Introduction
Tarmen är den största ytan av kroppen som är exponerad för den yttre miljön. Stora kedjor av inhemska mikrober koloniserar människans tarm att bilda tarmfloran (eller mikroflora). Detta beräknas bestå av upp till 100 biljoner mikrobiella celler och utgör ett av de mest tätbefolkade bakteriella livsmiljöer som är kända inom biologin 1-3. I GIT bakterierna kolonisera en tarm nisch där de överleva och föröka sig fyra. I gengäld förser mikrobiota värden med ytterligare funktionella egenskaper inte kodas på dess genom en. Exempelvis mikrobiota stimulerar proliferation av epitelceller, producerar vitaminer som är värd inte kan producera själva, reglerar metabolism och skyddar mot patogener 4-6. Med tanke på detta givande relation har vissa författare föreslagit att människor är "super-organismer" eller "holobionts" som är en blandning av bakteriella och mänskliga gener 7,8. Med tanke på de positiva effekterna av mikrobiota på (mänsklig) värd, behöver tarmimmunsystemet att tolerera kommen mikrober för att möjliggöra deras existens i lumen men också döda patogener som invaderar från luminala sidan 9-11. Tarmimmunsystemet har utvecklat mekanismer för att skilja mellan ofarliga och potentiellt skadliga luminala mikrober; men dessa mekanismer är ännu inte väl förstått 12. Att upprätthålla tarm integritet kräver en hårt reglerad immun homeostas att hålla balansen mellan tolerans och immunitet 13. En obalans i immun homeostas bidrar till induktion av tarmsjukdomar såsom inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) 3,14.
Det finns två huvudtyper av IBD: Crohns sjukdom (CD) och ulcerös kolit (UC). Patienter med dessa sjukdomar lider vanligtvis från blödning, svår diarré och buksmärtor 15,16. Den enda orsaken till IBD är fortfarandeokänd, men en kombination av genetiska faktorer, miljöfaktorer och oreglerad immunsvar kan vara den viktigaste händelsen för sjukdomsutveckling 15.
Djurmodeller för IBD har använts i över 50 år. Under de senaste decennierna nya IBD modellsystem har utvecklats för att testa olika hypoteser om patogenesen för IBD 17,18. Bäst karakteriserad modell av kronisk kolit är den T-cell-överföringsmodell som inducerar störningar i T-cell homeostas 19,20. Denna modell involverar överföring av naiva T-celler från immunkompetenta möss in i värdar som saknar T- och B-celler (såsom RAG - / - och SCID-möss) 16,21. Utvecklingen av sjukdomen i denna modell övervakas under 3-10 veckor genom att utvärdera närvaron av diarré, minskad fysisk aktivitet, och förlust av kroppsvikt. Detta är så kallade wasting syndrome 16. Jämfört med friska möss kolonvävnad av transplanterade värdar är Thicker, kortare och tyngre 16. Med användning av cellöverföringsmodell T, är det möjligt att förstå hur olika T-cellspopulationer kan bidra till patogenesen av IBD 22. T-cellöverföringsmodell analyserar inte interaktionen mellan APC och T-celler i sjukdomsprocessen på ett antigenspecifikt sätt. Det har visats att en interaktion mellan myeloidceller och lymfoidceller kan vara ansvarig för utvecklingen av tarminflammation 23. Även om många aspekter av IBD har klargjorts, de inledande händelser som leder till sjukdomsutvecklingen måste fortfarande klart.
Det har visat sig att i avsaknad av mikrobiota överförings kolit kan inte fastställas 24. Nyligen har flera teorier tyder på att IBD kan vara ett resultat av ett immunsvar mot bakteriefloran 25. Författarna har också föreslagit att bakteriefloran är nödvändiga för att framkalla inflammation i den distala tarmen26. I bakteriefri (GF) djur tarmimmunsystemet generellt osäkra 27,28, men en kolonisering av dessa möss med en blandning av specifik patogenfria bakterier resulterar i utvecklingen av fullt behöriga tarmimmunsystemet 29. Därför verkar mikroorganismer att vara en nyckelfaktor i patogenesen för IBD, antingen som en mekanism som ökar risken för eller skyddar mot utvecklingen av tarminflammation 30,31. Aktuella teorier tyder på att IBD är ett resultat av mikrobiell obalans, kallad dysbios i genetiskt predisponerade patienter 32, men det är inte klart ännu om dysbios är orsaken eller en följd av sjukdomen 12. Att beakta betydelsen av mikroorganismer i utvecklingen av IBD, in vitro-experiment visade att CD4 + T-celler kan aktiveras av APC pulserade med tarmbakterier 33,34.
