Introduction
O intestino é a maior superfície do corpo que é exposta ao ambiente externo. Vastas matrizes de micróbios residentes colonizar o intestino humano para formar a microbiota intestinal (ou microflora). Este é estimado para consistir de até 100 trilhões de células microbianas e constitui um dos habitats bacterianas mais densamente povoadas conhecidos na biologia 1-3. No GIT bactérias colonizar um nicho intestinal onde eles sobreviver e se multiplicar 4. Em troca, a microbiota dota o anfitrião com características funcionais adicionais não codificados em seu genoma 1. Por exemplo a microbiota estimula a proliferação de células epiteliais, produz vitaminas que hospeda não pode produzir por si mesmas, regula o metabolismo e protege contra agentes patogénicos 4-6. Dada esta relação benéfica, alguns autores têm sugerido que os seres humanos são "super-organismos" ou "holobionts", que são uma mistura de genes de bactérias e humanos 7,8. Dado o impacto benéfico da microbiota do hospedeiro (humano), o sistema imunitário do intestino necessita de tolerar micróbios comensais para permitir a sua existência no lúmen, mas também matar os patogénios que invadem a partir do lado luminal 9-11. O sistema imunológico intestinal tem desenvolvido mecanismos para distinguir entre os micróbios luminais inofensivos e potencialmente prejudiciais; No entanto, estes mecanismos ainda não são bem compreendidos 12. Manter a integridade intestinal requer uma homeostase imune fortemente regulada para manter o equilíbrio entre tolerância e imunidade 13. Um desequilíbrio na homeostase imune contribui para a indução de doenças intestinais, tais como doença inflamatória do intestino (IBD) 3,14.
Existem dois principais tipos de DII: doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC). Os pacientes com estas doenças geralmente sofrem de sangramento retal, diarréia severa e dor abdominal 15,16. A única causa da DII ainda édesconhecida, mas uma combinação de fatores genéticos, influências ambientais e respostas imunes desreguladas pode ser o evento chave para o desenvolvimento da doença 15.
Modelos animais para IBD têm sido utilizados por mais de 50 anos. Nas últimas décadas foram desenvolvidos novos sistemas modelo IBD para testar as várias hipóteses relativas à patogénese da DII 17,18. O modelo melhor caracterizado de colite crónica é o modelo de transferência de células T que induz perturbações da homeostase de células T 19,20. Este modelo envolve a transferência de células T naive a partir de ratinhos imunocompetentes em hospedeiros que não têm T e as células B (tais como RAG - / - e ratinhos SCID) 16,21. O desenvolvimento da doença neste modelo é monitorizada durante 3-10 semanas por avaliação da presença de diarreia, a redução da actividade física, e perda de peso corporal. Este é assim chamado a síndrome de caquexia 16. Em comparação com os ratos saudáveis do tecido do cólon dos exércitos transplantados é thickeR, mais curtos e mais pesado 16. Utilizando o modelo de transferência de células T, é possível compreender como as diferentes populações de células T pode contribuir para a patogénese do IBD 22. O modelo de transferência de células T não analisar as interacções entre as APCs e as células T no processo da doença de uma forma específica para o antigénio. Demonstrou-se que uma interacção entre as células mielóides e células linfóides pode ser responsável pelo desenvolvimento de inflamação intestinal 23. Embora muitos aspectos de DII foram clarificados, os eventos iniciais que conduzem ao desenvolvimento da doença têm ainda de ser claramente entendido.
Foi demonstrado que na ausência da colite transferência microbiota não pode ser estabelecida 24. Recentemente, várias teorias que sugerem IBD pode ser um resultado de uma resposta imunitária contra bactérias comensais 25. Os autores propuseram também que as bactérias comensais são essenciais para induzir a inflamação no intestino distal26. Em livre de germes (GF) os animais o sistema imunitário do intestino é geralmente deficientes 27,28, mas uma colonização destes ratos com uma mistura de-específica isentos de agentes patogénicos bactérias resulta no desenvolvimento do sistema imunitário intestinal totalmente competente 29. Assim, a microbiota parece ser um elemento chave na patogénese do IBD, ou como um mecanismo que predispõe para ou protege contra o desenvolvimento de inflamação intestinal 30,31. As teorias atuais sugerem que IBD é um resultado de desequilíbrio microbiano, chamado disbiose, em pacientes geneticamente predispostos 32, mas ainda não está claro se a disbiose é a causa ou a consequência da doença 12. Considerando o papel de microorganismos no desenvolvimento de DII, em experiências in vitro mostraram que as células T CD4 + podem ser activadas por APCs pulsadas com bactérias intestinais 33,34.
