Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utvikling av en Antigen-drevet kolitt modell for å studere presentasjon av antigener ved hjelp av antigenpresenterende celler til T-celler

Published: September 18, 2016 doi: 10.3791/54421
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

Introduction

Tarmen er den største overflaten av kroppen som er utsatt for det ytre miljø. Enorme mengder av fastboende mikrober koloniserer tarmen til å danne tarmfloraen (eller mikroflora). Dette antas å bestå av opptil 100 billioner mikrobielle celler og utgjør en av de mest tettbefolkede bakterielle habitater er kjent innen biologi 1-3. I GIT bakterier kolonisere en intestinal nisje hvor de overleve og formere 4. Til gjengjeld endows microbiota verten med flere funksjonelle funksjoner som ikke er kodet på sitt genom en. For eksempel microbiota stimulerer spredning av epitelceller, produserer vitaminer som er vert ikke kan produsere av seg selv, regulerer stoffskiftet og beskytter mot patogener 4-6. Gitt dette gunstige forhold, har noen forfattere foreslått at mennesker er "super-organismer" eller "holobionts" som er en blanding av bakterielle og menneskelige gener 7,8. Gitt den fordelaktige virkningen av bakterieflora på den (menneskelige) vert, må tarmimmunsystemet til å tolerere kommensale mikroorganismer for å muliggjøre deres eksistens i lumen, men også drepe patogener som invaderer fra luminale side 9-11. Tarmimmunsystem har utviklet mekanismer for å skille mellom ufarlige og potensielt skadelige luminal mikrober; men disse mekanismene er ennå ikke godt forstått 12. Å opprettholde intestinal integritet krever et strengt regulert immun homeostase å holde balansen mellom toleranse og immunitet 13. En ubalanse i immun homeostase bidrar til induksjon av intestinale sykdommer slik som inflammatorisk tarmsykdom (IBD) 3,14.

Det er to hovedtyper av IBD: Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC). Pasienter med disse sykdommene vanligvis lider av rektal blødning, alvorlig diaré og magesmerter 15,16. Den eneste årsaken til IBD er fortsattukjent, men en kombinasjon av genetiske faktorer, miljøpåvirkninger og feilregulert immunresponser kan være nøkkelen begivenhet for sykdomsutvikling 15.

Dyremodeller for IBD har vært brukt i over 50 år. I de siste tiårene nye IBD modellsystemer er utviklet for å teste ulike hypoteser om patogenesen av IBD 17,18. Den best karakteriseres modell for kronisk kolitt er den T-celle-transfer modell som induserer avbrudd av T-celle-homeostase 19,20. Denne modellen involverer overføring av naive T-celler fra immunkompetente mus inn i verter som mangler T- og B-celler (for eksempel RAG - / - og SCID-mus) 16,21. Utviklingen av sykdommen i denne modellen blir overvåket av 3-10 uker, ved å evaluere nærværet av diaré, redusert fysisk aktivitet, og tap av kroppsvekt. Dette er såkalt avmagringssyndromet 16. Sammenlignet med friske musene colonic vev av transplanterte verter er Thicker, kortere og tyngre 16. Ved hjelp av T-celle-overføring modell, er det mulig å forstå hvordan ulike T-cellepopulasjoner kan bidra til patogenesen av IBD 22. T-celleoverføring modell analyserer ikke interaksjoner mellom APC og T-celler i sykdomsprosessen i en antigen-spesifikk måte. Det har vist seg at en interaksjon mellom myeloide celler og lymfoide celler kan være ansvarlig for utviklingen av tarmbetennelse 23. Selv om mange aspekter av IBD er klarlagt, de første hendelsene som fører til sykdomsutviklingen fortsatt trenger å bli forstått.

Det har vist seg at i fravær av bakterieflora overføring kolitt kan ikke bli etablert 24. Nylig har flere teorier foreslår at IBD kan være et resultat av en immunrespons mot kommensale bakterier 25. Forfatterne har også foreslått at commensal bakterier er viktig for å indusere betennelse i tarmen26. I bakterie frie (GF) dyr tarmimmunsystem er vanligvis svekket 27,28, men en kolonisering av disse mus med en blanding av spesifikt patogenfrie bakterier resulterer i utviklingen av fullt kompetente tarmimmunsystem 29. Derfor synes microbiota å være et sentralt element i patogenesen av IBD, enten som en mekanisme som predisponerer for eller beskytter mot utvikling av tarmbetennelse 30,31. Gjeldende teorier foreslår at IBD er et resultat av mikrobiell ubalanse, kalt dysbiosis, i genetisk disponerte pasienter 32, men det er ikke klart, men hvis dysbiosis er årsaken eller konsekvensen av sykdommen 12. Tatt i betraktning den rolle av mikroorganismer i utvikling av IBD, in vitro eksperimenter vist at CD4 + T-celler kan aktiveres ved APC pulsert med tarmbakterier 33,34.