Vidare har det visats att antigener frånolika commensal bakteriella arter, såsom E. coli, Bacteroides, Eubacterium och Proteus, kan aktivera CD4 + T-celler 35. Detta indikerar att presentation av bakteriella antigener till T-celler är av betydelse för utvecklingen av IBD. För att minska komplexiteten hos multipla antigener härledda genom mikrofloran i sjukdomsprocessen, har en E. coli-stam skapats som producerar OVA-antigenet. Överföring kolit inducerades genom att injicera OVA-specifika T-celler in i RAG - / - djur koloniserade med OVA-uttryckande E. coli.
Denna modell bygger på bevis som tyder på att CX 3 CR1 + MPs, en stor cell delmängd i kolon lamina propria (CLP) 36, interagerar med CD4 + T-celler under överföringen kolit 37. MPs prov tarmlumen för partiklar antigen, såsom bakterier, med hjälp av sina dendriter 36, 38,39. Tidigare studiervisade att MPs också kan ta upp lösliga antigener, såsom OVA, som förs in i tarmen lumen 40,41. Med tanke på det överflöd av CX 3 CR1 + MPs i CLP, är det möjligt att dessa celler kan prova luminala bakterier och interagera med CD4 T-celler. Konfokal avbildning av möss transplanterades med OVA-specifika CD4 + T-celler koloniserade med E. coli GFP-OVA, visar att CX 3 CR1 + MPs är i kontakt med OT-II CD4 + T-cell under utvecklingen av antigen-driven kolit. Denna modell möjliggör studiet av antigenpresentation processen mellan intestinala APC och T-celler specifika endast för särskilda antigen-uttryckande bakterier i tarmlumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Möss avlades och hölls under specifika patogenfria (SPF) förhållanden i djuranläggningen i Ulm University (Ulm, Tyskland). Alla djurförsök utfördes enligt riktlinjerna i den lokala djur användning och skötsel kommitté och National djurskyddslag.
1. Konstruktion av pCFP-OVA plasmid
- Amplifiera full storlek OVA-genen med användning av primrarna Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') och Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 med användning av plasmid pCI-OVA (ampicillinresistenta) 42 som en mall. Klona PCR-produkten (dvs OVA-kodande sekvensen) i en kommersiellt tillgänglig fag mitten vektor använder Spel och Clal restriktionsställen av primers och vektor för att ge specifika OVA-plasmid.
- Förstärk GFP-kodande genen tillsammans med den starka konstitutiva promotorn P hyper använder plasmid Pad 1 43 som en mall och primrar CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') och CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
- Klona GFP-kodande gen i de specifika OVA-plasmid (ampicillinresistenta) med hjälp av Spel-och Sacl-restriktionsställena för primrarna och vektor 37. Detta medför en spacer av 6 glycinrester mellan GFP-kodande från OVA-kodande sekvensen.
2. Konstruktion av E. coli pCFP-OVA
- Växer E. coli-stam DH10B i 100 ml Luria Bertani (LB) -medium aerobt vid 37 ° C på en roterande skakanordning över natten.
- Blanda 800 | il bakteriekultur med 200 | il av glycerol för att skapa glycerolförråd och förvara vid -80 ° C.
- Tillsätt 50 pl av E.coli-stam DH10B från glycerol lager i 5 ml LB-medium och odla dem aerobt vid 37 ° C på en roterande skakanordning overnight.
- Överföra odlingen i baffelförsedd 1 L Erlenmeyer-kolv med 250 ml LB-medium vid 37 ° C i en roterande skaka.
- Odlar bakterier till en optisk densitet vid 600 nm (OD 600) av 0,5 och sedan kyla kulturen på is under 30 min. Centrifugera bakterierna vid 5000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Resuspendera bakterier med 100 ml iskall steril H2O och centrifugera bakterierna vid 5000 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Resuspendera bakterier med 100 ml iskall 10% glycerol och centrifugera bakterier vid 5000 xg under 10 min vid 4 ° C. Upprepa detta sista steg två gånger.
- Efter den sista tvättsteget, återsuspendera bakterier i 700 ul av 10% glycerol. Frysa 50 l alikvoter i flytande kväve och förvara vid -80 ° C.
- Tina en 50 pl alikvot på is och överför till en pre-kyld elektroporeringskyvett (2 mm elektrodavstånd).
- Tillsätt 5 pl plasmid-DNA (100 ng) till 50 ^ E. coli aliquots. Utför elektroporering med en enda puls vid 25 iF, 200 ohm (Ω) och 2,5 kV.