Além disso, demonstrou-se que os antigénios deespécies bacterianas diferentes comensais, tais como E. coli, Bacteroides, Eubacterium e Proteus, é capaz de activar células T CD4 + 35. Isto indica que a apresentação de antigénios bacterianos de células T é de importância para o desenvolvimento de IBD. Para reduzir a complexidade de múltiplos antigénios derivados pela microflora no processo da doença, de uma estirpe de E. coli foi criada que produz o antigénio OVA. Transferência colite foi induzida por injecção de células T específicas de OVA em RAG - / - de animais colonizado com E. expressam OVA coli.
Este modelo baseia-se em evidências recentes sugerindo que CX 3 CR1 + MPs, um grande subconjunto de células na lâmina do cólon (CLP) 36, estão interagindo com células T CD4 + durante a transferência de colite 37. MPs provar o lúmen intestinal para antígeno particulado, tais como bactérias, usando suas dendrites 36, 38,39. Estudos anterioresdemonstrou que MPs também pode levar até antigénios solúveis, tais como óvulos, introduzidos na intestinal lúmen 40,41. Dada a abundância de CX 3 CR1 + MPs no CLP, é possível que essas células podem provar bactérias luminais e interagir com células T CD4. De imagem confocal de murganhos transplantados com células específicas de OVA T CD4 + colonizadas com E. coli PCP-OVA, mostram que CX 3 CR1 + MPs estão em contacto com células AT-II T CD4 + durante o desenvolvimento de colite conduzido pelo antigénio. Este modelo permite o estudo do processo de apresentação de antigénio entre as APCs e as células intestinais T específicas apenas para determinadas bactérias que expressam os antigénios no lúmen do intestino.
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Protocol
Os ratos foram criados e mantidos sob (SPF) condições específicas isentos de agentes patogénicos no biotério da Universidade de Ulm (Ulm, Alemanha). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do uso de animais local e comitê de cuidados e da Lei Nacional do Bem-Estar Animal.
1. Construção do plasmídeo de OVA pCFP
- Amplificar o gene de tamanho completo de OVA utilizando os iniciadores Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') e Ova_ClaI_rev (3'-GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 utilizando o plasmídeo pCI-OVA (resistente à ampicilina) 42 como um modelo. Clonar o produto de PCR (isto é, a sequência de codificação de OVA) em um fago mid-vector comercialmente disponível utilizando SpeI e ClaI restrições locais dos iniciadores e o vector para produzir o plasmídeo de OVA-específica.
- Amplificar o gene codificante da PCP em conjunto com o promotor constitutivo forte hiper P usando um plasmídeo pAD 43 como um molde e os iniciadores CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') e CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
- Clonar o gene que codifica para PCP-OVA-plasmídeo específico (resistente à ampicilina), utilizando os locais de restrição Spel e SacI do vector e os iniciadores 37. Isto introduz um espaçador de 6 resíduos de glicina entre o PCP-codificação a partir da sequência de OVA-codificante.
2. Construção de E. coli pCFP-OVA
- Crescer E. coli estirpe DH10B em 100 ml de meio Luria Bertani (LB) aerobicamente a 37 ° C num agitador rotativo durante a noite.
- Misturar 800 mL de cultura bacteriana com 200 ul de glicerol para criar stock de glicerol e armazenar a -80 ° C.
- Adicionar 50? L de E. coli estirpe DH10B de stock de glicerol em 5 ml de meio LB e fazê-los crescer em condições aeróbias a 37 ° C num agitador rotativo overnight.
- Transferir a cultura num balão de Erlenmeyer de 1 L confundido com 250 ml de meio LB a 37 ° C em uma agitação rotativa.
- Crescer as bactérias a uma densidade óptica a 600 nm (OD 600) de 0,5 e, em seguida, arrefecer a cultura em gelo durante 30 min. Centrifugar as bactérias a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Ressuspender as bactérias com 100 mL de H 2 O esterilizada gelado e centrifugação as bactérias a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Ressuspender as bactérias com 100 mL de gelo frio de 10% de glicerol e centrifugar as bactérias a 5000 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este último passo duas vezes.
- Após o passo final de lavagem, ressuspender as bactérias em 700 ul de 10% de glicerol. Congelar 50 mL alíquotas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C.
- Descongelar uma alíquota de 50 ul em gelo e transferência para uma cuvete de electroporação de pré-gelada (2 mm distância entre os eléctrodos).