Videre har det blitt vist at antigener fraforskjellige commensal bakterielle arter, for eksempel E. coli, Bacteroides, Eubacterium og Proteus, er i stand til å aktivere CD4 + T-celler 35. Dette indikerer at presentasjonen av bakterielle antigener til T-celler er viktig for utvikling av IBD. For å redusere kompleksiteten av flere antigener avledet ved mikrofloraen i sykdomsprosessen, har en E.coli-stamme er opprettet som produserer den OVA-antigenet. Overføring kolitt ble indusert ved injeksjon av OVA-spesifikke T-celler til RAG - / - dyr kolonisert med OVA-uttrykkende E. coli.

Denne modellen er basert på nyere bevis som tyder på at CX 3 CR1 + parlamentsmedlemmer, en stor celle undergruppe i colonic lamina propria (CLP) 36, er i samspill med CD4 + T-celler under overføring kolitt 37. Parlamentsmedlemmer prøve tarmlumen for partikkel antigen, som bakterier, ved hjelp av sine dendritter 36, 38,39. tidligere studiervist at MP'er kan også ta opp løselige antigener, slik som OVA, som innføres i intestinal lumen 40,41. Gitt overflod av CX 3 CR1 + parlamentsmedlemmer i CLP, er det mulig at disse cellene kan smake luminal bakterier og samhandle med CD4 T-celler. Konfokal avbildning av mus transplantert med OVA-spesifikke CD4 + T-celler kolonisert med E. coli CFP-OVA, viser at CX 3 CR1 + MP'er er i kontakt med OT-II CD4 + T-celle under utviklingen av antigen-drevne kolitt. Denne modellen gjør det mulig å studere den antigenpresentasjon prosessen mellom tarm APCer og T-celler spesifikke bare for bestemte antigen-uttrykkende bakterier i tarmkanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus ble avlet og holdt under patogenfrie (SPF) forhold i dyre innretningen av Ulm University (Ulm, Tyskland). Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjene i den lokale dyre bruk og behandling komiteen og National Animal Welfare Law.

1. Bygging av pCFP-OVA Plasmid

  1. Forsterke full størrelse OVA-genet ved bruk av primerne Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') og Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 ved hjelp av plasmidet pCI-OVA (ampicillin resistent) 42 som et templat. Klone PCR-produktet (dvs. den OVA-kodende sekvens) inn i en kommersielt tilgjengelig fag-mid-vektor ved hjelp av Spel og Clal restriksjoner områder av primere og vektoren for å gi den spesifikke OVA-plasmid.
  2. Forsterke CFP-koding genet sammen med den sterke konstitutive promoter P hyper hjelp plasmid PAD 1 43 som et templat og primere CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') og CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. Klone CFP-kodende gen i den spesifikke OVA-plasmid (ampicillin resistent) med Spel og SacI restriksjonsseter for primerne og vektor 37. Dette introduserer en spacer av 6 glysin rester mellom CFP-koding fra OVA-kodende sekvens.

2. Bygging av E.coli pCFP-OVA

  1. Dyrke E. coli-stamme DH10B i 100 ml Luria-Bertani (LB) medium aerobt ved 37 ° C på en roterende ristemaskin over natten.
  2. Bland 800 mL av bakteriekultur med 200 ul glyserol for å skape glyserol lager og butikk ved -80 ° C.
  3. Tilsett 50 pl av E. coli-stamme DH10B fra glyserol lager i 5 ml LB-medium og dyrke dem aerobt ved 37 ° C på en rotasjonsrister overnight.
  4. Overføre kulturen i et forvirret en L Erlenmeyer-kolbe med 250 ml LB-medium ved 37 ° C i en roterende riste.
  5. Dyrke bakterier til en optisk tetthet ved 600 nm (OD 600) på 0,5 og deretter kjøle kulturen på is i 30 min. Sentrifuger bakterier ved 5000 xg i 10 min ved 4 ° C.
  6. Resuspender bakterier med 100 ml iskald steril H2O og sentrifuger bakteriene ved 5000 xg i 10 minutter ved 4 ° C Resuspender bakterier med 100 ml iskald 10% glyserol og sentrifuger bakteriene ved 5000 xg i 10 min ved 4 ° C. Gjenta dette siste trinnet to ganger.
  7. Etter den siste vasketrinn, resuspender bakterier i 700 pl 10% glycerol. Freeze 50 ul porsjoner i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C.
  8. Tines en 50 ul alikvot på is og overføring til en på forhånd avkjølt elektroporering kuvette (2 mm elektrodeavstand).
  9. Tilsett 5 ul plasmid-DNA (100 ng) i 50 pl E. coli aliquots. Utføre elektroporasjon med en enkelt puls på 25 uF, 200 ohm (Ω) og 2,5 kV.
  10. Resuspender bakterier i 1 ml forvarmet SOC-medium (5 g / l gjærekstrakt, 2 g / l trypton, 10 mM natriumklorid, 2,5 mM kaliumklorid, 10 mM magnesiumklorid, 10 mM magnesiumsulfat) og inkuber ved 37 ° C aerobt i 1 time.
  11. Plate bakterier på LB-agarplater supplert med ampicillin 100 ug / ml (tilsett 100 ul av en 100 mg / ml ampicillin lager til 100 ml LB-agar) og inkuber over natten aerobt ved 37 ° C.
  12. Plukk enkeltkolonier og re-strek dem i LB-agar plater supplert med ampicillin 100 mikrogram / ml. Inkuber over natten aerobt ved 37 ° C.
  13. Plukke enkeltkolonier og dyrke dem over natten i 10 ml LB-medium supplementert med ampicillin 100 ug / ml for plasmid isolert. Bruk kommersielt tilgjengelige plasmid mini prep kit og elueres plasmid DNA med 30 mL dH 2 O (destillert vann) i henhold til produsentens; S protokollen. Bekrefte plasmider ved restriksjonsanalyse og DNA-sekvensering 37,42,43.
  14. Sett opp en kultur av positive kloner av E. coli pCFP-OVA i 100 ml LB medium supplementert med ampicillin 100 ug / ml. Vokse aerobt ved 37 ° C på en roterende ristemaskin over natten.
  15. Bland 800 mL av bakteriekultur med 200 ul ren glyserol og oppbevares ved -80 ° C.
  16. Sentrifuger resten av natten kultur ved 5000 xg i 10 min ved romtemperatur (RT) og resuspender pelleten i fosfatbufret saltvann (PBS). Plasser 10 mL av suspensjonen på glass-slide og dekke den med et dekkglass.
  17. Observer prøvene i en standard fluorescens mikroskopi for å bekrefte uttrykket fluorescens av CFP-OVA (CFP eksitasjon ved 450 nm, emisjon ved 480 nm). Analyser bakterier som starter med forstørrelse 400X.
  18. Sentrifuger 1 ml av bakterier fra over natten kulturer ved 5000 xg i 10 min, RT. Resuspender pelleten i 40 ulPBS og koker ved 95 ° C i 10 min.
  19. Sentrifuger prøvene ved 30 000 xg i 10 min, og bruk supernatantene for Western blot-analyse 37. Bruk kanin-hevet anti-OVA polyklonale antistoff fortynnet 1: 400.