- Resuspendera bakterier i 1 ml förvärmda SOC-medium (5 g / L jästextrakt, 2 g / L trypton, 10 mM natriumklorid, 2,5 mM kaliumklorid, 10 mM magnesiumklorid, 10 mM magnesiumsulfat) och inkubera vid 37 ° C aerobt under 1 timme.
- Platt bakterier på LB-agarplattor kompletterade med ampicillin 100 | ig / ml (tillsätt 100 | il av en 100 mg / ml ampicillin lager till 100 ml av LB-agar) och inkubera över natten aerobt vid 37 ° C.
- Plocka enstaka kolonier och åter strimma dem i LB-agarplattor kompletterade med ampicillin 100 pg / ml. Inkubera över natten aerobt vid 37 ° C.
- Plocka enstaka kolonier och odla dem över natten i 10 ml LB-medium kompletterat med ampicillin 100 | ig / ml för plasmid isolering. Använd kommersiellt tillgängliga plasmid mini prep kit och eluera plasmid-DNA med 30 pl dH 2 O (destillerat vatten) enligt tillverkarens; S protokoll. Kontrollera plasmider genom restriktionsanalys och DNA-sekvense 37,42,43.
- Inrätta en kultur av positiva kloner av E. coli pCFP-OVA i 100 ml LB-medium kompletterat med ampicillin 100 pg / ml. Växa aerobt vid 37 ° C på en roterande skakanordning över natten.
- Blanda 800 | il bakteriekultur med 200 pl ren glycerol och förvara vid -80 ° C.
- Centrifugera resten av natten kultur vid 5000 xg under 10 min vid rumstemperatur (RT) och återsuspendera pelleten i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Placera 10 | il av suspensionen på glasskiva och täcka den med ett täckglas.
- Observera proven i en standard fluorescensmikroskopi för att bekräfta uttrycket fluorescens av GFP-OVA (GFP excitation vid 450 nm, emission vid 480 nm). Analysera bakterierna börjar med förstoring 400X.
- Centrifugera 1 ml av bakterier från övernattskulturer vid 5000 xg under 10 min, RT. Återsuspendera pelleten i 40 plPBS och kokar vid 95 ° C under 10 min.
- Centrifugera proverna vid 30.000 xg under 10 min och använd supernatanterna för Western blot-analys 37. Använd kanin-höjde anti-OVA polyklonal antikropp utspädd 1: 400.
3. Framställning av OT-II / Red möss
- Korsa en manlig / kvinnlig OT-II-mus med en kvinnlig / manlig mus som uttrycker röd fluorescerande protein (båda stammarna kommersiellt tillgängliga) för att generera OT-II / Red möss 37.
4. Spleen Cell Isolation
- Euthanize OT-II / Red-möss genom cervikal dislokation efter anestesi genom inhalation av någon halogenerad eter (upp till 5% för inducering) kommersiellt tillgängliga.
- Använd sax för att klippa till vänster överlägsen buken del av musen. Under denna buken delen finns mjälten (oval form med en mörkröd färg). Använd sax och pincett för att ta bort den.
- Utdrag mjälten av OT-II / röda möss och passera det genom en 100| im cellfilter placerat på en 50 ml rör med hjälp av kolven i en 1 ml spruta för att erhålla en enkelcellsuspension. Tvätta silen två gånger med 10 ml PBS kompletterad med 1% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS).
- Centrifugera cellsuspensionen vid 390 xg under 5 min vid RT. Resuspendera pelleten med 5 ml förvärmd lyseringsbuffert (144 mM NH4CI, 17 mM Tris, pH = 7,2) för att lysera de röda blodkropparna. Inkubera 10 min vid 37 ° C.
- Tvätta provet med 25 ml PBS kompletterad med 1% FBS. Centrifugera vid 390 xg under 5 min vid RT. Återsuspendera pelleten i 10 ml PBS kompletterad med 1% FBS.
- Räkna celler med användning av en Neubauer-räknekammare. Blanda 10 il av celler suspensionen med 10 pl av en 0,4% Trypan Blue-lösning. Inkubera under 1-2 min.
- Fyll hemocytometer kammaren med 10 pl färgade celler. Räkna celler under mikroskop i fyra 1 x 1 mm 2 rutor av en kammare och fastställbarae det genomsnittliga antalet celler per kvadrat. Livsdugliga celler verkar vita, döda celler visas blå. För att bestämma antalet celler / ml multiplicera antalet celler med en faktor av utspädning. Om 2-4 kvadranter är räknas, dividera med antalet kvadranter.
