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Immunology and Infection

Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l'antigene alle cellule T

doi: 10.3791/54421 Published: September 18, 2016

Introduction

L'intestino è il più grande superficie del corpo che è esposto all'ambiente esterno. array Vaste di microbi residenti colonizzano l'intestino umano per formare il microbiota intestinale (o microflora). Questo è stimato a contenere fino a 100 trilioni di cellule microbiche e costituisce uno degli habitat batteriche più densamente popolate noti in biologia 1-3. Nel GIT batteri colonizzare una nicchia intestinale dove sopravvivono e si moltiplicano 4. In cambio, il microbiota dota l'host con l'aggiunta di caratteristiche funzionali non codificati sul suo genoma 1. Ad esempio il microbiota stimola la proliferazione delle cellule epiteliali, produce vitamine che ospita non possono produrre da soli, regola il metabolismo e protegge contro gli agenti patogeni 4-6. Dato questo rapporto vantaggioso, alcuni autori hanno suggerito che gli esseri umani sono "super-organismi" o "holobionts" che sono un mix di batteri e umane geni 7,8. Dato l'impatto positivo del microbiota sull'host (umana), il sistema immunitario intestinale deve tollerare microbi commensali per consentire la loro esistenza nel lume, ma anche uccidere gli agenti patogeni che invadono dal lato luminale 9-11. Il sistema immunitario intestinale ha messo a punto meccanismi per distinguere tra microbi luminali innocui e potenzialmente nocivi; tuttavia questi meccanismi non sono ancora ben compresi 12. Mantenere l'integrità intestinale richiede un omeostasi immunitaria strettamente regolata per mantenere l'equilibrio tra tolleranza e immunità 13. Uno squilibrio nella omeostasi immunitaria contribuisce alla induzione di malattie intestinali come la malattia infiammatoria intestinale (IBD) 3,14.

Ci sono due principali tipi di IBD: malattia di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC). I pazienti affetti da queste malattie in genere soffrono di sanguinamento rettale, diarrea grave e dolore addominale 15,16. La singola causa di IBD è ancorasconosciuta, ma una combinazione di fattori genetici, influenze ambientali e le risposte immunitarie sregolati potrebbe essere l'evento chiave per lo sviluppo della malattia 15.

Modelli animali per IBD sono stati utilizzati da oltre 50 anni. Negli ultimi decenni sono stati sviluppati nuovi sistemi modello IBD per testare le varie ipotesi riguardanti la patogenesi delle IBD 17,18. Il modello più caratterizzato di colite cronica è il modello di trasferimento di cellule T che induce rottura dell'omeostasi delle cellule T 19,20. Questo modello prevede il trasferimento di cellule T naive da topi immunocompetenti in host che mancano T e cellule B (come RAG - / - e topi SCID) 16,21. Lo sviluppo della malattia in questo modello è monitorato per 3-10 settimane valutando la presenza di diarrea, ridotta attività fisica, e perdita di peso corporeo. Questo si chiama così la sindrome da deperimento 16. Rispetto al topi sani i tessuti del colon degli eserciti trapiantati è Thicker, più corto e più pesante 16. Utilizzando il modello di trasferimento di cellule T, è possibile comprendere come differenti popolazioni di cellule T possono contribuire alla patogenesi delle IBD 22. Il modello di trasferimento di cellule T non analizza le interazioni tra APC e cellule T nel processo della malattia in modo antigene-specifica. È stato dimostrato che una interazione tra cellule mieloidi e cellule linfoidi potrebbe essere responsabile per lo sviluppo di infiammazione intestinale 23. Anche se molti aspetti della IBD sono stati chiariti, gli eventi iniziali che portano allo sviluppo della malattia devono ancora essere ben compreso.

È stato dimostrato che, in assenza del trasferimento microbioti colite non può essere stabilita 24. Recentemente, diverse teorie suggeriscono che IBD potrebbe essere il risultato di una risposta immunitaria contro batteri commensali 25. Gli autori hanno anche proposto che batteri commensali sono essenziali per indurre infiammazione nell'intestino distale26. In assenza di germi (GF) animali il sistema immunitario intestinale è generalmente compromessa 27,28, ma una colonizzazione di questi topi con una miscela di connessione specifici patogeni batteri risultati nello sviluppo della completamente competente sistema immunitario intestinale 29. Quindi, il microbioti sembra essere un elemento chiave nella patogenesi delle IBD, sia come meccanismo che predispone o protegge contro lo sviluppo di infiammazione intestinale 30,31. Teorie attuali suggeriscono che IBD è il risultato di uno squilibrio microbico, chiamato disbiosi, in pazienti geneticamente predisposti 32, ma non è ancora chiaro se il disbiosi è la causa o la conseguenza della malattia 12. Considerando il ruolo dei microrganismi nello sviluppo di IBD, esperimenti in vitro hanno dimostrato che le cellule T CD4 + possono essere attivati ​​da APC pulsate con batteri intestinali 33,34.