3. generasjon OT-II / Rød Mus

  1. Krysse en mannlig / kvinnelig OT-II mus med en kvinnelig / mannlig mus som uttrykker rød fluorescerende protein (begge stammer kommersielt tilgjengelig) for å generere OT-II / Red mus 37.

4. Spleen Cell Isolation

  1. Avlive OT-II / mus Red ved cervikal dislokasjon etter anestesi ved inhalering av en hvilken som helst halogenert eter (opp til 5% for induksjon) kommersielt tilgjengelige.
  2. Bruk saks til å klippe venstre overlegen abdominal del av musen. Under dette abdominal delen er det milten (oval form med en mørk rød farge). Bruk saks og pinsett for å fjerne den.
    1. Pakk milten av OT-II / Red mus og passerer det gjennom en 100mikrometer celle sil plassert på et 50 ml rør ved hjelp av stempelet i en 1 ml sprøyte, for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Vask filteret to ganger med 10 ml PBS supplementert med 1% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS).
  3. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 390 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspender pelleten med 5 ml forvarmet lyseringsbuffer (144 mM NH4CI, 17 mM Tris, pH = 7,2) for å lysere røde blodceller. Inkuber 10 min ved 37 ° C.
  4. Vaske prøven med 25 ml PBS supplementert med 1% FBS. Sentrifuger ved 390 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspender pelleten i 10 ml PBS supplementert med 1% FBS.
  5. Tell cellene ved hjelp av et Neubauer tellekammer. Bland 10 ul av cellene suspensjonen med 10 ul av en 0,4% trypanblått-løsning. Inkuber i 1-2 min.
    1. Fyll hemocytometer kammer med 10 ul av fargede celler. Telle celler under mikroskop i fire 1 x 1 mm 2 kvadrater av ett kammer og determine gjennomsnittlig antall celler per kvadrat. Levedyktige celler vises hvite, døde celler vises blå. For å bestemme antall celler / ml multiplisere celle nummer med faktor fortynning. Hvis 2-4 kvadranter blir talt opp, dele med antall kvadranter.