- Adicionam-se 5 ul de DNA de plasmídeo (100 ng) com 50 ul de E. aliquo colits. Execute eletroporação com um único pulso a 25 uF, 200 ohms (Ω) e 2,5 kV.
- bactérias Ressuspender em 1 ml de pré-aquecido meio SOC (5 g / l de extracto de levedura, 2 g / L de triptona, cloreto de sódio 10 mM, cloreto de potássio 2,5 mM, cloreto de magnésio 10 mM, sulfato de magnésio 10 mM) e incuba-se a 37 ° C aerobicamente durante 1 h.
- bactérias placa em placas de LB-agar suplementado com ampicilina a 100 ug / ml (adicionar 100 ul de um estoque de 100 mg de ampicilina / ml a 100 ml de LB-agar) e incubar durante a noite em condições aeróbias a 37 ° C.
- Escolha colónias individuais e re-raia-los em placas de LB-agar suplementado com ampicilina a 100 ug / ml. Incubar durante a noite em condições aeróbias a 37 ° C.
- Escolha colónias individuais e crescê-las durante a noite em 10 ml de meio LB suplementado com ampicilina a 100 ug / ml para isolamento de plasmídeos. Use disponível comercialmente mini-kit de preparação de plasmídeo e elui-se ADN de plasmídeo com 30 uL de dH 2 O (água destilada) de acordo com o fabricante '; S de protocolo. Verifique plasmídeos por análise de restrição e 37,42,43 de sequenciamento de DNA.
- Configurar uma cultura de clones positivos de E. coli pCFP-OVA em 100 ml de meio LB suplementado com ampicilina a 100 ug / ml. Crescem aerobicamente a 37 ° C num agitador rotativo durante a noite.
- Misturar 800 mL de cultura bacteriana com 200 ul de glicerol puro e armazenar a -80 ° C.
- Centrifuga-se o resto da cultura durante a noite a 5000 xg durante 10 min à temperatura ambiente (TA) e ressuspender o pellet em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Coloque 10 ml de suspensão em lâmina de vidro e cubra com uma lamela.
- Observar as amostras numa microscopia de fluorescência padrão para confirmar a expressão de fluorescência PCP-OVA (PCP excitação a 450 nm, emissão a 480 nm). Analisar as bactérias começam com aumento de 400X.
- Centrifugar 1 ml de bactérias a partir de culturas durante a noite a 5000 xg durante 10 min, TA. Ressuspender o sedimento em 40 ul dePBS e ferver a 95 ° C durante 10 min.
- Centrifugar as amostras a 30.000 xg durante 10 min e utilizar-se os sobrenadantes para análise de Western blot 37. Usar o anticorpo policlonal anti-OVA levantou-coelho diluída a 1: 400.
3. Geração de OT-II / Ratos Vermelho
- Cruzar um rato macho / fêmea OT-II com um rato fêmea / macho expressar a proteína fluorescente vermelha (ambas as estirpes disponíveis comercialmente), a fim de gerar ratinhos OT-II / Vermelho 37.
4. Isolamento celular Baço
- Eutanásia dos ratinhos OT-II / vermelho por deslocamento cervical depois de anestesia por inalação de éter qualquer halogenado (de até 5% por indução) comercialmente disponível.
- Use a tesoura para cortar a parte abdominal superiores esquerdo do mouse. Sob esta parte abdominal há o baço (forma oval com uma cor vermelho-escuro). Use tesouras e pinças para removê-lo.
- Extrair o baço dos ratinhos OT-II / vermelho e passá-la através de um 100coador de células uM posicionado sobre um tubo de 50 ml utilizando o êmbolo de uma seringa de 1 ml, a fim de se obter uma suspensão de célula única. Lavar o filtro duas vezes com 10 ml de PBS suplementado com 1% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS).
- Centrifugar a suspensão de células a 390 xg durante 5 min à TA. Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão pré-aquecido a lise (144 mM de NH4Cl, Tris 17 mM, pH = 7,2) para lisar as células vermelhas do sangue. Incubar 10 min a 37 ° C.
- Lava-se a amostra com 25 ml de PBS suplementado com 1% de FBS. Centrifugar a 390 xg durante 5 min à TA. Ressuspender o sedimento em 10 ml de PBS suplementado com 1% de FBS.
- Contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Misturar 10 mL da suspensão de células com 10 uL de uma solução de Azul de Tripano a 0,4%. Incubar por 1-2 min.