Inoltre, è stato dimostrato che gli antigeni dadiverse specie batteriche commensali, come E. coli, Bacteroides, Eubacterium e Proteus, sono in grado di attivare le cellule T CD4 + 35. Ciò indica che la presentazione di antigeni batterici a cellule T è di importanza per lo sviluppo delle IBD. Per ridurre la complessità di molteplici antigeni derivati ​​dalla microflora nel processo di malattia, un ceppo di E.coli è stato creato che produce l'antigene OVA. Trasferimento colite è stata indotta iniettando cellule T OVA-specifici in RAG - / - animali colonizzato con OVA esprimono E. coli.

Questo modello si basa su recenti prove che suggeriscono che CX 3 CR1 + parlamentari, un importante sottoinsieme di cellule nel colon lamina propria (CLP) 36, interagiscono con le cellule T CD4 + durante il trasferimento colite 37. Parlamentari campione lume intestinale per l'antigene di particelle, come i batteri, usando i loro dendriti 36, 38,39. Studi precedentidimostrato che mp può anche assumere antigeni solubili, come OVA, introdotti nel intestinale lume 40,41. Data l'abbondanza di CX 3 CR1 + parlamentari nel CLP, è possibile che queste cellule possono assaggiare i batteri luminali e interagire con le cellule T CD4. Confocale di topi trapiantati con cellule specifiche per OVA T CD4 + colonizzati con E. coli CFP-OVA, dimostrano che CX 3 CR1 + mp sono in contatto con cella OT-II + T CD4 durante lo sviluppo di colite antigene-indotta. Questo modello permette lo studio del processo di presentazione dell'antigene tra APC intestinali e linfociti T specifici solo per particolari batteri antigene esprimendo nel lume intestinale.

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Protocol

I topi sono stati allevati e tenuti sotto specifici (SPF) condizioni di assenza di patogeni nella struttura animale della Università di Ulm (Ulm, Germania). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida di utilizzo degli animali locali e il comitato cura e la legge nazionale sul benessere degli animali.

1. Costruzione del PCFP-OVA plasmidi

  1. Amplificare il gene full size OVA utilizzando il primer Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') e Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 utilizzando plasmide PCI-OVA (resistente ampicillina) 42 come modello. Clonare il prodotto della PCR (cioè la sequenza codificante OVA) in un fago metà vettore disponibile commercialmente con SpeI e Clai restrizioni siti dei primer e vettoriale per produrre la specifica OVA-plasmide.
  2. Amplificare il gene CFP-codifica insieme al forte promotore costitutivo P iper utilizzando plasmide Pad 1 43 come modello e primer CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') e CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. Clonare il gene CFP-codifica nella specifica OVA-plasmide (resistente ampicillina) utilizzando i siti di restrizione Spei e SACI dei primer e vettore 37. Questo introduce un distanziatore di 6 residui di glicina tra la PCP-codifica da sequenza di OVA-codifica.

2. Costruzione di E.coli PCFP-OVA

  1. Grow E.coli ceppo DH10B in 100 ml di Luria Bertani (LB) medium aerobicamente a 37 ° C su shaker rotativo durante la notte.
  2. Mescolare 800 ml di coltura batterica con 200 ml di glicerolo per creare stock di glicerolo e conservare a -80 ° C.
  3. Aggiungere 50 ml di E. coli ceppo DH10B da stock di glicerolo in 5 ml di terreno LB e farle crescere in condizioni aerobiche a 37 ° C su un agitatore rotante overnight.
  4. Trasferire la cultura in un pallone da 1 L confuso Erlenmeyer con 250 ml di terreno LB a 37 ° C in un frullato rotativo.
  5. Grow batteri ad una densità ottica a 600 nm (OD 600) di 0,5 e quindi raffreddare la coltura in ghiaccio per 30 min. Centrifugare i batteri a 5.000 xg per 10 min a 4 ° C.
  6. Batteri Risospendere con 100 ml di ghiaccio freddo H 2 O sterile e centrifugare i batteri a 5.000 xg per 10 min a 4 ° C. Risospendere batteri con 100 ml di ghiacciata 10% glicerolo e centrifugare i batteri a 5.000 xg per 10 min a 4 ° C. Ripetere questo ultimo passaggio per due volte.
  7. Dopo la fase di lavaggio finale, risospendere i batteri in 700 ml di glicerolo al 10%. Congelare aliquote di 50 microlitri in azoto liquido e conservare a -80 ° C.
  8. Scongelare una aliquota di 50 microlitri su ghiaccio e il trasferimento in una cuvetta elettroporazione pre-raffreddata (2 mm la distanza degli elettrodi).
  9. Aggiungere 5 ml di DNA plasmidico (100 ng) a 50 microlitri E. coli aliquots. Eseguire elettroporazione con un singolo impulso a 25 mF, 200 ohm (Ω) e 2,5 kV.
  10. batteri risospendere in 1 ml di pre-riscaldato mezzo SOC (5 g / L di estratto di lievito, 2 g / L triptone, cloruro di sodio 10 mM, cloruro di potassio 2,5 mM, 10 mM cloruro di magnesio, 10 mM di solfato di magnesio) e incubare a 37 ° C aerobico per 1 ora.
  11. batteri piastra su piastre di LB-agar integrato con ampicillina 100 mg / ml (aggiungere 100 ml di una / ml di ampicillina 100 mg per 100 ml di LB-agar) ed incubare una notte in condizioni aerobiche a 37 ° C.
  12. Scegliere singole colonie e li ri-striscia in piastre di LB-agar integrato con ampicillina 100 mg / ml. Incubare per una notte in condizioni aerobiche a 37 ° C.
  13. Scegliere singole colonie e farle crescere durante la notte in 10 ml di media LB integrato con ampicillina 100 mg / ml per l'isolamento plasmide. Utilizzare disponibili in commercio mini kit di preparazione plasmide ed eluire il DNA plasmide con 30 microlitri dH 2 O (acqua distillata) secondo il fornitore '; S protocollo. Verificare plasmidi mediante analisi di restrizione e sequenziamento del DNA 37,42,43.
  14. Impostare una cultura di cloni positivi di E. coli PCFP-OVA in 100 ml di terreno LB integrato con ampicillina 100 mg / ml. Grow aerobicamente a 37 ° C su un agitatore rotante durante la notte.
  15. Mescolare 800 ml di coltura batterica con 200 ml di glicerolo puro e conservare a -80 ° C.
  16. Centrifugare il resto della coltura overnight a 5.000 xg per 10 min a temperatura ambiente (RT) e risospendere il pellet in tampone fosfato (PBS). Mettere 10 ml di sospensione sul vetrino e coprire con un vetrino.
  17. Osservare i campioni in un microscopio a fluorescenza per confermare la fluorescenza espressione di CFP-OVA (PCP eccitazione a 450 nm, emissione a 480 nm). Analizzare i batteri iniziano con ingrandimento 400X.
  18. Centrifuga 1 ml di batteri provenienti da culture durante la notte a 5.000 xg per 10 min, RT. Risospendere il pellet in 40 ml diPBS e far bollire a 95 ° C per 10 min.
  19. Centrifugare i campioni a 30.000 xg per 10 min e utilizzare i supernatanti per l'analisi Western blot 37. Usare l'anti-OVA anticorpo policlonale di coniglio-raise diluito 1: 400.