5. CD4 + CD62 L + T Cell Enrichment

  1. Berik miltceller for CD4 + CD62L + T celler via magnetisk isolering kit bruker prinsippene i negativ eller positiv seleksjon. Her bruker negativ seleksjon å isolere CD4 + T-celler og bruke positiv utvelgelse for å berike for CD62L + befolkningen i CD4 + T-celle bassenget.
    MERK: I den negative utvelgelsesprosedyren, cellene, som ikke vil bli isolert (her: alle CD4 negative celler) er merket med spesifikke antistoffer kombinert med magnetiske mikroperler. Under kolonne vasking av trinn CD4 + T-celler vil passere gjennom kolonnen, slik at de kan være EASIly samlet. I de positive utvelgelsesprosedyre celler som skal isoleres, er merket med passende antistoff koblet med magnetiske mikroperler. Under kolonne vasking av trinn de merkede cellene vil forbli i kolonnen, og de kan samles ved å fjerne søylen fra det magnetiske felt, og skylle den med bufferen.
  2. For den negative seleksjonsprosedyren, resuspender 10 7 totale miltceller i 40 ul kald PBS supplert med 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Tilsett 10 pl av biotin-merket antistoff cocktail som følger med den magnetiske isolasjonskit (spesifikke antistoffer som binder de ikke-CD4 + T-celler) og inkuberes 15 minutter på is.
    1. Tilsett 30 ul kald PBS supplert med 0,5% BSA og 20 ul anti-biotin mikroperler. Inkuber 20 min på is.
    2. Legg til prøven 10 ml PBS supplert med 0,5% BSA og sentrifuger ved 390 xg i 5 minutter. Gjenta dette trinnet to ganger. Resuspender cellene i 1 ml kald PBS supplert med 0,5% BSEN.
    3. Plasser kolonne som er spesifikt for det negative seleksjonsprosedyren i magnetfeltet, og skylling med 3 ml kald PBS supplert med 0,5% BSA på kolonnen. Legg til cellesuspensjonen i kolonnen og vaskes 3 ganger med 3 ml kald PBS supplert med 0,5% BSA.
    4. Sentrifuger cellene i avløpet ved 390 xg i 5 min. Avløpet som passerer gjennom kolonnen inneholder ikke-merkede CD4 + T-celler. Resuspender pelleten i 1 ml PBS supplert med 0,5% BSA og telle cellene.
    5. Tell cellene ved hjelp av et Neubauer tellekammer. Bland 10 ul av cellene suspensjonen med 10 ul av en 0,4% trypanblått-løsning. Inkuber i 1-2 min.
      1. Fyll hemocytometer kammer med 10 ul av fargede celler. Cellene telles under mikroskop i fire 1 x 1 mm 2 kvadrater av ett kammer og bestemme det gjennomsnittlige antall celler pr kvadrat. Levedyktige celler vises hvite, døde celler vises blå. For å bestemme antall celler / ml formere celL-nummer med faktor fortynning. Hvis 2-4 kvadranter blir talt opp, dele med antall kvadranter.
  3. For den positive utvelgelsesprosessen, legger 10 mL av CD62L microbeads per 10 7 pre-beriket CD4 + T-cellefraksjon. Inkuber 15 min på is.
    1. Legg til prøven 10 ml PBS supplert med 0,5% BSA og sentrifuger ved 390 xg i 5 minutter. Gjenta dette trinnet to ganger. Resuspender i 500 ul kald PBS supplert med 0,5% BSA.
    2. Plasser den spesifikke kolonnen for det negative seleksjonsprosedyren i det magnetiske felt og skyll med 500 ul kald PBS supplert med 0,5% BSA på kolonnen. Legg cellesuspensjon på kolonnen og vaskes 3 ganger med 500 ul kald PBS supplert med 0,5% BSA.
    3. Fjern kolonnen fra det magnetiske feltet og plassere den på en passende samling rør. Tilsett 1 ml PBS supplert med 0,5% BSA i kolonnen, og tømme ut CD4 + CD62L + T-celle-s holdt tilbake i kolonnen ved fast å skyve stempelet inn i kolonnen.
      MERK: De isolerte CD4 + CD62L + T-celler er nå klar for nedstrøms applikasjoner, for eksempel in vivo eksperimenter. Ifølge produsentens instruksjoner fra CD4 + CD62L + T celler isolasjon kit, mikroperlene er ikke giftige. På grunn av den lille størrelsen (rundt 50 nm), har de ikke aktivere celler, og de vil ikke mette celleoverflate epitoper. Derfor er de isolerte celler kan overføres inn i immunodefekte mus for å indusere kolitt 37,44,45.
    4. Tell cellene ved hjelp av et Neubauer tellekammer. Bland 10 ul av cellene suspensjonen med 10 ul av en 0,4% trypanblått-løsning. Inkuber i 1-2 min.
      1. Fyll hemocytometer kammer med 10 ul av fargede celler. Cellene telles under mikroskop i fire 1 x 1 mm 2 kvadrater av ett kammer og bestemme det gjennomsnittlige antall celler pr kvadrat. Levedyktige celler appear hvite, døde celler vises blå. For å bestemme antall celler / ml multiplisere celle nummer med faktor fortynning. Hvis 2 - 4 kvadranter blir talt opp, dele med antall kvadranter.

6. Induksjon av Antigen-drevet kolitt

  1. Injiser intraperitonealt 3 x 10 5 OT-II / Red CD4 + CD62L + T-celler til CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mus. For induksjon av antigen-spesifikk kolitt, administrere E. coli pCFP-OVA hver annen dag i en dose på 1 x 10 8 kolonidannende enhet (CFU) i 100 ul PBS pr dyr med sonde eller oral instillasjon bak fortennene.
  2. Overvåk to ganger ukentlig kroppsvekt av transplanterte mus og deres kliniske tilstand (tilstedeværelse av blod i avføringen, avføring konsistens og aktiviteten til mus).

7. vevsprøver for histopatologisk undersøkelse

  1. Ta vevsprøver fra the tykktarmen av mus, fikse i nøytral-bufret formalin (10%) og embed i parafin som tidligere beskrevet 36,46.
  2. § parafin prøvene på en mikrotom, montere på lysbilder, og utfører H & E flekken 47,48.
  3. Kategorisere histologi av tykktarmen som er publisert tidligere 47,48: normal (0 poeng); mild kolitt (skår 1), moderat kolitt (skår 2) og alvorlig kolitt (skår 3).

