerende en zijn staafvormige (de typische E.coli vorm) te controleren te voorkomen.
De voorgestelde antigeen-gedreven colitis gebaseerd op de waarneming dat CX 3 CR1 + MPs monster luminale commensale bacteriën in de stationaire toestand als tijdens ontstekingen 36,37. De inductie van T-cellen responsen in de antigeen gedreven colitis model aangetoond door het hooggeactiveerde fenotype van OT-II CD4 + T-cellen van de darmen van CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - muizen blootgesteld aan het antigeen, in vergelijking met de T-cellen geïsoleerd uit de CX 3 CR1 GFP / + x RAG
Confocale beeldvorming doet vermoeden dat CX 3 CR1 + fagocyten in de buurt liggen van het darmepitheel, zodat ze E. kunt proeven coli pCFP-OVA en interactie met OT-II / Red + CD4 + T-cellen. Na CX 3 CR1 + fagocyten proefden hebben E. coli pCFP-OVA de luminale antigeen wordt aan de CD103 + dendritische cellen (DC's) geleverd door CX 3 CR1 + fagocyten. CD103 + DCs kunnen migreren naar de mesenterische lymfeklier (MLN) tot prime T-cellen CD4 37,52. Geprimede T-cellen te assembleren in de CLP-waar de CX 3 CR1 + fagocyten tonen de OVA antigen tot effector T-cellen om ontsteking te induceren. De levering en de presentatie van het antigeen door CX 3 CR1 + fagocyten kan een belangrijke gebeurtenis in de ontwikkeling van colitis zijn.
De mogelijkheid om colitis te induceren met een bepaalde bacterie tot expressie een specifiek antigeen biedt de mogelijkheid om de noodzakelijke voorwaarden voor de ontwikkeling van colitis 24 bestuderen. Dit model toont aan dat een specifieke reactie op een antigeen peptide (OVA door E. coli tot expressie gebracht) voldoende om darmontsteking induceren in RAG - / - hosts, wat suggereert dat T-cellen kunnen reageren op specifieke antigeen van de intestinale microflora. Een antigeen kan één darmontsteking induceren in diermodellen, maar kan niet worden aangenomen dat enkele antigenen zijn de oorzaak van menselijke IBD. Bovendien, bij de overdracht colitis model is er naïeve CD4 + T-cellen die onbekende specificiteit en daarom kan reactief meervoudig zijn, als nog niet geïdentificeerde antigenen vande microbiota. Grote analyses en studies nodig om de rol van een specifiek antigen in de pathogenese van mucosale inflammatie te verduidelijken.
In de laatste jaren het gebruik van verschillende modellen van colitis heeft geleid tot een uitbreiding van de kennis over de pathogenese van IBD 53. Vanwege de complexiteit en de pathogenese van de ziekte, is er geen definitieve behandeling 54. Met het beschreven model, is het mogelijk om verschillende aspecten van IBD die niet goed nog worden opgehelderd, zoals (i) interacties tussen monocyten en dendritische cellen richten, (ii) migratie van intestinale DCs de MLN, (iii) antigeenpresentatie, (iv) homing van effector T-cellen van MLN de lamina propria en (v) activering van effector T-cellen in de lamina propria door CX 3 CR1 + fagocyten. Echter, verder onderzoek nodig om te bevestigen dat de CX 3 CR1 fagocyt + / CD4 + T-cel interactie een sleutelrol speelt inde IBD pathogenese. Muizen kunnen niet echt representatief voor de mens te zijn en dit moet rekening worden gehouden wanneer de muis modellen worden gebruikt om te studeren menselijke IBD 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan | ||
| DNase I recombinant | 4536282001 |
References
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
- Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
- Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
- Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
- Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
- Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
- Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111 (2011).
- Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
- Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
- Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
- Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
- Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
- Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
- Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
- Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
- Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
- Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
- Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
- Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
- Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
- Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
- Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
- van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
- Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
- Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
- Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
- Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
- Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
- Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
- Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
- Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
- Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
- Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
- Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
- Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
- Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
- Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
- Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
- Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
- Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
- Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
- Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404 (2012).
- Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).