- Encha a câmara de hemocitômetro com 10 ml de células coradas. Contagem de células ao microscópio em quatro 1 x 1 milímetro 2 quadrados de uma câmara e determinum e o número médio de células por metro quadrado. As células viáveis aparecem glóbulos brancos, mortas aparecem em azul. Para determinar o número de células / ml multiplicar o número de células pelo factor de diluição. Se 2-4 quadrantes estão sendo contados, dividir pelo número de quadrantes.
5. CD4 + CD62 + T L Enriquecimento celular
- Enriqueça células do baço para células CD4 + CD62L + T via kit de isolamento magnético utilizando os princípios da selecção negativa ou positiva. Aqui, usar selecção negativa para isolar as células T CD4 + e usar selecção positiva para enriquecer ainda mais para o CD62L + população dentro do conjunto de células T CD4 +.
NOTA: No processo de selecção negativa, as células, as quais não serão isolados (aqui: Todas as células negativas CD4) são rotulados com anticorpos específicos, juntamente com micro-esferas magnéticas. Durante a lavagem da coluna passos as células T CD4 +, vai passar através da coluna de modo que eles podem ser easily recolhidos. Nas células de procedimento de selecção positiva para ser isolados são marcados com o anticorpo apropriado acoplado com microesferas magnéticas. Durante a lavagem da coluna passos as células marcadas vão ficar na coluna e que pode ser recolhida através da remoção da coluna do campo magnético e lavagem com o tampão. - Para o processo de selecção negativa, ressuspender 10 7 células de baço no total em 40 uL de PBS frio suplementado com albumina de soro bovino 0,5% (BSA). Adicionar 10 ul de anticorpo marcado com biotina cocktail fornecido com o kit de isolamento magnético (anticorpos específicos de ligação de células não-T CD4 +) e incubar 15 minutos em gelo.
- Adicionar 30 ul de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA e 20 ul de microesferas anti-biotina. Incubar 20 minutos em gelo.
- Adicionar à amostra 10 ml de PBS suplementado com 0,5% de BSA e centrifugar a 390 xg durante 5 min. Repita esta etapa duas vezes. Ressuspender as células em 1 ml de PBS frio suplementado com 0,5% de BSUMA.
- Colocar a coluna específico para o processo de selecção negativa no campo magnético e lavar com 3 ml de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA para a coluna. Adicionar a suspensão de células na coluna e lava-se 3 vezes com 3 ml de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA.
- Centrifugar as células do efluente a 390 xg durante 5 min. Efluentes passagem através da coluna contém células T CD4 + não marcados. Ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS suplementado com BSA a 0,5% e contar as células.
- Contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Misturar 10 mL da suspensão de células com 10 uL de uma solução de Azul de Tripano a 0,4%. Incubar por 1-2 min.
- Encha a câmara de hemocitômetro com 10 ml de células coradas. Contar as células ao microscópio em quatro 1 x 1mm quadrados 2 de uma câmara e determinar o número médio de células por quadrado. As células viáveis aparecem glóbulos brancos, mortas aparecem em azul. Para determinar o número de células / ml multiplicar cell número pelo fator de diluição. Se 2-4 quadrantes estão sendo contados, dividir pelo número de quadrantes.
- Para o procedimento de selecção positiva, adicionar 10 ul de microesferas de CD62L por 10 7 fracção enriquecida de células pré-T CD4 +. Incubar 15 minutos em gelo.
- Adicionar à amostra 10 ml de PBS suplementado com 0,5% de BSA e centrifugar a 390 xg durante 5 min. Repita esta etapa duas vezes. Ressuspender em 500 ul de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA.
- Colocar a coluna específico para o processo de selecção negativa no campo magnético e lavar com 500 ul de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA para a coluna. Adicionar a suspensão de células na coluna e lava-se 3 vezes com 500 ul de PBS frio suplementado com 0,5% de BSA.
- Remova a coluna do campo magnético e colocá-lo em um tubo de recolha adequado. Adicionar 1 ml de PBS suplementado com 0,5% de BSA para a coluna e expulsar células CD4 + CD62L + Ts retidos na coluna, empurrando firmemente o êmbolo na coluna.
NOTA: agora As células CD4 + CD62L + T isolados estão prontos para aplicações a jusante, tais como experimentos in vivo. De acordo com as instruções do fabricante do kit de isolamento de células T CD4 + CD62L + T, as microesferas não são tóxicos. Devido ao pequeno tamanho (cerca de 50 nm), que não activam as células e que não vai saturar os epítopos de superfície celular. Por conseguinte, as células isoladas podem ser transferidos para ratinhos imunodeficientes para induzir a colite 37,44,45. - Contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Misturar 10 mL da suspensão de células com 10 uL de uma solução de Azul de Tripano a 0,4%. Incubar por 1-2 min.