3. Generazione di OT-II / Mouse rosso

  1. Attraversate un / femminile del mouse OT-II maschio con una femmina / topo maschio esprimendo la proteina fluorescente rossa (entrambi i ceppi disponibile in commercio) per generare i topi OT-II / Red 37.

Isolamento delle cellule 4. Milza

  1. Euthanize OT-II / topi Red per dislocazione cervicale dopo anestesia per inalazione di qualsiasi etere alogenati (fino al 5% per l'induzione) disponibile in commercio.
  2. Usare le forbici per tagliare la parte addominale superiore sinistro del mouse. Nell'ambito di questa parte addominale c'è la milza (forma ovale con un colore rosso scuro). Usare le forbici e pinzette per rimuoverlo.
    1. Estrarre la milza dei topi / Red OT-II e farla passare attraverso un 100colino cella micron posizionato su un tubo da 50 ml usando lo stantuffo di una siringa da 1 ml per ottenere una sospensione singola cellula. Lavare il filtro due volte con 10 ml di PBS integrato con 1% di calore siero fetale bovino inattivato (FBS).
  3. Centrifugare la sospensione cellulare a 390 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet con 5 ml di tampone di pre-riscaldato lisi (144 mM NH 4 Cl, 17 mM Tris, pH = 7,2) per lisare i globuli rossi. Incubare 10 minuti a 37 ° C.
  4. Lavare il campione con 25 ml di PBS integrato con 1% FBS. Centrifugare a 390 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 10 ml di PBS integrato con 1% FBS.
  5. Contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Mescolare 10 ml di sospensione di cellule con 10 ml di una soluzione Trypan Blue 0,4%. Incubare per 1-2 min.
    1. Riempire la camera emocitometro con 10 ml di cellule colorate. Contare le cellule sotto il microscopio in quattro 1 x 1 mm 2 piazze di una camera e determinvia e il numero medio di cellule per quadrato. cellule vitali appaiono bianchi, le cellule morte appaiono blu. Per determinare il numero di cellule / ml moltiplicare il numero di cellule per il fattore di diluizione. Se 2-4 quadranti vengono contati, dividere per il numero di quadranti.