5. CD4 + CD62 L + T-cell Anrikning
- Berika mjältceller för CD4 + CD62L + T-celler via magnetisk isolering kit med hjälp av principerna för negativ eller positiv selektion. Här använder negativ selektion för att isolera CD4 + T-celler och använda positiv selektion att ytterligare berika för CD62L + befolkningen i cellen poolen CD4 + T.
OBS: I den negativa urvalsförfarandet, de celler, som inte kommer att isoleras (här: alla CD4 negativa celler) är märkta med specifika antikroppar kopplade med magnetiska mikropärlor. Under kolumntvättningsstegen de CD4 + -T-celler kommer att passera genom kolonnen så att de kan vara easily uppsamlades. I positiva urvalsförfarande celler som skall isoleras är märkta med lämplig antikropp kopplad med magnetiska mikropärlor. Under kolumntvättningsstegen de märkta cellerna kommer att stanna i kolonnen och de kan samlas genom att avlägsna kolonnen från magnetfältet och skölja det med bufferten. - För den negativa selektionsförfarandet, resuspendera 10 7 totala mjältceller i 40 | il kall PBS kompletterat med 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Tillsätt 10 pl av biotin märkt antikropp cocktail levereras med den magnetiska isoleringskit (specifika antikroppar som binder de icke-CD4 + T-celler) och inkubera 15 min på is.
- Tillsätt 30 ^ il kall PBS kompletterad med 0,5% BSA och 20 | il av anti-biotin mikropärlor. Inkubera 20 minuter på is.
- Lägg till provet 10 ml PBS kompletterad med 0,5% BSA och centrifugera vid 390 xg under 5 min. Upprepa detta steg två gånger. Resuspendera cellerna i 1 ml kall PBS kompletterat med 0,5% BSEN.
- Placera kolonnen specifik för den negativa selektionsförfarande i magnetfältet och skölj med 3 ml kall PBS kompletterad med 0,5% BSA på kolonnen. Lägga cellsuspensionen på kolonnen och tvätta 3 gånger med 3 ml kall PBS kompletterad med 0,5% BSA.
- Centrifugera cellerna av utflödet vid 390 xg under 5 min. Effluent som passerar genom kolonnen innehåller omärkta CD4 + T-celler. Återsuspendera pelleten i 1 ml PBS kompletterad med 0,5% BSA och räkna cellerna.
- Räkna celler med användning av en Neubauer-räknekammare. Blanda 10 il av celler suspensionen med 10 pl av en 0,4% Trypan Blue-lösning. Inkubera under 1-2 min.
- Fyll hemocytometer kammaren med 10 pl färgade celler. Räkna celler under mikroskop i fyra 1 x 1 mm 2 rutor av en kammare och fastställa den genomsnittliga antalet celler per kvadrat. Livsdugliga celler verkar vita, döda celler visas blå. För att bestämma antalet celler / ml multiplicera cell antal av faktor utspädning. Om 2-4 kvadranter är räknas, dividera med antalet kvadranter.
- För den positiva urvalsförfarandet, tillsätt 10 pl CD62L mikrokulor per 10 7 pre-berikad CD4 + T-cellsfraktion. Inkubera 15 minuter på is.
- Lägg till provet 10 ml PBS kompletterad med 0,5% BSA och centrifugera vid 390 xg under 5 min. Upprepa detta steg två gånger. Resuspendera i 500 pl kall PBS kompletterad med 0,5% BSA.
- Placera den specifika kolumnen för den negativa selektionsförfarande i magnetfältet och skölj med 500 pl kall PBS kompletterad med 0,5% BSA på kolonnen. Lägg cellsuspension på kolonnen och tvätta 3 gånger med 500 | il kall PBS kompletterad med 0,5% BSA.
- Ta kolonnen från magnetfältet och placera den på en lämplig provröret. Tillsätt 1 ml PBS kompletterad med 0,5% BSA på kolonnen och spola ut CD4 + CD62L + T-cells kvar i kolonnen genom stadigt trycka in kolven i kolonnen.
OBS: De isolerade CD4 + CD62L + T-celler är nu redo för tillämpningar efter, såsom in vivo experiment. Enligt tillverkarens anvisningar från CD4 + CD62L + T-celler isolering kit, mikropärlorna är inte giftiga. På grund av den lilla storleken (cirka 50 nm), de inte aktivera celler och de kommer inte mätta cellyte-epitoper. Därför kan överföras de isolerade cellerna i möss med immunbrist för att inducera kolit 37,44,45. - Räkna celler med användning av en Neubauer-räknekammare. Blanda 10 il av celler suspensionen med 10 pl av en 0,4% Trypan Blue-lösning. Inkubera under 1-2 min.