8. Isolering av Kolon lamina propria Cells

  1. Avlive transplanterte mus ved cervikal dislokasjon etter anestesi ved inhalering av en hvilken som helst halogenert eter (opp til 5% for induksjon) kommersielt tilgjengelige.
  2. Plasser dyret ned med buken opp. Bruk pinsett til å ta tak i huden anteriorly til urinrørsåpningen. Bruk saks til å klippe i huden langs ventrale midtlinjen fra lysken til brystet. Dra huden tilbake på sidene.
  3. Skjær gjennom det gjennomsiktige peritoneal muskel veggen ogå åpne opp i kroppens hulrom. Identifiser tykktarmen som går fra anus til blindtarmen 49. Klipp 2 ekstremiteter og frigjøre vev fra noe fett.
  4. Åpne kolon lengderetningen ved hjelp av en disseksjon saks. Bruke en pinsett for å riste kolon vev i en petriskål inneholdende 25 ml PBS supplementert med 1% FBS for å fjerne rusk og slimete. Skjær tykktarmen inn i 5 - 8 mm stykker.
  5. Plasser kolon segmentene i et 50 ml rør inneholdende 20 ml av vaskebuffer. Den Vaskebuffer inneholder 500 ml DPBS, 10 mM Hepes og 5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).
  6. Vortex-røret for 30 sekunder ved maksimal hastighet.
  7. Inkuber røret med kolon segmenter i et vannbad ved 37 ° C med 200 rpm risting i 10 min.
  8. Etter inkuberingen vortex tube i 30 sekunder ved maksimal hastighet.
  9. Kast supernatants og plasser vevsprøver i en ny 50 ml tube inneholder 20 ml av vaskebuffer. Gjenta trinn 6-9 tre ganger
  10. Kast supernatants og plassere vevsprøver i en petriskål inneholdende 25 ml PBS. Bruke en pinsett for å riste forsiktig vevsprøvene i petriskålen for noen få sekunder for å fjerne rester av epitelceller. Gjenta dette trinnet tre ganger.
  11. Skjær colonic vev inn i 2 x 2 mm 2 biter og fordøye dem ved inkubasjon i 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 0,5 mg / ml kollagenase typen VIII fra Clostridium histolyticum og 10 U / ml DNaseI.
  12. Vortex-røret for 30 sekunder ved maksimal hastighet.
  13. Inkuber kolon-fragmenter i et vannbad ved 37 ° C med 200 rpm risting i 35 min og vortex tube i 30 sekunder ved maksimal hastighet hver 5 min.
  14. Ved slutten av inkubasjonen vortex tube i 30 sekunder ved maksimal hastighet.
  15. Samle fordøyd fragmenter ved å føre dem gjennom en 70 mikrometer celle sil plassert på en ny 50 ml tube.
  16. Vask prøven ved tilsetning av 20 ml DPBS og sentrifuger ved 400 g i 5 min. Deretter resuspender than celler i 1 ml DPBS.
  17. Tell cellene ved hjelp av et Neubauer tellekammer. Bland 10 ul av cellene suspensjonen med 10 ul av en 0,4% trypanblått-løsning. Inkuber i 1-2 min.
    1. Fyll hemocytometer kammer med 10 ul av fargede celler. Cellene telles under mikroskop i fire 1 x 1 mm 2 kvadrater av ett kammer og bestemme det gjennomsnittlige antall celler pr kvadrat. Levedyktige celler vises hvite, døde celler vises blå. For å bestemme antall celler / ml multiplisere celle nummer med faktor fortynning. Hvis 2-4 kvadranter blir talt opp, dele med antall kvadranter.

9. ekstracellulær Farging for FCM Analysis

  1. Sentrifuger CLP celler 5 min ved 390 x g. Resuspender cellene i 1 ml FACS A (PBS supplert med 1% BSA og 0,1% natriumazid)
    MERK: Natriumazid er svært giftig. Det kan føre til hypotensjon, hypotermi, hodepine kramper eller død. Fortynnede løsninger av natriumazid (00,1 til 1,0%) vanligvis ikke presentere ekstraordinære farer for brukeren, men de er øyne og hud irritanter. Bruk derfor natriumazid bare i kjemisk panseret mens iført en laboratoriefrakk og en dobbel par disponibel nitrilhansker.
  2. Cellene inkuberes i 15 minutter ved RT med det monoklonale antistoff (mAb) 2.4G2 rettet mot FcγRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 ug / mAb 10 6 celler) ble fortynnet i FACS A.
  3. Tilsett 200 ul FACS A til cellene og sentrifuger i 5 minutter ved 390 x g. Gjenta dette trinnet to ganger. Cellene inkuberes med 0,5 ng / 10 6 celler av den aktuelle mAb i 20 minutter ved 4 ° C. Vanne ut antistoffer i FACS A.
  4. Tilsett 200 ul FACS A til cellene og sentrifuger i 5 minutter ved 390 x g. Gjenta dette trinnet to ganger. Resuspender prøvene i 100 ul FACS A.
  5. Analyser T-celler fra CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mus rekonstituert med OT-II / Red CD4 T-celler ved strømningscytometer 37.