5. CD4 + CD62 + T L cellulare arricchimento

  1. Arricchisci cellule della milza per le cellule T CD4 + + CD62L tramite kit di isolamento magnetico utilizzando i principi di selezione negativa o positiva. Qui, usare selezione negativa per isolare le cellule T CD4 + e utilizzare la selezione positiva per arricchire ulteriormente la CD62L + popolazione all'interno del pool di cellule T CD4 +.
    NOTA: Nella procedura di selezione negativa, le cellule, che non isolabili (qui: tutte le cellule CD4 negative) sono etichettati con anticorpi specifici accoppiati con microsfere magnetiche. Durante i passaggi di lavaggio colonna di cellule T CD4 + passeranno attraverso la colonna in modo che possano essere easily raccolto. Nelle cellule procedura di selezione positive essere isolati sono etichettati con l'anticorpo appropriato accoppiato con microsfere magnetiche. Durante i passaggi il lavaggio della colonna le cellule marcate rimarranno nella colonna e possono essere raccolte rimuovendo la colonna dal campo magnetico e risciacquo con il tampone.
  2. Per la procedura di selezione negativa, risospendere 10 7 cellule totali milza in 40 ml di PBS freddo integrata con albumina 0,5% di siero bovino (BSA). Aggiungere 10 ml di biotina cocktail di anticorpi fornito con il kit di isolamento magnetica (anticorpi specifici che legano le cellule T non CD4) e incubare 15 min in ghiaccio.
    1. Aggiungere 30 ml di PBS freddo integrati con 0,5% di BSA e 20 ml di microsfere anti-biotina. Incubare 20 min in ghiaccio.
    2. Aggiungere al campione 10 ml di PBS integrato con 0,5% BSA e centrifugare a 390 xg per 5 min. Ripetere questa operazione due volte. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS freddo integrato con 0,5% BSUN.
    3. Posizionare la colonna specifica per la procedura di selezione negativa nel campo magnetico e risciacquare con 3 ml di PBS freddo integrato con 0,5% BSA sulla colonna. Aggiungere la sospensione cellulare nella colonna e lavare 3 volte con 3 ml di PBS freddo completato con 0,5% BSA.
    4. Centrifugare le cellule dell'effluente a 390 xg per 5 min. Passaggio effluente attraverso la colonna contiene cellule T CD4 + senza etichetta. Risospendere il pellet in 1 ml di PBS integrato con 0,5% BSA e contare le cellule.
    5. Contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Mescolare 10 ml di sospensione di cellule con 10 ml di una soluzione Trypan Blue 0,4%. Incubare per 1-2 min.
      1. Riempire la camera emocitometro con 10 ml di cellule colorate. Contare le cellule sotto il microscopio in quattro 1 x 1 mm 2 piazze di una camera e di determinare il numero medio di cellule per quadrato. cellule vitali appaiono bianchi, le cellule morte appaiono blu. Per determinare il numero di cellule / ml moltiplicare cell numero per il fattore di diluizione. Se 2-4 quadranti vengono contati, dividere per il numero di quadranti.
  3. Per la procedura di selezione positiva, aggiungere 10 ml di microsfere CD62L per 10 7 frazione pre-arricchito di cellule T CD4 +. Incubare 15 min in ghiaccio.
    1. Aggiungere al campione 10 ml di PBS integrato con 0,5% BSA e centrifugare a 390 xg per 5 min. Ripetere questa operazione due volte. Risospendere in 500 ml di PBS freddo integrato con 0,5% di BSA.
    2. Posizionare la colonna specifica per la procedura di selezione negativa nel campo magnetico e risciacquare con 500 microlitri di PBS freddo integrato con 0,5% BSA sulla colonna. Aggiungere sospensione cellulare nella colonna e lavare 3 volte con 500 ml di PBS freddo completato con 0,5% BSA.
    3. Rimuovere la colonna dal campo magnetico e posizionarlo su un tubo di raccolta adeguato. Aggiungere 1 ml di PBS integrato con 0,5% BSA nella colonna e scovare cellule CD4 + T + CD62Ls trattenuto nella colonna spingendo con fermezza lo stantuffo nella colonna.
      NOTA: Le cellule T CD4 + + CD62L isolate sono ora pronti per le applicazioni a valle, come ad esempio gli esperimenti in vivo. Secondo le istruzioni del produttore del kit di isolamento delle cellule CD4 + T + CD62L, le microsfere non sono tossici. A causa delle piccole dimensioni (circa 50 nm), non attivano le cellule e non saranno saturare epitopi superficie cellulare. Quindi le cellule isolate possono essere trasferite in topi immunodeficienti per indurre colite 37,44,45.
    4. Contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Mescolare 10 ml di sospensione di cellule con 10 ml di una soluzione Trypan Blue 0,4%. Incubare per 1-2 min.
      1. Riempire la camera emocitometro con 10 ml di cellule colorate. Contare le cellule sotto il microscopio in quattro 1 x 1 mm 2 piazze di una camera e di determinare il numero medio di cellule per quadrato. cellule vitali appear bianchi, le cellule morte appaiono blu. Per determinare il numero di cellule / ml moltiplicare il numero di cellule per il fattore di diluizione. Se 2 - 4 quadranti vengono contati, dividere per il numero di quadranti.

6. Induzione della colite Antigen-driven

  1. Iniettare via intraperitoneale 3 x 10 5 cellule T OT-II / Red CD4 + CD62L in CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mice. Per l'induzione della colite antigene-specifica, amministrare E. coli PCFP-OVA ogni secondo giorno alla dose di 1 x 10 8 unità formanti colonie (CFU) in 100 ml di PBS per animale con sonda gastrica o instillazione orale dietro gli incisivi.
  2. Monitorare bisettimanale il peso corporeo dei topi trapiantati e la loro condizione clinica (presenza di sangue nelle feci, consistenza delle feci e l'attività dei topi).