- Fyll hemocytometer kammaren med 10 pl färgade celler. Räkna celler under mikroskop i fyra 1 x 1 mm 2 rutor av en kammare och fastställa den genomsnittliga antalet celler per kvadrat. Viabla celler appear vita, döda celler visas blå. För att bestämma antalet celler / ml multiplicera antalet celler med en faktor av utspädning. Om 2 - 4 kvadranter håller på att räknas, dividera med antalet kvadranter.
6. Induktion av antigen-driven Colitis
- Injicera intraperitonealt 3 x 10 5 OT-II / Röd CD4 + CD62L ^ T-celler in i CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - möss. För induktion av antigen-specifik kolit, administrera E. coli pCFP-OVA varannan dag i en dos av 1 x 10 8 kolonibildande enhet (CFU) i 100 pl PBS per djur genom sondmatning eller oral instillation bakom framtänderna.
- Övervaka två gånger per vecka kroppsvikten hos transplanterade möss och deras kliniska tillstånd (närvaro av blod i avföringen, avföringens konsistens och aktivitet hos möss).
7. vävnadsprover för histopatologisk undersökning
- Ta vävnadsprover från the tjocktarmen hos möss, fixera i neutral formalin (10%) och bädda in i paraffin som tidigare beskrivits 36,46.
- § paraffin prov på en mikrotom, montera på diabilder, och utför H & E fläcken 47,48.
- Kategorisera histologi av tjocktarmen som tidigare 47,48 publicerats: normal (score 0); mild kolit (poäng 1), måttlig kolit (poäng 2) och svår kolit (poäng 3).
8. Isolering av Colonic lamina propria-celler
- Avliva transplanterade möss genom cervikal dislokation efter anestesi genom inhalation av någon halogenerad eter (upp till 5% för inducering) kommersiellt tillgängliga.
- Placera djuret med magen uppåt. Använd pincett för att ta tag i huden anteriort till urinrörsmynningen. Använd sax för att skära in i huden längs den ventrala mittlinjen från ljumsken till bröstet. Dra huden tillbaka på sidorna.
- Skär genom den transparenta peritoneal muskelvägg ochöppna kroppshåligheten. Identifiera tjocktarmen som går från anus till caecum 49. Skär 2 extremiteter och befria vävnad från något fett.
- Öppna kolon i längdled med hjälp av en dissektion sax. Använda en pincett för att skaka kolonvävnad i en petriskål innehållande 25 ml PBS kompletterad med 1% FBS för att avlägsna skräp och slem. Skär kolon i 5 - 8 mm bitar.
- Placera kolon segmenten i ett 50 ml rör innehållande 20 ml av tvättbuffert. Tvättbufferten innehåller 500 ml DPBS, 10 mM Hepes och 5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA).
- Vortexa röret i 30 sekunder vid maximal hastighet.
- Inkubera röret med kolon segmenten i ett vattenbad vid 37 ° C med 200 rpm skakning under 10 min.
- Efter inkuberingen virvel röret i 30 sekunder vid maximal hastighet.
- Kassera supernatanterna och placera de vävnadsprover i ett nytt 50 ml rör innehållande 20 ml av tvättbuffert. Upprepa steg 6-9 tre gånger
- Kasta supernatants och placera vävnadsprover i en petriskål innehållande 25 ml PBS. Använda en pincett för att skaka försiktigt vävnadsproverna i petriskålen för några sekunder för att ta bort kvarvarande epitelceller. Upprepa detta steg tre gånger.
- Skär kolon vävnader i 2 x 2 mm 2 bitar och smälta dem genom inkubation i 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 0,5 mg / ml kollagenas typ VIII från Clostridium histolyticum och 10 U / ml DNasI.
- Vortexa röret i 30 sekunder vid maximal hastighet.
- Inkubera kolon fragment i ett vattenbad vid 37 ° C med 200 rpm skakning i 35 min och vortexa röret i 30 sekunder vid maximal hastighet var 5 min.
- Vid slutet av inkubationen virvel rör under 30 sekunder vid maximal hastighet.
- Samla de uppdelade fragmenten genom att passera dem genom en 70 | im cellfilter placerat på en ny 50 ml tub.
- Tvätta provet genom tillsats av 20 ml DPBS och centrifugera vid 400 g under 5 min. Därefter återsuspendera than celler i 1 ml DPBS.