10. konfokalmikroskopi Analysis

  1. Analyser kolon av CX 3 CR1 GFP / + mus rekonstituert eller ikke med OT-II / Red CD4 + CD62L + T-celle og matet muntlig annenhver dag med 1 x 10 8 CFU av E. coli stamme DH10B pCFP-OVA.
  2. Fjern kolon fra mus ved hjelp av saks og pinsett. Åpne den langsgående ved hjelp av en disseksjon saks.
  3. Skjær en 5-8 mm stykke kolon prøve å bruke saks, sette på glassplater og dekk med dekkglass.
  4. Analyser kolon prøvene med et konfokalt mikroskop ved en forstørrelse på 40 / 1,30.
  5. Oppdage CX 3 CR1 + politikere, merket med grønn fluorescens protein (GFP), ved hjelp av et filter satt med eksitasjon ved 488 nm og emisjon ved 509 nm.
  6. Gjenkjenne CD4 + T-celle som uttrykker rød-protein ved hjelp av et filter angitt med eksitasjon ved 554 nm og emisjon ved 586 nm.
  7. Oppdage E.coli pCFP-OVA ved hjelp av et filter satt med eksitasjon ved 450 nm og emisjon ved 480 nm.
  8. Definere et område av interesse og generere spredningsdiagrammene som tidligere beskrevet, 50 for å utføre ko-lokalisering analyse. Bruk 2 forskjellige formler: Overlappings Coefficient henhold til Manders og Pearsons Coefficient.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Å etablere en antigen-drevet kolitt modell en E. coli-stamme er konstruert som inneholder et plasmid i hvilket genet for CFP er kondensert til den kodende sekvensen for kylling ovalbumin protein og fusjons konstruksjon blir uttrykt under kontroll av den sterke konstitutive promoter P hyper (figur 1A). Fluoriserende mikroskopi viser at rekombinant E. coli pCFP-OVA, men ikke foreldre E. coli DH10B uttrykker CFP (figur 1B). CFP-OVA- produserende E. coli er i stand til å aktivere OT-II-celler in vitro og indusere IFN-γ produksjon i motsetning til en E. coli stamme som uttrykker CFP bare (figur 2). Figur 3A viser ex vivo 3D konfokal avbildning av tarmvev fra CX 3 CR1 GFP / + mus foret med E. coli pCFP-OVA. E. coli pCFP-OVA kanoppdages innen colonic krypter ligger nær intestinale epitelceller og co-lokaliserer med CX 3 CR1 + fagocytter. For å bestemme den relative andelen av E. coli pCFP-OVA internalisert av definert CX 3 CR1 + fagocytter, ble det blå og grønne florescence intensitet bestemmes av scatter blotter. Analysen viste at CX 3 CR1 + -celler samplet 11,9 ± 1,5% av E. coli pCFP-OVA detektert i tykktarmen (figur 3B). I OT-II / Rød dyr, er CD4 + T-celler, karakterisert ved Red ekspresjon og vp 5,1 ekspresjon vist ved strømningscytometri (figur 4). Figur 5A viser en generell oversikt over antigen drevet kolitt modell. OT-II / Red + CD4 + T CD62L + celler ble adoptiv overført til CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mottakere som deretter ble gavaged annenhver dag med E.coli pCFP-OVA. Når utfordret med E. coli pCFP-OVA, overføres CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mus ned i kroppsvekt og utvikle kliniske tegn på kolitt (figur 5B) Figur 6 viser ex vivo 3D konfokalt avbildnings av tarmvev 7, 14 og 21 dager etter. tilberedning av heterozygote CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mottakere med OT-II / Rød + celler utfordret med E. coli pCFP-OVA. Syv dager etter celle overføring bare noen få CX 3 CR1 + fagocytter har samplet E. coli pCFP-OVA og OT-II / Red + celler ble ikke oppdaget. Fjorten dager etter celle overføring, CX 3 CR1 + fagocytter som samplet E. coli pCFP-OVA ble plassert i nærheten av OT-II / Red + celler. Tjueen dager etter celle overføre et høyt antall CX 3 CR1 + celler som har samplet E. coli pCFP-OVA og OT-II / Red + celler, spredt over hele CLP i umiddelbar nærhet til CX 3 CR1 + fagocytter.