7. I campioni di tessuto per l'esame istopatologico

  1. Prelevare campioni di tessuto da the grande intestino di topi, fissare in formalina neutra tamponata (10%) e incorporare in paraffina come descritto in precedenza 36,46.
  2. Sezione i campioni di paraffina su un microtomo, montare su vetrini, ed eseguire la H & E macchia 47,48.
  3. Categorizzare l'istologia dell'intestino crasso, come pubblicato in precedenza 47,48: normale (punteggio 0); colite lieve (punteggio 1), la colite moderata (punteggio 2) e colite grave (punteggio 3).

8. Isolamento di cellule del colon lamina propria

  1. Euthanize topi trapiantati per dislocazione cervicale dopo anestesia per inalazione di qualsiasi etere alogenati (fino al 5% per l'induzione) disponibile in commercio.
  2. Posto l'animale verso il basso con la pancia rivolta verso l'alto. Utilizzare pinze per afferrare la pelle anteriormente all'apertura uretrale. Usare le forbici per tagliare la pelle lungo la linea mediana ventrale dall'inguine al petto. Tirare la pelle indietro sui lati.
  3. Tagliare attraverso la parete muscolare peritoneale e trasparenteaprendo la cavità del corpo. Identificare i due punti che va dall'ano al cieco 49. Tagliare le 2 estremità e liberare il tessuto da qualsiasi grasso.
  4. Aprire il colon longitudinalmente con una dissezione forbici. Utilizzare una pinzetta per scuotere il tessuto del colon in una capsula di Petri contenente 25 ml di PBS integrato con 1% FBS per rimuovere i detriti e mucose. Tagliare i due punti in 5 - 8 pezzi mm.
  5. Posizionare i segmenti del colon in un tubo da 50 ml contenente 20 ml di tampone di lavaggio. Il tampone di lavaggio contiene 500 ml DPBS, 10mm Hepes e acido etilendiamminotetraacetico 5mm (EDTA).
  6. Agitare il tubo per 30 secondi a velocità massima.
  7. Incubare la provetta con i segmenti del colon in un bagno d'acqua a 37 ° C con 200 rpm agitazione per 10 min.
  8. Dopo l'incubazione, vortexare la provetta per 30 secondi a velocità massima.
  9. Eliminare il surnatante e posizionare i campioni di tessuto in un nuovo tubo da 50 ml contenente 20 ml di tampone di lavaggio. Ripetere i passaggi 6-9 tre volte
  10. Eliminare le supernatants e posizionare i campioni di tessuto in una capsula di Petri contenente 25 ml di PBS. Utilizzare una pinzetta per scuotere delicatamente i campioni di tessuto nella capsula di Petri per alcuni secondi per rimuovere le cellule epiteliali residue. Ripetere questa operazione tre volte.
  11. Tagliare tessuti del colon in 2 x 2 mm 2 pezzi e digerire mediante incubazione in 10 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium con 0,5 mg / ml collagenasi di tipo VIII da Clostridium histolyticum e 10 U / ml di DNasiI.
  12. Agitare il tubo per 30 secondi a velocità massima.
  13. Incubare i frammenti del colon in un bagno d'acqua a 37 ° C con 200 rpm agitazione per 35 minuti e agitare la provetta per 30 sec a velocità massima ogni 5 min.
  14. Al termine dell'incubazione vortex la provetta per 30 sec a velocità massima.
  15. Raccogliere i frammenti digeriti facendoli passare attraverso un filtro cella 70 micron posizionato su un nuovo tubo 50 ml.
  16. Lavare il campione aggiungendo 20 ml di DPBS e centrifugare a 400 g per 5 min. Poi risospendere tlui cellule in 1 ml di DPBS.
  17. Contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Mescolare 10 ml di sospensione di cellule con 10 ml di una soluzione Trypan Blue 0,4%. Incubare per 1-2 min.
    1. Riempire la camera emocitometro con 10 ml di cellule colorate. Contare le cellule sotto il microscopio in quattro 1 x 1 mm 2 piazze di una camera e di determinare il numero medio di cellule per quadrato. cellule vitali appaiono bianchi, le cellule morte appaiono blu. Per determinare il numero di cellule / ml moltiplicare il numero di cellule per il fattore di diluizione. Se 2-4 quadranti vengono contati, dividere per il numero di quadranti.