- Räkna celler med användning av en Neubauer-räknekammare. Blanda 10 il av celler suspensionen med 10 pl av en 0,4% Trypan Blue-lösning. Inkubera under 1-2 min.
- Fyll hemocytometer kammaren med 10 pl färgade celler. Räkna celler under mikroskop i fyra 1 x 1 mm 2 rutor av en kammare och fastställa den genomsnittliga antalet celler per kvadrat. Livsdugliga celler verkar vita, döda celler visas blå. För att bestämma antalet celler / ml multiplicera antalet celler med en faktor av utspädning. Om 2-4 kvadranter är räknas, dividera med antalet kvadranter.
9. Extracellulär Färgning för FCM Analys
- Centrifugera CLP-celler 5 minuter vid 390 x g. Resuspendera cellerna i 1 ml FACS A (PBS kompletterad med 1% BSA och 0,1% natriumazid)
OBS: Natriumazid är mycket giftigt. Det kan orsaka hypotension, hypotermi, huvudvärk konvulsioner eller dödsfall. Utspädda lösningar av natriumazid (00,1-1,0%) brukar inte presentera extra risker för användaren, men de är ögon- och hudirriterande. Använd därför natriumazid endast i dragskåp iklädd en laboratorierock och en dubbel par engångs nitril. - Inkubera cellerna i 15 min vid RT med den monoklonala antikroppen (mAb) 2.4G2 riktad mot FcyRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 ^ g mAb / 10 6 celler) utspädd i FACS A.
- Tillsätt 200 | il av FACS A till cellerna och centrifugera 5 min vid 390 x g. Upprepa detta steg två gånger. Inkubera cellerna med 0,5 ng / 10 6 celler av den relevanta mAb under 20 min vid 4 ° C. Späd antikropparna i FACS A.
- Tillsätt 200 | il av FACS A till cellerna och centrifugera 5 min vid 390 x g. Upprepa detta steg två gånger. Resuspendera prover i 100 pl FACS A.
- Analysera T-celler från CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - möss rekonstituerade med OT-II / Röd CD4-T-celler vid flödescytometern 37.
10. konfokalmikroskopi analys
- Analysera kolon av CX 3 CR1 GFP / + möss rekonstituerade eller inte med OT-II / Röd CD4 + CD62L + T-celler och matas oralt varannan dag med 1 x 10 8 CFU E. coli-stam DH10B pCFP-OVA.
- Ta bort tjocktarmen från mössen med sax och pincett. Öppna den längsgående med hjälp av en dissektion sax.
- Skär en 5-8 mm bit av kolonprov med sax, sätta på objektglas och täck med täck.
- Analysera kolon prover med ett konfokalt mikroskop vid en förstoring av 40 / 1,30.
- Detektera CX 3 CR1 + MPs, märkt med grön fluorescein protein (GFP), med användning av en filteruppsättning med excitation vid 488 nm och emission vid 509 nm.
- Identifiera CD4 + T-celler som uttrycker röd protein med hjälp av en filteruppsättning med excitation vid 554 nm och emission vid 586 nm.
- Identifiera E.coli pCFP-OVA med hjälp av en filteruppsättning med excitation vid 450 nm och emission vid 480 nm.