- Encha a câmara de hemocitômetro com 10 ml de células coradas. Contar as células ao microscópio em quatro 1 x 1mm quadrados 2 de uma câmara e determinar o número médio de células por quadrado. As células viáveis appear glóbulos brancos, mortas aparecem em azul. Para determinar o número de células / ml multiplicar o número de células pelo factor de diluição. Se 2 - 4 quadrantes estão sendo contados, dividir pelo número de quadrantes.
6. indução da colite Antigen-driven
- Injectar por via intraperitoneal 3 x 10 5 células OT-II / Red CD4 + CD62L + T em CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratos. Para a indução da colite específica de antigénio, administrar E. coli pCFP-OVA a cada segundo dia, numa dose de 1 x 10 8 unidades formadoras de colónias (CFU) em 100 ul de PBS por animal por gavagem oral, instilação ou por trás dos incisivos.
- Monitorar duas vezes semanalmente o peso corporal de ratinhos transplantados e a sua condição clínica (presença de sangue nas fezes, a consistência das fezes e da actividade de ratos).
7. As amostras de tecido para exame histopatológico
- Tome amostras de tecido de the intestino grosso de murganhos, fixar em formalina neutra tamponada (10%) e embutida em parafina, como descrito anteriormente 36,46.
- Seção amostras de parafina em um micrótomo, montar em slides, e realizar a H & E mancha 47,48.
- Categorizar a histologia do intestino grosso, tal como publicado anteriormente 47,48: normal (escore 0); colite leve (escore 1), colite moderada (pontuação 2) e colite grave (escore 3).
8. Isolamento de células do cólon lâmina própria
- Eutanásia ratinhos transplantados por deslocamento cervical depois de anestesia por inalação de éter qualquer halogenado (de até 5% por indução) disponível comercialmente.
- Colocar o animal para baixo com a barriga virada para cima. Use uma pinça para agarrar a pele anteriormente à abertura da uretra. Use a tesoura para cortar a pele ao longo da linha média ventral desde a virilha até o peito. Puxar a pele volta sobre os lados.
- Corte através da parede muscular peritoneal transparente eabertura da cavidade do corpo. Identificar o cólon que vai desde o ânus do ceco 49. Corte as 2 extremidades e liberar o tecido de qualquer gordura.
- Abra o cólon longitudinalmente utilizando uma dissecção tesoura. Usar uma pinça para apertar o tecido do cólon numa placa de Petri contendo 25 ml de PBS suplementado com 1% de FBS para remover detritos e mucosa. Cortar os dois pontos em 5 - 8 pedaços mm.
- Colocar os segmentos de cólon em um tubo de 50 ml contendo 20 ml de tampão de lavagem. O tampão de lavagem contém 500 ml de DPBS, Hepes 10 mM e 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
- Vortex o tubo durante 30 segundos na velocidade máxima.
- Incubar o tubo com os segmentos de cólon em um banho de água a 37 ° C com agitação 200 rpm durante 10 min.
- Após a incubação, vortex o tubo durante 30 segundos à velocidade máxima.
- Descartar o sobrenadante e colocar as amostras de tecido em um novo tubo de 50 ml contendo 20 ml de tampão de lavagem. Repita os passos 6-9 três vezes
- Descartar as supernatants e colocar as amostras de tecido numa placa de Petri contendo 25 ml de PBS. Use uma pinça para agitar suavemente as amostras de tecido na placa de Petri por alguns segundos para remover as células epiteliais residuais. Repita este passo três vezes.
- Cortar tecidos do cólon em 2 x 2 mm 2 pedaços e digeri-los por incubação em 10 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) forma com 0,5 mg / mL de colagenase tipo VIII, a partir de Clostridium histolyticum e 10 U / ml de ADNasel.
- Vortex o tubo durante 30 segundos na velocidade máxima.
- Incubar os fragmentos de cólon em um banho de água a 37 ° C com agitação 200 rpm durante 35 min e agitar com vortex o tubo durante 30 segundos a velocidade máxima a cada 5 min.
- No final da incubação do tubo vortex durante 30 segundos a velocidade máxima.
- Recolher os fragmentos digeridos fazendo-as passar através de um filtro celular de 70 uM posicionado sobre um novo tubo de 50 ml.
- Lava-se a amostra por adição de 20 ml de DPBS e centrifugar a 400 g durante 5 min. Em seguida, ressuspender tele células em 1 mL de DPBS.
- Contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Misturar 10 mL da suspensão de células com 10 uL de uma solução de Azul de Tripano a 0,4%. Incubar por 1-2 min.