9. La colorazione extracellulare per l'analisi FCM

  1. Centrifugare il CLP cellule 5 min a 390 x g. Risospendere le cellule in 1 ml di FACS A (PBS integrato con 1% BSA e 0,1% sodio azide)
    NOTA: Il sodio azide è altamente tossico. Può causare ipotensione, ipotermia, convulsioni mal di testa o la morte. Diluire le soluzioni di sodio azide (0.1 1,0%) di solito non presentare pericoli straordinari per l'utente, ma sono occhi e alla pelle irritanti. Pertanto, utilizzare sodio azide solo nella cappa chimica mentre indossa un camice da laboratorio e un doppio paio di guanti di nitrile usa e getta.
  2. Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente con l'anticorpo monoclonale (mAb) 2.4G2 diretto contro la FcγRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 mg mAb / 10 6 cellule) diluito in FACS A.
  3. Aggiungere 200 ml di FACS A nelle cellule e centrifugare 5 min a 390 x g. Ripetere questa operazione due volte. Incubare le cellule con 0,5 ng / 10 6 cellule del relativo mAb per 20 minuti a 4 ° C. Diluire gli anticorpi in FACS A.
  4. Aggiungere 200 ml di FACS A nelle cellule e centrifugare 5 min a 390 x g. Ripetere questa operazione due volte. Risospendere i campioni in 100 ml di FACS A.
  5. Analizzare le cellule T da CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mice ricostituiti con cellule CD4 Red T al citofluorimetro 37 OT-II /.

Analisi 10. Microscopia confocale

  1. Analizzare i due punti di CX 3 CR1 GFP / + topi ricostituiti o meno con OT-II / cellule Red CD4 + T + CD62L e nutriti per via orale ogni due giorni con 1 x 10 8 UFC di E. coli ceppo DH10B PCFP-OVA.
  2. Rimuovere i due punti dai topi con le forbici e pinzette. Aprire longitudinalmente con una dissezione forbici.
  3. Tagliare un pezzo 5-8 mm di campione del colon con le forbici, mettere su vetrini e coprire con coprioggetto.
  4. Analizzare i campioni colon con un microscopio confocale a un ingrandimento di 40 / 1.30.
  5. Rilevare la CX 3 CR1 + parlamentari, marcato con fluoresceina proteina verde (GFP), utilizzando un filtro impostato con eccitazione a 488 nm ed emissione a 509 nm.
  6. Rileva il cellule T CD4 + che esprimono la proteina rosso con un filtro impostato con eccitazione a 554 nm ed emissione a 586 nm.
  7. Rileva E.coli PCFP-OVA utilizzando un filtro impostato con eccitazione a 450 nm ed emissione a 480 nm.
  8. Definire una zona di interesse e generare diagrammi di dispersione come precedentemente descritto 50 per effettuare l'analisi co-localizzazione. Utilizzare 2 formule diverse: la sovrapposizione Coefficiente secondo le Manders e il coefficiente di Pearson.

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Representative Results

Per stabilire un modello di colite antigene-driven di E. coli è stato costruito che contiene un plasmide in cui il gene per la PCP è fusa alla sequenza codificante per la proteina di pollo ovalbumina e il costrutto di fusione è espresso sotto il controllo del promotore forte costitutivo P iper (Figura 1A). Microscopia fluorescente dimostra che il ricombinante E. coli PCFP-OVA, ma non il parentale E. coli DH10B, esprime CFP (Figura 1B). CFP-OVA- produzione E. coli è in grado di attivare le cellule OT-II in vitro e indurre la produzione di IFN-γ in contrasto con una E. coli ceppo esprimendo CFP solo (Figura 2). Figura 3A mostra ex vivo 3D confocale del tessuto del colon di CX 3 CR1 GFP / + topi alimentati con E. coli PCFP-OVA. E. coli PCFP-OVA puòessere rilevato all'interno cripte del colon situato vicino al intestinale cellule epiteliali e co-localizza con CX 3 CR1 + fagociti. Per determinare la proporzione relativa di E. coli PCFP-OVA interiorizzato da CX definito 3 CR1 + fagociti, l'intensità blu e verde fluorescenza sono stati determinati da macchie di dispersione. L'analisi ha rivelato che le cellule CX 3 CR1 + campionati 11,9 ± 1,5% di E. coli PCFP-OVA rilevato nel colon (Figura 3B). In OT-II / animali rossi, le cellule T CD4 + sono caratterizzati da espressione Rosso e Vβ 5.1 espressione dimostrato mediante citometria di flusso (Figura 4). La figura 5A mostra una panoramica generale delle il modello di colite dell'antigene guidato. Cellule OT-II / Rosso + CD4 + T + CD62L sono stati trasferiti in adoptively CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - i destinatari che sono stati poi gavaged ogni due giorni con E.coli PCFP-OVA. Quando provocati con E. coli PCFP-OVA, trasferito CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mice perdere peso corporeo e sviluppare segni clinici di colite (Figura 5B) figura 6 mostra ex vivo in 3D di imaging confocale di tessuto del colon 7, 14 e 21 giorni dopo. ricostituzione del CX eterozigoti 3 CR1 GFP / + x RAG - / - i destinatari con OT-II / rosso + cellule sfidato con E. coli PCFP-OVA. Sette giorni dopo il trasferimento di cellule solo pochi CX 3 CR1 + fagociti sono campionati E. coli PCFP-OVA e OT-II / cellule Rosso + non sono stati rilevati. Quattordici giorni dopo il trasferimento delle cellule, CX 3 CR1 + fagociti che campionati E. coli PCFP-OVA si trovavano vicino a OT-II cellule / rosso +. Ventuno giorni dopo la cella trasferire un numero elevato di CX 3 CR1 + cellule che sono campionati E. coli PCFP-OVA e OT-II / Rcellule ED +, dispersi in tutto il CLP in prossimità di Cx 3 CR1 + fagociti.