Figur 1
Figur 1: CFP-OVA produserende E. coli. (A) Kart over pCFP-OVA med relevante restriksjonsseter, genet som koder OVA og den lyse blå fluoriserende protein CFP. (B) Bright felt og fluorescerende mikroskopiske bilder av villtype E. coli DH10B, E. coli DH10B pCFP og E. coli DH10B pCFP-OVA. Skala:. 10 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: OT-II Celler stimulert med CFP-OVA Produsere IFN-γ. Etter isolasjon fra milt, ble OT-II celler stimulert med de angitte mengder E. coli DH10B pCFP-OVA. Bakterieceller ble inaktivert etter to timers inkubering med 5 ug / ml gentamicin. Etter 72 timer med kultur, ble supernatantene samlet og IFN-y-konsentrasjoner bestemt av ELISA. Forsøkene ble utført i tre paralleller og data presentert som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: CX 3 CR1 + Fagocytter Sample E. coli pCFP-OVA. (A) CLP vev av CX 3 CR1GFP / + mus gavaged med 1 x 10 8 E. coli pCFP-OVA i 7 dager og analysert ved hjelp av ex vivo konfokal mikroskopi. Forstørrelse 40X / 1,30. Scale bar = 30 mikrometer. (B) Andelen internalisert E. coli pCFP-OVA kvantifisert og data presentert som gjennomsnitt ± SEM. I Mann-Whitney test p <0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Fig. 4: karakterisering av OT-II / rød + CD4 + T-celler (A) OT-II-transgene dyr som ble krysset med dyr som uttrykker den røde fluorescerende protein for å oppnå OT-II / rød +celler. OT-II / Rød + celler ble isolert fra milt av OT-II / Rød transgene dyr, farget for CD4 og Vß5.1 og analysert ved flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: OVA-drevet overføring kolitt (A) Skjematisk representasjon av antigenet drevne kolitt-modell.. OT-II / Red + CD4 + T CD62L + celler ble adoptiv overført til CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mus og vertene var gavaged annenhver dag med E. coli pCFP-OVA. (B) Kroppsvekt av de indikerte gruppene ble målt to ganger i uken. Gjennomsnitt ± SEM vekttap (%) er presentert. I Mann-Whitney testp <0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6:. CX 3 CR1 + MP'er kommunisere med OT-II celler under OVA-drevet overføring kolitt (A) tarmvev prøver ble undersøkt ved hjelp av ex vivo 3D konfokal avbildning på dag 7, 14 og 21 etter overføring av OT-II / Red + CD4 + T CD62L + celler i CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mottakere. Forstørrelse 40X / 1,30. Scale bar = 30 mikrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som med alle andre modellen, kan den antigen-drevet kolitt modellen beskrevet ovenfor presentere noen problemstillinger som etterforsker utfører teknikken må være klar over. Når injisere OT-II / Red + CD4 + T CD62L + celler i vertene, må etterforskeren være veldig forsiktig og nøye med å sette nålen inn i bukhulen. Unnlatelse av å gjøre det kan resultere i rive av tarmen av musen som kan føre til død, eller en subkutan administrering av celler som ikke vil forårsake sykdom.

Vanligvis vil mus opp i vekt i løpet av den første uken etter celle overføring. Undersøkeren bør veie musene samtidig ved hver vekt tidspunkt og bruke samme veiebalanse gjennom hele prosedyren. Noen ganger er de eksperimentelle mus, spesielt når deres vekt ved begynnelsen av eksperimentet er under 18 g, utvikler ikke noen tegn på avmagringssyndromet. Men disse dyrene might fremdeles utvikle betydelige tarmbetennelse etter makroskopisk evaluering.

Når du arbeider med genmodifiserte bakterier, kan forurensing oppstår. For å unngå disse problemene er det sterkt anbefalt å sjekke E.coli uttrykker CFP-OVA ved hjelp av fluorescerende mikroskop for å analysere om bakteriene er fluorescerende og er stavformet (typisk E.coli form).

Den foreslåtte antigen drevne-kolitt bygger på den observasjon at CX 3 CR1 + politikere prøven kommensal luminal bakterier i stabil tilstand, og i løpet av inflammatoriske tilstander 36,37. Induksjon av T-celler responser på antigen-drevne kolitt-modell er blitt demonstrert ved en høyaktiv fenotypen til OT-II CD4 + T-celler fra kolon av CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mus utfordret med antigen, sammenlignet med T-cellene isolert fra CX 3 CR1 GFP / + x RAG 37. Dette er i overensstemmelse med tidligere studier i hvilken, etter adoptiv overføring av OT-II T-celler i RAG - / - mus, kolitt ble indusert bare når vertene ble utfordret med OVA-uttrykkende E. coli 51.

Confocal avbildning antyder at CX 3 CR1 + fagocytter er lokalisert nær tarmepitelet slik at de kan prøve E. coli pCFP-OVA og samhandle med OT-II / Red + CD4 + T-celler. Etter CX 3 CR1 + fagocytter har samplet E. coli pCFP-OVA luminal antigen leveres til CD103 + dendrittiske celler (DCS) av CX 3 CR1 + fagocytter. CD103 + DC er i stand til å migrere til mesenteriske lymfeknute (MLN) til prime CD4 T-celler 37,52. Primet T-celler sammen i CLP hvor CX 3 CR1 + fagocytter viser OVA antigen til effector T-celler for å indusere inflammasjon. Levering og presentasjon av antigenet ved CX 3 CR1 + fagocytter kan være en viktig hendelse i utviklingen av kolitt.