- Encha a câmara de hemocitômetro com 10 ml de células coradas. Contar as células ao microscópio em quatro 1 x 1mm quadrados 2 de uma câmara e determinar o número médio de células por quadrado. As células viáveis aparecem glóbulos brancos, mortas aparecem em azul. Para determinar o número de células / ml multiplicar o número de células pelo factor de diluição. Se 2-4 quadrantes estão sendo contados, dividir pelo número de quadrantes.
9. Coloração extracelular de Análise FCM
- Centrífuga o CLP células 5 min a 390 x g. Ressuspender as células em 1 ml de FACS A (PBS suplementado com 1% de BSA e 0,1% de azida de sódio)
NOTA: A azida de sódio é altamente tóxico. Ela pode causar hipotensão, hipotermia, convulsões ou dor de cabeça morte. As soluções diluídas de azida de sódio (00,1-1,0%) geralmente não apresentam perigos extraordinários para o usuário, mas eles são irritantes para os olhos e pele. Portanto, use azida de sódio somente no capô química, enquanto vestindo uma bata de laboratório e um par duplo de luvas de borracha nitrílica descartáveis. - Incubam-se as células durante 15 min a TA com o anticorpo monoclonal (mAb) dirigido contra a 2.4G2 FcyRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 ug de mAb / 10 6 células) diluído em FACS A.
- Adicionar 200 ul de FACS A para as células e centrifugar 5 min a 390 x g. Repita esta etapa duas vezes. Incubam-se as células com 0,5 ng / 10 6 células do mAb relevante durante 20 min a 4 ° C. Dilui-se a anticorpos em FACS A.
- Adicionar 200 ul de FACS A para as células e centrifugar 5 min a 390 x g. Repita esta etapa duas vezes. Ressuspender as amostras em 100 ul de FACS A.
- Analise as células T a partir CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratos reconstituídos com OT-II / células CD4 Red T no citômetro de fluxo 37.
Análise 10. Microscopia Confocal
- Analisar o cólon de CX 3 CR1 GFP ratos / + reconstituídos ou não com OT-II / célula vermelha CD4 + CD62L + T e alimentado por via oral a cada segundo dia com 1 x 10 8 UFC de E. coli estirpe DH10B pCFP-OVA.
- Remover o cólon dos camundongos, usando tesouras e pinças. Abri-la longitudinalmente utilizando uma dissecção tesoura.
- Corte um pedaço 5-8 mm de amostra de cólon usando uma tesoura, coloque em lâminas de vidro e cubra com lamelas.
- Analisar as amostras de cólon com um microscópio confocal com uma ampliação de 40 / 1,30.
- Detectar o CX 3 CR1 + MPs, marcado com fluoresceína proteína verde (GFP), utilizando um conjunto de filtros com excitação a 488 nm e emissão a 509 nm.
- Detectar a células T CD4 + que expressam a proteína vermelho utilizando um conjunto de filtros com excitação a 554 nm e emissão a 586 nm.
- Detectar E. coli pCFP-OVA utilizando um conjunto de filtros com excitação a 450 nm e emissão a 480 nm.
- Definir uma área de interesse e gerar diagramas de dispersão como anteriormente descrito 50 para realizar a análise de co-localização. Use 2 fórmulas diferentes: a sobreposição Coeficiente de acordo com Manders e Coeficiente de Pearson.