Figura 1
Figura 1: CFP-OVA Produrre E. coli. (A) Mappa PCFP-OVA con importanti siti di restrizione, il gene che codifica per OVA e il luminoso proteina fluorescente blu PCP. (B) campo chiaro e le immagini microscopiche a fluorescenza di tipo selvaggio E. coli DH10B, E. coli DH10B PCFP ed E. coli DH10B PCFP-OVA. Barra di scala:. 10 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: OTLe cellule stimolate con -II CFP-OVA Produrre IFN-γ. Dopo l'isolamento dalla milza, cellule OT-II sono state stimolate con i numeri indicati di E. coli DH10B PCFP-OVA. Le cellule batteriche sono stati inattivati ​​dopo 2 ore di incubazione con 5 mg / ml gentamicina. Dopo 72 ore di cultura, surnatanti sono stati raccolti e le concentrazioni di IFN-gamma determinati da ELISA. Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato ei dati presentati come media ± SEM. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: CX 3 CR1 + fagociti Esempio E. coli PCFP-OVA. (A) del tessuto CLP di CX 3 CR1GFP / + topi gavaged con 1 x 10 8 E. coli PCFP-OVA per 7 giorni e analizzati da ex vivo microscopia confocale. Ingrandimento 40X / 1.30. Barra di scala = 30 micron. (B) La percentuale di interiorizzato E. coli PCFP-OVA quantificato e dati presentati come media ± SEM. Nel test di Mann-Whitney p <0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Caratterizzazione di Red + CD4 + T Cells OT-II / (A) OT-II animali transgenici sono stati incrociati con gli animali che esprimono la proteina fluorescente rosso per ottenere OT-II / Rosso +cellule. OT-II / Globuli rossi + sono stati isolati dalla milza di OT-II / Red animali transgenici, macchiate per CD4 e Vß5.1 e analizzati mediante citometria di flusso. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Trasferimento OVA-driven ulcerosa (A) Rappresentazione schematica del modello di colite dell'antigene guidato.. Cellule OT-II / Rosso + CD4 + T + CD62L sono stati trasferiti in adoptively CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mice e padroni di casa erano gavaged ogni due giorni con E. coli PCFP-OVA. Peso (B) del corpo dei gruppi indicati stata misurata due volte a settimana. Media ± SEM perdita di peso corporeo (%) è presentato. Nel test di Mann-Whitneyp <0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6:. CX 3 CR1 + parlamentari Comunicare con cellule OT-II durante OVA-driven trasferimento Colite campioni di tessuto del colon (A) sono stati esaminati da ex vivo 3D confocale al giorno 7, 14 e 21 dopo il trasferimento di OT-II / Red + CD4 + T + CD62L cellule in CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - destinatari. Ingrandimento 40X / 1.30. Barra di scala = 30 micron.

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Discussion

Come per ogni altro modello, il modello di colite antigene-driven sopra descritto può presentare alcuni problemi che il ricercatore di eseguire la tecnica deve essere a conoscenza. Quando si somministra l'OT-II / cellule Rosso + CD4 + T + CD62L dei padroni di casa, l'investigatore deve essere molto dolce e attento a inserire l'ago nella cavità peritoneale. In caso contrario si può provocare la lacerazione della nell'intestino del topo che potrebbe portare alla morte, o una somministrazione sottocutanea di cellule che non inducono alcuna malattia.

In genere, i topi aumentano di peso durante la prima settimana dopo il trasferimento delle cellule. L'investigatore dovrebbe pesare i topi allo stesso tempo ad ogni tempo peso e utilizzare la stessa bilancia durante l'intera procedura. Talvolta i topi sperimentali, soprattutto quando il loro peso all'inizio dell'esperimento è inferiore a 18 g, non sviluppano segni della sindrome deperimento. Tuttavia, questi animali might ancora sviluppare significativa infiammazione intestinale in fase di valutazione macroscopica.

Quando si lavora con batteri geneticamente modificati, possono verificarsi contaminazioni. Per evitare questi problemi si consiglia vivamente di verificare la E.coli che esprime CFP-OVA utilizzando il microscopio a fluorescenza per analizzare se i batteri sono fluorescenti e sono a forma di bastoncello (la tipica forma E.coli).

La proposta di antigene-driven colite si basa sulla constatazione che CX 3 CR1 + parlamentari batteri campione commensale luminali in stato stazionario e durante condizioni infiammatorie 36,37. L'induzione di cellule T risposte nel modello di colite antigene-indotta è stata dimostrata dal fenotipo altamente attivata di cellule OT-II + T CD4 dai due punti di CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - topi stimolati con l'antigene, rispetto alle cellule T isolate da CX 3 CR1 GFP / + x RAG 37. Ciò è coerente con precedenti studi in cui, dopo il trasferimento adottivo di cellule OT-II T in RAG - / - mice, colite è stata indotta solo quando i padroni di casa si sono sfidati con OVA esprimono E. coli 51.