- Definiera ett område av intresse och generera punktdiagram som tidigare beskrivits 50 för att utföra samlokalisering analysen. Använd 2 olika formler: överlappningskoefficient enligt Manders och Pearsons koefficient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att etablera en antigen-driven kolit modell en E. coli-stam har konstruerats som innehåller en plasmid i vilken genen för GFP är fuserad till den kodande sekvensen för kyckling ovalbumin proteinet och fusionskonstruktionen uttrycks under kontroll av den starka konstitutiva promotorn P hyper (Figur 1A). Fluorescerande mikroskopi visar att den rekombinanta E. coli pCFP-OVA, men inte den paren E. coli DH10B uttrycker GFP (Figur 1B). CFP-OVA- producerande E. coli är i stånd att aktivera OT-II-celler in vitro och inducerar IFN-γ produktion i motsats till en E. coli-stam som uttrycker GFP enbart (Figur 2). Figur 3A visar ex vivo 3D konfokal avbildning av kolonvävnad av CX 3 CR1 GFP / + möss som utfodrats med E. coli pCFP-OVA. E. coli pCFP-OVA kandetekteras inom kolon kryptor ligger nära intestinala epitelceller samt co-lokaliseras med CX 3 CR1 + fagocyter. För att bestämma den relativa proportionen av E. coli pCFP-OVA internaliseras av definierade CX 3 CR1 + fagocyter, var blå och gröna fluorescensintensiteten bestäms av spridnings blöts. Analysen visade att CX 3 CR1 + celler samplade 11,9 ± 1,5% av E. coli pCFP-OVA detekteras i kolon (Figur 3B). I OT-II / röda djur är CD4 + T-celler som kännetecknas av röda uttryck och Vp 5,1 uttryck visas genom flödescytometri (Figur 4). Figur 5A visar en allmän översikt över antigendriven kolit modell. OT-II / Red + CD4 + T CD62L + celler adoptivt överförd till CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mottagare som sedan sondmatades varannan dag med E.coli pCFP-OVA. När de utmanas med E. coli pCFP-OVA, överfördes CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - möss förlora kroppsvikt och utveckla kliniska tecken på kolit (figur 5B) Figur 6 visar ex vivo 3D konfokal avbildning av kolonvävnad 7, 14 och 21 dagar efter. beredning av heterozygot CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mottagare med OT-II / Röd + celler utmanas med E. coli pCFP-OVA. Sju dagar efter cellöverföring endast ett fåtal CX 3 CR1 + fagocyter har prov E. coli pCFP-OVA och OT-II / var Red + celler inte upptäcks. Fjorton dagar efter cellöverföring, CX 3 CR1 + fagocyter som samplade E. coli pCFP-OVA var belägna nära OT-II / röd + celler. Tjugoen dagar efter cell överföra ett stort antal CX 3 CR1 + celler som har urvalet E. coli pCFP-OVA och OT-II / Red + celler, dispergerade i hela CLP i nära anslutning till CX3 CR1 + fagocyter.
Figur 1: CFP-OVA producerande E. coli. (A) Karta över pCFP-OVA med relevanta restriktionsställen, den gen som kodar OVA och klarblå fluorescerande proteinet GFP. (B) Bright fält och fluorescerande mikroskopiska bilder av vildtyp E. coli DH10B, E. coli DH10B pCFP och E. coli DH10B pCFP-OVA. Skala bar. 10 mikrometer klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: OT-II Celler stimulerade med GFP-OVA Produce IFN-γ. Efter isolering från mjälte, var OT-II-celler stimulerades med de angivna antalet E. coli DH10B pCFP-OVA. Bakterieceller inaktiverades efter 2 timmars inkubering med 5 pg / ml gentamicin. Efter 72 timmar av kultur, ades supernatanterna samlas och IFN-y-koncentrationer bestämdes genom ELISA. Experiment utfördes i triplikat och data som presenteras som medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: CX 3 CR1 + fagocyter Prov E. coli pCFP-OVA. (A) CLP vävnad CX 3 CR1GFP / + möss sondmatades med 1 x 10 8 E. coli pCFP-OVA i 7 dagar och analyserades med ex vivo konfokalmikroskopi. Förstoring 40X / 1,30. Skalstreck = 30 | im. (B) Andelen intern E. coli pCFP-OVA kvantifieras och data presenteras som medelvärde ± SEM. I Mann-Whitney test p <0,05 ansågs statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Karakterisering av OT-II / Röd + CD4 + T-celler (A) OT-II transgena djur korsades med djur som uttrycker den röda fluorescerande protein för att erhålla OT-II / Röd +celler. OT-II / Röd + celler isolerades från mjältarna hos OT-II / Röd transgena djur, färgade för CD4 och Vß5.1 och analyserades med flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: OVA-driven Transfer Colitis (A) Schematisk representation av den antigendriven kolit modell.. OT-II / Röd + CD4 + T CD62L + -celler adoptivt överförd in i CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - möss och värdar sondmatades varannan dag med E. coli pCFP-OVA. (B) Kroppsvikt av de angivna grupperna mättes två gånger i veckan. Medelvärde ± SEM förlust av kroppsvikt (%) presenteras. I Mann-Whitney-testp <0,05 ansågs statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. CX 3 CR1 + MPs Kommunicera med OT-II celler under OVA driven Transfer kolit (A) Kolon vävnadsprover undersöktes genom ex vivo 3D konfokala imaging i dag 7, 14 och 21 efter överföring av OT-II / Röd + CD4 + T CD62L + celler i CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mottagare. Förstoring 40X / 1,30. Skalstreck = 30 | im.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som med alla andra modell, kan den antigendrivna kolit modell som beskrivs ovan presenterar några frågor som utredaren utför tekniken måste vara medveten om. Vid injektion OT-II / Red + CD4 + T CD62L + celler i värdar, måste utredaren vara mycket försiktig och noga med att sätta in nålen in i bukhålan. Underlåtenhet att göra detta kan resultera i sönderslitning av tarmen hos musen som kan leda till döden, eller en subkutan administrering av celler som inte framkallar någon sjukdom.
Typiskt kommer möss upp i vikt under den första veckan efter cellöverföringen. Utredaren bör väga mössen samtidigt vid varje vikt tidpunkt och använda samma vägnings balans under hela förfarandet. Ibland de experimentella mössen, speciellt när deras vikt vid början av experimentet är under 18 g, utvecklar inte några tecken på den wasting syndrome. Emellertid dessa djur might fortfarande utveckla betydande tarminflammation enligt makroskopisk utvärdering.
När man arbetar med genetiskt modifierade bakterier kan föroreningar uppstå. För att undvika dessa problem är det starkt rekommenderat att kontrollera E. coli som uttrycker CFP-OVA med hjälp av fluorescerande mikroskop för att analysera om bakterierna är fluorescerande och är stavformade (den typiska E.coli form).
Den föreslagna antigen drivna kolit bygger på observationen att CX 3 CR1 + riksdagsledamöter provkommen luminala bakterier i steady state och under inflammatoriska tillstånd 36,37. Induktionen av T-celler svar i antigendrivna kolit modell har påvisats genom den starkt aktiverade fenotypen av OT-II CD4 + T-celler från kolon av CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - möss utmanade med antigenet, i jämförelse med de T-celler isolerade från CX 3 CR1 GFP / + x RAG
Konfokal avbildning tyder på att CX 3 CR1 + fagocyter ligger nära tarmepitelet så att de kan prova E. coli pCFP-OVA och interagera med OT-II / Röd + CD4 + T-celler. Efter CX 3 CR1 + fagocyter har prov E. coli pCFP-OVA den luminala antigen levereras till CD103 + dendritiska celler (DC) genom CX 3 CR1 + fagocyter. CD103 + DCs kan migrera till mesenteriala lymfkörtel (MLN) till prime CD4 T-celler 37,52. Primade T-celler samlas i CLP där CX 3 CR1 + fagocyter visar OVA antigen till effector T-celler för att inducera inflammation. Leverans och presentation av antigen genom CX 3 CR1 + fagocyter kan bli en viktig händelse i utvecklingen av kolit.
Förmågan att inducera kolit med en definierad bakterie som uttrycker ett specifikt antigen ger möjlighet att studera de nödvändiga förutsättningarna för utvecklingen av kolit 24. Modellen visar att ett specifikt svar på en antigen peptid (OVA uttrycks av E. coli) är tillräcklig för att inducera tarminflammation i RAG - / - värdar, vilket tyder på att T-celler kan reagera på specifikt antigen från tarmfloran. En enda antigen kan inducera intestinal inflammation i djurmodeller, men det kan inte förutsättas att enkla antigener är orsaken till human IBD. Dessutom i överförings kolit modellen finns naiva CD4 + T-celler som har okända specificitet och därför kan vara reaktiv till flera, än så länge oidentifierade antigener frånmikrobiota. Det behövs större analyser och undersökningar för att bättre klargöra rollen för ett specifikt antigen i patogenes av slemhinneinflammation.
Under senare år har användningen av olika djurmodell av kolit har lett till en expansion i kunskap om patogenesen av IBD 53. Men på grund av komplexiteten och patogenesen av sjukdomen, det finns inte en definitiv behandling 54. Användning av den beskrivna modellen är det möjligt att adressera flera aspekter av IBD som inte är väl klar ännu, såsom (i) interaktioner mellan monocyter och dendritiska celler, (ii) migrering av tarm DCs till MLN, (iii) antigenpresentation, (iv) homing av effektor-T-celler från MLN till lamina propria och (v) aktivering av effektor-T-celler i lamina propria av CX 3 CR1 + fagocyter. Dock ytterligare studier för att bekräfta om CX 3 CR1 + fagocyt / cell interaktion CD4 + T spelar en nyckelroll iIBD patogenes. Möss kan inte vara fullt representativt för människor och detta måste hållas i åtanke när musmodeller används för att studera human IBD 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan | ||
| DNase I recombinant | 4536282001 |
References
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
- Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
- Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
- Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
- Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
- Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
- Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111 (2011).
- Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
- Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
- Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
- Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
- Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
- Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
- Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
- Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
- Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
- Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
- Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
- Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
- Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
- Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
- Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
- van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
- Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
- Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
- Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
- Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
- Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
- Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
- Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
- Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
- Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
- Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
- Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
- Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
- Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
- Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
- Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
- Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
- Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
- Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
- Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404 (2012).
- Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).