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Representative Results
Para estabelecer um modelo de colite-driven antígeno um E. coli Foi construído um plasmídeo que contém na qual o gene para a PCP é fundido à sequência de codificação para a proteína de ovalbumina de galinha e a construção de fusão é expressa sob o controlo do promotor forte constitutivo hiper P (Figura 1A). Microscopia de fluorescência demonstra que a E. recombinante coli pCFP-OVA, mas não a de E. parental coli DH10B, expressa PCP (Figura 1B). PCP-OVA- produzindo E. coli é capaz de activar as células AT-II in vitro e induzem a produção de IFN-γ em contraste com uma E. estirpe de E. coli expressando PCP só (Figura 2). A Figura 3A mostra ex vivo 3D imagem confocal do tecido colónico de CX 3 CR1 GFP / + ratinhos alimentados com E. coli pCFP-OVA. E. coli pCFP-OVA podeser detectado dentro de criptas colônicas localizado perto intestinal células epiteliais e co-localiza com CX 3 CR1 + fagócitos. Para determinar a proporção relativa de E. coli pCFP-OVA internalizados por CX definida 3 CR1 + fagócitos, a intensidade de fluorescência azul e verde foram determinados por manchas de dispersão. A análise revelou que as células CX 3 CR1 + amostrada de 11,9 ± 1,5% da E. coli pCFP-OVA detectado no cólon (Figura 3B). Na AT-II / animais vermelhos, células T CD4 + são caracterizados pela expressão de vermelho e Vp 5.1 expressão mostrado por citometria de fluxo (Figura 4). A Figura 5A mostra um panorama geral de o modelo de colite conduzido antigénio. / Células AT-II Vermelho + T CD4 + CD62L + foram transferidos adoptivamente para CX 3 CR1 GFP / + X RAG - / - recipientes que foram então tratadas por gavage a cada segundo dia com E.coli pCFP-OVA. Quando desafiados com E. coli pCFP-OVA, transferiu CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratos perder peso corporal e desenvolver os sinais clínicos da colite (Figura 5B) Figura 6 mostra ex vivo em 3D de imagem confocal do tecido do cólon 7, 14 e 21 dias após. reconstituição do CX heterozigotos 3 CR1 GFP / + x RAG - / - destinatários com OT-II / + células vermelhas desafiados com E. coli pCFP-OVA. Sete dias após a transferência de células apenas alguns CX 3 CR1 + fagócitos se provar E. coli pCFP-OVA e OT-II / células vermelhas + não foram detectados. Catorze dias após a transferência de células, CX 3 CR1 fagócitos + que amostrados E. coli pCFP-OVA foram localizados perto de OT-II células / vermelho +. Vinte e um dias após a transferência de células de um elevado número de células CX 3 CR1 + que foram amostrados E. coli pCFP-OVA e OT-II / Rcélulas DE +, dispersos por todo o CLP em estreita proximidade com CX 3 CR1 + fagócitos.
Figura 1: CFP-OVA Producing E. coli. (A) Mapa de pCFP-OVA com locais de restrição relevantes, o gene que codifica OVA e a proteína fluorescente azul brilhante PCP. (B) Campo brilhante e imagens microscópicas fluorescentes de tipo selvagem E. coli DH10B, E. coli DH10B pCFP e E. coli DH10B pCFP-OVA. Barra de escala:. 10 m Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: OTAs células estimuladas com PCP -II-OVA Produção de IFN-γ. Após o isolamento a partir do baço, as células AT-II foram estimuladas com os números indicados dos E. coli DH10B pCFP-OVA. As células bacterianas foram inativadas após incubação de 2 horas, com 5 ug / ml de gentamicina. Após 72 h de cultura, os sobrenadantes foram recolhidos e as concentrações de IFN-y por ELISA. Os experimentos foram realizados em triplicata e os dados apresentados como média ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: CX 3 CR1 + fagócitos Amostra E. coli pCFP-OVA. (A) do tecido CLP de CX 3 CR1GFP ratinhos / + tratadas por gavage com 1 x 10 8 E. coli pCFP-OVA durante 7 dias e analisadas por microscopia confocal ex vivo. Ampliação 40X / 1,30. Barra de escala = 30 mm. (B) A percentagem de E. internalizado coli pCFP-OVA quantificada e os dados apresentados como a média ± SEM. No Mann-Whitney p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Caracterização de OT-II / células vermelhas + CD4 + (A) AT-II animais transgénicos foram cruzados com animais que expressam a proteína fluorescente vermelha para obter AT-II / Vermelho +células. OT-II / células vermelhas + foram isolados a partir de baços de OT-II / Vermelho animais transgénicos, coradas para CD4 e Vß5.1 e analisados por citometria de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Transferência de OVA-driven Colite (A) Representação esquemática do modelo de colite conduzido antigénio.. / Células OT-II Red + CD4 + T CD62L + foram adoptively transferido para CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - ratos e anfitriões foram tratadas por gavage a cada segundo dia com E. coli pCFP-OVA. Peso (B) Corpo dos grupos indicados foi medida duas vezes por semana. Média ± SEM de perda de peso corporal (%) é apresentada. No teste de Mann-Whitneyp <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6:. CX 3 CR1 + MPs Comunique-se com células OT-II durante a transferência de Colite-driven OVA amostras de tecido do cólon (A) foram examinados por ex vivo de imagem confocal 3D no dia 7, 14 e 21 após a transferência das OT-II / Vermelho + CD4 + CD62L + células em CX 3 CR1 GFP / + X RAG - / - destinatários. Ampliação 40X / 1,30. Barra de escala = 30 mm.
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Discussion
Tal como acontece com todos os outros modelos, o modelo de colite-driven antigénio descrito acima pode apresentar alguns problemas que o investigador realização da técnica deve estar ciente. Ao injetar o OT-II / Vermelho + CD4 + T CD62L + células nos hospedeiros, o investigador deve ser muito gentil e cuidadosa para inserir a agulha para dentro da cavidade peritoneal. Não fazer isso pode resultar na ruptura do intestino do rato que pode levar à morte ou a administração subcutânea de células que não induzem qualquer doença.
Normalmente, os ratos vai ganhar peso durante a primeira semana após a transferência de células. O investigador deve pesar os ratinhos, ao mesmo tempo em cada ponto de tempo de peso e utilizar a mesma balança ao longo de todo o procedimento. Por vezes, os ratinhos experimentais, especialmente quando o seu peso no início da experiência é inferior a 18 g, não se desenvolvem quaisquer sintomas da síndrome de desperdício. No entanto, estes animais might ainda desenvolver inflamação intestinal significativa sob avaliação macroscópica.
Quando se trabalha com bactérias geneticamente modificadas, contaminações podem ocorrer. Para evitar esses problemas, é altamente recomendável para verificar o E.coli expressando CFP-OVA usando o microscópio de fluorescência para analisar se as bactérias são fluorescentes e são em forma de haste (a forma típica de E. coli).
O antígeno propôs-driven colite baseia-se na observação de que CX 3 CR1 + MPs bactérias comensais amostra luminais no estado estacionário e durante a condições inflamatórias 36,37. A indução de respostas de células T no modelo de colite impulsionado-antigénio foi demonstrada pelo fenótipo altamente activado de células AT-II T CD4 + a partir dos dois pontos de CX 3 CR1 GFP / + X RAG - / - ratinhos desafiados com o antigénio, em comparação com as células T isoladas a partir do CX 3 CR1 GFP / + X RAG
Imagem confocal sugere que os fagócitos CX 3 CR1 + estão localizados perto do epitélio intestinal para que eles possam provar E. coli pCFP-OVA e interagir com OT-II / células Vermelho + T CD4 +. Depois de fagócitos CX 3 CR1 + se provar E. coli pCFP-OVA o antigénio luminal é entregue aos CD103 + células dendríticas (DC) por CX 3 CR1 + fagócitos. CD103 + DCs são capazes de migrar para o nódulo linfático mesentérico (MLN) para as células T CD4 primos 37,52. As células T preparadas montar no CLP onde CX 3 CR1 + fagócitos mostrar o antigénio OVA para effector células T para induzir a inflamação. A entrega e a apresentação do antigénio pelas CX 3 CR1 + fagócitos poderia ser um acontecimento chave no desenvolvimento de colite.
A capacidade para induzir a colite com uma bactéria que expressa um antigénio definido específico proporciona a oportunidade de estudar as condições necessárias para o desenvolvimento de colite 24. Este modelo mostra que uma resposta específica para um péptido antigénico (OVA expressa por E. coli) é suficiente para induzir a inflamação intestinal em RAG - / - hospedeiros, sugerindo que as células T podem reagir ao antigénio específico da microflora intestinal. Um único antigénio pode induzir a inflamação intestinal nos modelos animais, mas que não pode ser assumido que os antigénios individuais são a causa da DII humana. Além disso, no modelo de colite de transferência existem células T CD4 + naive que têm especificidade desconhecida e, portanto, pode ser reactivo com múltiplos, a partir de antigénios ainda não identificados, a partir dea microbiota. Maior análises e estudos são necessários para esclarecer o papel de um antígeno específico na patogênese da inflamação da mucosa.
Nos últimos anos, o uso de modelo animal diferente da colite conduziu a uma expansão no conhecimento da patogênese da DII 53. No entanto, devido à complexidade e à patogénese da doença, não há uma cura definitiva 54. Utilizando o modelo descrito, é possível resolver vários aspectos da IBD que ainda não estão bem esclarecidos ainda, tais como (i) interacções entre os monócitos e células dendríticas, (ii) migração de DC intestinal para a MLN, (iii) apresentação de antigénio, (iv) homing de células T efectoras de MLN para a lâmina e (v) activação de células T efectoras em lâmina própria por CX 3 CR1 + fagócitos. No entanto, mais estudos são necessários para confirmar se o CX 3 CR1 + fagócitos / interação de células CD4 + T desempenha um papel fundamental naa patogénese de IBD. Ratos não pode ser verdadeiramente representativa dos seres humanos e isso deve ser mantido em mente quando mouse modelos são usados para estudar IBD humana 2.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan | ||
| DNase I recombinant | 4536282001 |
References
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