Confocale suggerisce che fagociti CX 3 CR1 + si trovano vicino al epitelio intestinale in modo che possano assaggiare E. coli PCFP-OVA e interagire con le cellule Rosso + T CD4 + OT-II /. Dopo fagociti CX 3 CR1 + sono campionati E. coli PCFP-OVA l'antigene del lume è consegnato alle cellule dendritiche CD103 + (DC) da CX 3 CR1 + fagociti. CD103 + DC sono in grado di migrare al linfonodo mesenterica (MLN) a cellule T CD4 primari 37,52. Le cellule T innescate assemblare in CLP in cui CX 3 CR1 + fagociti mostrano l'antigene OVA all'ele cellule T ffector per indurre l'infiammazione. La consegna e presentazione dell'antigene da CX 3 CR1 + fagociti potrebbe essere un evento chiave nello sviluppo della colite.

La capacità di indurre colite con un batterio che esprime definito un antigene specifico offre l'opportunità di studiare le condizioni necessarie per lo sviluppo di colite 24. Questo modello dimostra che una risposta specifica a un peptide antigenico (OVA espresso da E. coli) è sufficiente per indurre l'infiammazione intestinale in RAG - / - padroni di casa, il che suggerisce che le cellule T possono reagire per l'antigene specifico della microflora intestinale. Un singolo antigene può indurre infiammazione intestinale nei modelli animali, ma non si può presumere che singoli antigeni sono la causa di IBD umana. Inoltre, nel modello di colite trasferimento sono naive cellule T CD4 + che hanno Sconosciuto specificità e quindi può essere reattivi a molteplici, come di antigeni non ancora identificati, dalil microbiota. analisi Maggiore e studi sono necessari per chiarire meglio il ruolo di un antigene specifico nella patogenesi della infiammazione delle mucose.

Negli ultimi anni l'utilizzo di diversi modelli animali di colite ha portato ad un ampliamento della conoscenza della patogenesi delle IBD 53. Tuttavia, a causa della complessità e la patogenesi della malattia, non vi è una cura definitiva 54. Utilizzando il modello descritto, è possibile affrontare alcuni aspetti della IBD che non sono ancora ben chiariti, come (i) interazioni tra monociti e cellule dendritiche, (ii) la migrazione delle DC intestinale al MLN, (iii) presentazione dell'antigene, (iv) homing delle cellule T effettrici dal MLN a lamina propria e (v) l'attivazione di cellule T effettrici nella lamina propria da CX 3 CR1 + fagociti. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per confermare se il CX 3 CR1 + fagocita / interazione delle cellule T CD4 + gioca un ruolo chiave nellala patogenesi IBD. I topi non può essere veramente rappresentativo di esseri umani e questo deve essere tenuto presente quando i modelli del mouse sono utilizzati per studiare IBD umano 2.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 244620
Rotary Shake Reiss Laborbedarf e. K. Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes  Peqlab Biotechnologie GmbH 71-2020
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system  BioRad Laboratories GmbH 1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Difco 244510
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5G
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation Kit Roche 11754777001
Agarose Carl Roth GmbH & Co 3810.1
EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 537020 
Gel chamber  PEQLAB Biotechnology GmbH 40-0708
Loading Dye Thermo Fisher R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder  Thermo Fisher SM0312
Ethidium bromide solution Carl Roth GmbH & Co. KG 2218.3
Photo-documentation system  Decon Science Tech GmbH DeVision G 
DNA sequencing  MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS) Biochrom L182-50
Fluorescent microscope  Zeiss HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad Laboratories GmbH 1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue Solution Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane  Macherey-Nagel GmbH & Co. KG 741280
Electro blotter  Biometra GmbH 846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody  Abcam ab181688
Anti-rabbit IgG  HRP Sigma-Aldrich A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc 32132
Forene Abbott 2594.00.00
FBS Invitrogen 10500-064
Falcon Cell Strainers Fischer Scientific  08-771-2
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134-5G
Tris Base Sigma-Aldrich 10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit  Miltenyi Biotec 130-093-227 
MACS LS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Feeding Needle 20G SouthPointe Surgical Supply, Inc FN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128
Paraffin Sigma-Aldrich 1496904
Hematoxylin Sigma-Aldrich H9627
Eosin Y Sigma-Aldrich 230251 
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779 
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium AppliChem A2044, 9050
Sodium azide Sigma-Aldrich 438456
Mouse BD Fc Block BD Pharmingen 553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2  BD Pharmingen 553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5  eBioscience 17-0041-83
FACS Calibur  BD Biosciences
FCS Express V3 software DeNovo
Meta scanning confocal microscope  Zeiss LSM 710 
Zeiss Workstation Zeiss LSM 7
Zeiss ZEM software  Zeiss v4.2.0.121
Maxisorp immuno plates  NUNC, Roskilde 442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase Jackson Immuno Research 016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich 71768-5G
mAb R4-6A2 BD Biosciences 551216
mAb XMG1.2  BD Biosciences 554410
TECAN microplate-ELISA reader Tecan
EasyWin software Tecan
DNase I recombinant 4536282001

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Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l&#39;antigene alle cellule T
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Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).More

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