Evnen til å indusere kolitt med en definert bakterie som uttrykker et spesifikt antigen gir mulighet til å studere de nødvendige vilkår for utvikling av kolitt 24. Denne modellen viser at en spesifikk respons til en antigenisk peptid (OVA uttrykt ved E. coli) er tilstrekkelig til å indusere intestinal inflammasjon i RAG - / - verter, noe som tyder på at T-cellene kan reagere spesifikt antigen fra tarmens mikroflora. En enkelt antigen kan indusere intestinal betennelse i dyremodeller, men det kan ikke antas at enkle antigener er årsaken til human IBD. Videre, i overførings kolitt-modell er det naive CD4 + T-celler som har spesifisitet ukjent og kan derfor være reaktiv til flere, som ennå uidentifiserte antigener, fraden bakterieflora. Major analyse og studier er nødvendig for å bedre klargjøre rollen som et spesifikt antigen i patogenesen av slimhinnebetennelse.

De siste årene har bruken av ulike dyremodell av kolitt har ført til en økning i kunnskap om patogenesen av IBD 53. Imidlertid, på grunn av kompleksiteten og til patogenesen av sykdommen, er det ikke en definitiv kur 54. Ved hjelp av den beskrevne modell, er det mulig å håndtere flere aspekter av IBD som ikke er godt klarlagt ennå, så som (i) interaksjoner mellom monocytter og dendrittiske celler, (ii) migrering av intestinal DC til MLN, (iii) antigenpresentasjon, (iv) homing av effektor-T-celler fra MLN til lamina propria og (v) aktivering av effektor-T-celler i lamina propria ved CX 3 CR1 + fagocytter. Imidlertid er ytterligere studier for å bekrefte om CX 3 CR1 + phagocyte / CD4 + T-celle interaksjon spiller en nøkkelrolle iIBD patogenesen. Mus kan ikke være virkelig representativ for mennesker, og dette må tas i betraktning når musemodeller brukes til å studere menneskelig IBD to.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 244620
Rotary Shake Reiss Laborbedarf e. K. Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes  Peqlab Biotechnologie GmbH 71-2020
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system  BioRad Laboratories GmbH 1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Difco 244510
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5G
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation Kit Roche 11754777001
Agarose Carl Roth GmbH & Co 3810.1
EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 537020 
Gel chamber  PEQLAB Biotechnology GmbH 40-0708
Loading Dye Thermo Fisher R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder  Thermo Fisher SM0312
Ethidium bromide solution Carl Roth GmbH & Co. KG 2218.3
Photo-documentation system  Decon Science Tech GmbH DeVision G 
DNA sequencing  MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS) Biochrom L182-50
Fluorescent microscope  Zeiss HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad Laboratories GmbH 1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue Solution Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane  Macherey-Nagel GmbH & Co. KG 741280
Electro blotter  Biometra GmbH 846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody  Abcam ab181688
Anti-rabbit IgG  HRP Sigma-Aldrich A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc 32132
Forene Abbott 2594.00.00
FBS Invitrogen 10500-064
Falcon Cell Strainers Fischer Scientific  08-771-2
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134-5G
Tris Base Sigma-Aldrich 10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit  Miltenyi Biotec 130-093-227 
MACS LS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Feeding Needle 20G SouthPointe Surgical Supply, Inc FN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128
Paraffin Sigma-Aldrich 1496904
Hematoxylin Sigma-Aldrich H9627
Eosin Y Sigma-Aldrich 230251 
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779 
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium AppliChem A2044, 9050
Sodium azide Sigma-Aldrich 438456
Mouse BD Fc Block BD Pharmingen 553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2  BD Pharmingen 553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5  eBioscience 17-0041-83
FACS Calibur  BD Biosciences
FCS Express V3 software DeNovo
Meta scanning confocal microscope  Zeiss LSM 710 
Zeiss Workstation Zeiss LSM 7
Zeiss ZEM software  Zeiss v4.2.0.121
Maxisorp immuno plates  NUNC, Roskilde 442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase Jackson Immuno Research 016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich 71768-5G
mAb R4-6A2 BD Biosciences 551216
mAb XMG1.2  BD Biosciences 554410
TECAN microplate-ELISA reader Tecan
EasyWin software Tecan
DNase I recombinant 4536282001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
  3. Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
  4. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
  5. Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
  6. Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
  7. Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
  8. Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
  9. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
  10. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
  11. Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111 (2011).
  12. Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
  13. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
  14. Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
  15. Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
  16. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
  17. Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
  18. Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
  19. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
  20. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
  21. Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
  22. Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
  23. Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
  24. Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
  25. Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
  26. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
  27. Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
  28. Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
  29. Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
  30. Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
  31. van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
  32. Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
  33. Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
  34. Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
  35. Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
  36. Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  37. Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
  38. Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
  39. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
  40. Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
  41. Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
  42. Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
  43. Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
  44. Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
  45. Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
  46. Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
  47. Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
  48. Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
  49. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
  50. Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
  51. Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
  52. Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
  53. Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404 (2012).
  54. Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).

Tags

Immunologi CX CD4 kolitt inflammatorisk tarmsykdom, Konfokalmikroskopi
Utvikling av en Antigen-drevet kolitt modell for å studere presentasjon av antigener ved hjelp av antigenpresenterende celler til T-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossini, V., Radulovic, K., Riedel,… More

Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter