Bir Antijen odaklı Kolit Modelinin Geliştirilmesi Antijen T hücreleri için Hücreler sunulması ile Antijen Sunumu Eğitim için

Introduction

bağırsak dış ortama maruz vücudun büyük bir yüzeydir. yerleşik mikropların geniş diziler bağırsak Mikrobiyota (veya mikroflora) oluşturmak için insan bağırsağa kolonize. Bu kadar 100 trilyon mikrobiyal hücrelerin oluştuğu tahmin ve biyoloji ^1-3 bilinen en yoğun nüfuslu bakteriyel habitatların biri oluşturmaktadır. GIT bakteriler hayatta ve ⁴ çarpın bir bağırsak niş kolonize. Buna karşılık, Mikrobiyota genomu ¹ kodlanmış almayan ek fonksiyonel özellikleri ile ev sahibi endows. Örneğin Mikrobiyota, epitel hücrelerinin çoğalmasını uyarır kendileri tarafından ev sahipliği üretemez vitamin üretir, metabolizmasını düzenler ve patojenlere ^4-6 karşı korur. Bu yarar ilişkisi göz önüne alındığında, bazı yazarlar insanların bakteriyel ve insan genlerinin ^7,8 bir karışımı olan "süper organizmalar" veya "holobionts" olduğunu ileri sürmüşlerdir. (Insan) ana bilgisayarda Mikrobiyota yararlı etkileri göz önüne alındığında, intestinal bağışıklık sistemi lümen varlıklarını etkinleştirmek değil, aynı zamanda luminal kenarında ^9-11 istila patojenleri öldürmek için ortakçı mikropların tahammül gerekiyor. Bağırsak bağışıklık sistemi zararsız ve potansiyel olarak zararlı lümen mikroplar ayırt etmek mekanizmalar geliştirmiştir; Ancak bu mekanizmalar henüz tam olarak ¹² anlaşılamamıştır. Bağırsak bütünlüğünü korumak tolerans ve bağışıklık ¹³ arasındaki dengeyi korumak için sıkı regüle bağışıklık homeostazı gerektirir. Immün homeostasisin bir dengesizlik enflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), ^3,14 gibi bağırsak hastalıklarının indüksiyonu katkıda bulunur.

Crohn hastalığı (CD) ve ülseratif kolit (UC), iki büyük IBD tipi vardır. Bu hastalıkları olan hastalar genellikle rektal kanama, şiddetli ishal ve karın ağrısı ^15,16 muzdarip. IBD tek sebebi halagenetik faktörler, çevresel etkilere ve düzensiz immün yanıtın bilinmeyen, ama bir arada hastalık gelişimi ¹⁵ anahtar olay olabilir.

IBD için hayvan modelleri 50 yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır. Son birkaç yıl içinde yeni IBD model sistemler IBD ^17,18 patogenezinde ilişkin çeşitli hipotezleri test etmek için geliştirilmiştir. Kronik kolit en iyi karakterize edilmiş bir model T-hücresi homeostazında ^19,20 bozulmasını mukozada T-hücre transferi modelidir. ^16,21 Bu model T ve ^{(- / -} ve SCID farelerde bu RAG gibi) B hücreleri eksikliği konaklara bağışıklığı yeterli fareden naif T hücreleri aktarımı kapsamaktadır. Bu modelde hastalığın gelişimi vücut ağırlığı ishal varlığı, düşük fiziksel aktivite ve zarar değerlendirerek 3-10 hafta boyunca izlenir. Bu yüzden israf sendromu ¹⁶ olarak adlandırılır. Sağlıklı farelere kıyasla nakledilen konak kolon doku thicke olduğunur, daha kısa ve ¹⁶ ağır. T hücre transferi modelini kullanarak, T hücre popülasyonları IBD ²² patogenezinde nasıl katkıda bulunabileceğini farklı anlamak mümkündür. T hücre transferi modeli antijene özgü bir şekilde hastalık sürecinde APC ve T hücreleri arasındaki etkileşim analiz etmez. Miyeloid hücreler ve lenfoid hücreler arasında bir etkileşim bağırsak iltihabı ²³ gelişiminden sorumlu olabileceği gösterilmiştir. IBD pek çok açıdan açıklık olmasına rağmen, hastalık gelişmesine neden ilk olaylar hala net bir şekilde anlaşılması gerekir.

Bu Mikrobiyota transfer kolit yokluğunda gösterilmiştir ²⁴ tespit edilemez. Son zamanlarda, çeşitli teoriler İBH bakterilere ²⁵ karşı bir bağışıklık tepkisinin bir sonucu olabileceğini düşündürmektedir. Yazarlar ayrıca ortakçı bakteri uzak bağırsakta inflamasyon uyarmak için gerekli olduğunu önerdi^26. Germ bilgilerini (GF) hayvanlar intestinal immün sistemi genellikle ^27,28 bozulmuş, fakat tam yetkin bağırsak bağışıklık sisteminin ²⁹ geliştirilmesine özel patojen içermeyen bakteriler sonuç karışımı ile, bu farelerde bir kolonizasyon. Bu nedenle, Mikrobiyota yatkınlık veya bağırsak iltihabı ^30,31 gelişmesine karşı koruyan bir mekanizma olarak ya patogenezde önemli bir unsur olarak gözükmektedir. Güncel teoriler İBH genetik olarak yatkın hastalarda ^32, dysbiosis denilen mikrobiyal dengesizlik, bir sonucu olduğunu düşündürmektedir, ancak henüz belli değil dysbiosis neden veya hastalık ¹² sonucu ise. IBD gelişiminde mikroorganizmaların rolü dikkate alındığında, in vitro ^deneyler, CD4 ⁺ T hücreleri, bağırsak bakterileri ^33,34 ile doldurulan APC 'ler ile aktive edilebilir olduğunu göstermiştir.

Ayrıca, antijenlerin gösterilmiştirBöyle E. gibi farklı kommensal bakteri türleri, E. coli, Bacteroides, Eubacterium ve Proteus, CD4 ⁺ T hücrelerini aktive ³⁵ edebiliyoruz. Bu T hücrelerine bakteriyel antijenlerin sunumu IBD gelişimi için önemli olduğunu gösterir. Hastalık sürecinde mikroflorasının türetilen birden fazla antijene karmaşıklığını azaltmak için, bir E. coli suşu OVA antijen üreten oluşturuldu. ^{- / -} Transfer kolit RAG olarak OVA spesifik T hücreleri enjekte edilerek indüklendi hayvanların OVA eksprese eden E. ile kolonize E. coli.

Bu model CX ₃ CR1 ⁺ milletvekilleri, kolon lamina propria (CLP) ³⁶ büyük bir hücre alt kümesi, aktarım sırasında CD4 ⁺ T hücreleri ile etkileşim olduğunu düşündüren son kanıtlara dayanmaktadır ³⁷ kolit. Milletvekilleri kendi dendrit ^{36, 38,39} kullanılarak, bakteri gibi partikül antijeni için bağırsak lümen, örnek. Önceki çalışmalarMilletvekilleri ayrıca ^40,41 lümen intestinal sokulan gibi OVA olarak çözünür antijenler, sürebilir gösterdi. CLP CX ₃ CR1 ⁺ milletvekilleri bolluğu göz önüne alındığında, bu hücrelerin lümen bakterileri örnek ve CD4 T hücreleri ile etkileşim olması mümkündür. E. ile kolonize OVA'ya özel CD4 ⁺ T hücreleri ile transplante farelerin Konfokal görüntüleme E. coli CFP OVA CX ₃ CR1 ⁺ MP'ler antijen tahrik kolit gelişimi sırasında OT-II, CD4 ⁺ T hücresi ile temas içinde olduğunu göstermektedir. Bu model, bağırsak APC 'sadece bağırsak lümeninde özel bir antijen-ifade eden bakteriler için spesifik T hücreleri arasındaki antijen sunumu işlemi etüdüne olanak sağlamıştır.

Protocol

Fareler yetiştirilen ve Ulm Üniversitesi (Ulm, Almanya) hayvan tesisinde spesifik patojen free (SPF) koşullar altında tutuldu. Tüm hayvan deneyleri yerel hayvan kullanımı ve bakımı komitesi ve Ulusal Hayvan Refahı Kanunu kurallarına göre yapılmıştır.

PCFP OVA Plazmid 1. İnşaat

1. Ve plazmıd pCI-OVA (dayanıklı ampisilin) ​​bir şablon olarak kullanılması ⁴² primerleri Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') ve Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') ³⁷ ile tam boy OVA genini çoğaltmak. Belirli bir OVA-plazmid elde etmek için primerler ve vektör Spel ve Clal kısıtlama siteleri kullanılarak ticari olarak temin edilebilen faj orta vektörüne (OVA kodlayıcı sekansı IE) PCR ürünü klonlama.
2. Plazmid Pad ₁ kullanarak güçlü yapısal promotör P _hiper birlikte CFP-kodlama geni yükseltmek 43 ve CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') ^37.
3. Astar ve vektörü ³⁷ Spel ve SacI kısıtlama siteleri kullanarak belirli OVA-plazmid (ampisilin dirençli) içine CFP-kodlama geni klonlamak. Bu OVA-kodlayıcı sekanstan CFP kodlama arasında 6 glisin kalıntısı bir ara parçası sunar.

E.coli pCFP-OVA 2. İnşaat

1. Gece boyunca, döner bir karıştırıcı üzerinde 37 ° C 'de aerobik Luria Bertani (LB) ortamı, 100 ml E.coli DH10B suşu büyütün.
2. -80 ° C'de gliserol stokları ve mağaza oluşturmak için gliserol 200 ul bakteri kültürü 800 ul karıştırın.
3. LB ortamı 5 ml gliserol stokundan E.coli DH10B 50 ul ilave edin ve bir döner sallayıcı ove 37 ° C 'de aerobik büyümekrnight.
4. bir döner titremesi, 37 ° C'de LB ortamı 250 ml, saptırma plakalı 1 litrelik bir Erlenmeyer şişesi kültür aktarın.
5. 600 nm'de optik bir yoğunluğa kadar olan bakterilerin yetiştirilmesi (OD ₆₀₀₎ 0.5 ve daha sonra 30 dakika boyunca buz üzerinde kültüre soğuk. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüjleyin bakterileri.
6. Buzla soğutulmuş% 10 gliserol ve santrifüj bakteriler 100 ml 4 ° C'de yeniden süspanse bakteri 10 dakika boyunca 5000 x g'de buz soğukluğunda steril _H2O ve santrifüj bakterilerin 100 ml yeniden süspanse bakteriler, 10 dakika boyunca 5000 x g'de 4 ° C'de. İki kez bu son adımı tekrarlayın.
7. Son yıkama aşamasından sonra,% 10 gliserol, 700 ul bakteri tekrar süspansiyon. -80 ° C'de, sıvı azot ve deposunda 50 ul alikotları dondurun.
8. önceden soğutulmuş elektroporasyon küvetine (2 mm elektrot mesafesi) içine buz ve transfer bir 50 ul kısım Çözülme.
9. 50 ul E. plazmid DNA (100 ng) 5 ul ekle E. coli aliquots. 25 iF, 200 ohm (Ω) ve 2,5 kV tek bir darbe ile elektroporasyon gerçekleştirin.
10. 1 ml önceden ısıtılmış SOC ortamı (5 g / L maya ekstresi, 2g / L tripton, 10 mM sodyum klorid, 2.5 mM potasyum klorid, 10 mM magnezyum klorür, 10 mM magnezyum sülfat) yeniden süspanse bakteri ve 37 ° C'de inkübe aerobik 1 saat karıştırıldı.
11. LB-agar plakaları üzerinde Plaka bakteri ampisilin, 100 ug / ml (LB-agar 100 ml için 100 mg / ml ampisilin stokunun 100 ul) ve gece boyunca aerobik 37 ° C'de inkübe ile takviye edilmiştir.
12. ampisilin, 100 ug / ml ile takviye edilmiş LB-agar plakaları tek koloniler ve yeniden çizgi seç. gece boyunca aerobik 37 ° C'de inkübe edin.
13. Tek koloniler ve plasmid izolasyonu için amfisilin, 100 ug / ml ile takviye edilmiş LB ortamı 10 ml gecede büyür. Piyasada mevcut plazmid Mini hazırlık kiti kullanın ve 30 ul dH ₂ O (damıtılmış su) üreticiye göre 'ile plazmid DNA Zehir; s protokol. Sınırlama analizi ve DNA sekanslama ^37,42,43 Plasmidlerin edin.
14. E. pozitif klonların bir kültür kurmak LB ortamı 100 ml E. coli pCFP OVA ampisilin, 100 ug / ml ile takviye edilmiştir. bir döner çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 37 ° C'de Aerobik Olarak Büyüyen.
15. -80 ° C de, saf gliserol ve mağaza 200 ul bakteri kültürü 800 ul karıştırın.
16. Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 5000 x g'de, gece boyunca kültürün kalan santrifüj ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde pelletini. cam slayt üzerine süspansiyonu 10 ul yerleştirin ve bir lamel ile örtün.
17. CFP-OVA ekspresyonunun floresan (450 nm'de uyarma CFP, 480 nm emisyon) teyit etmek için standart bir floresan mikroskobu örnekleri dikkate alınmalıdır. büyütme 400X'lik ile başlayan bakteri analiz edin.
18. Santrifüj 10 dakika, oda sıcaklığında 5000 x g de bir gece kültürden bakteri 1 mi. 40 ul pelletiniPBS ve 10 dakika boyunca 95 ° C 'de kaynatın.
19. 10 dakika için 30,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri ve Western blot analizi ³⁷ için süpernatanlar kullanılması. 400: 1 oranında sulandırılmış tavşan kaldırdı OVA karşıtı poliklonal antikor kullanın.

OT-II 3. Nesil / Kırmızı Fare

1. OT-II / Kırmızı fareler ³⁷ üretmek amacıyla kırmızı floresan proteini ifade eden bir kadın / erkek fare ile bir erkek / kadın OT-II fare (hem suşlar piyasadan temin edilebilir) çapraz.

4. Dalak Hücre İzolasyonu

1. Herhangi bir halojenli eter soluma yoluyla anestezi sonrası servikal dislokasyon OT-II / Kırmızı fareler Euthanize piyasada mevcut (yukarı indüksiyon için% 5).
2. Farenin sol üstün karın bir bölümünü kesmek için makas kullanın. Bu karın kısmı altında dalak (koyu kırmızı renk ile oval) bulunmaktadır. kaldırmak için makas ve cımbız kullanın.
   1. OT-II / Kırmızı farelerin dalak ayıklayın ve bir 100 geçirinum hücre filtresi tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 1 ml şırınga pistonu kullanarak 50 ml'lik bir tüp yerleştirilmiştir. PBS ile iki kez 10 mi% 1 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile desteklenmiş süzgeç yıkayın.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 390 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj. Kırmızı kan hücreleri lize etmek için önceden ısıtılmış liziz tamponu (144 mM _NH4CI, 17 mM Tris, pH = 7.2) içinde 5 ml pelletini. 37 ° C'de 10 dakika kuluçkalayın.
4. PBS, 25 ml% 1 FBS ile takviye edilmiş numune yıkanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 390 x g'de santrifüjleyin. 10 ml PBS,% 1 FBS ile takviye pelletini.
5. Bir Neubauer sayım odası kullanarak hücreleri sayın. % 0,4 Tripan Mavisi solüsyonu 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın. 1-2 dakika boyunca inkübe edin.
   1. lekeli hücrelerin 10 ul hemositometre odasına doldurun. Dört 1 x 1 mm bir odacık ve determin ² kareler mikroskop altında hücreleri saymakkare başına hücrelerin ortalama sayısını e. Canlı hücreler beyaz, ölü hücreler mavi görünür görünür. hücrelerin sayısını belirlemek için / seyreltme faktörü ile hücre çarpın ml. 2-4 kadran sayılır yapılıyorsa, kadranın sayısına göre bölün.

5. CD4 ⁺ CD62 T ⁺ T Hücre Zenginleştirme

1. Negatif veya pozitif bir seçim prensiplerini kullanarak manyetik izolasyon kiti ile CD4 ⁺ CD62L ⁺ T hücreleri için dalak hücreleri zenginleştirmektedir. Burada, CD4 ⁺ T hücreleri izole ve daha fazla CD4 ⁺ T hücre havuzu içinde CD62L ⁺ nüfus için zenginleştirmek için olumlu bir seçim kullanmak için negatif bir seçim kullanın.
   Not: negatif seçim prosedürü, izole edilmiş olmayacaktır hücreleri, (burada bütün CD4 negatif hücreleri), manyetik mikro boncuklar ile birlikte özel antikorlar ile etiketlenir. Sütun yıkama adımları sırasında, EASİ olabilir, ^böylece, CD4 ⁺ T hücreleri, sütun üzerinden geçecekly topladı. pozitif seçim prosedürü hücrelerinde manyetik mikro-ile birleştiğinde uygun antikor ile etiketlenmiş izole edilmesi. Sütun yıkama adımları sırasında etiketli hücreler sütuna kalacak ve manyetik alandan kolon ayrılması ve tampon ile durulanarak toplanabilir.
2. Negatif seçim işlemi için,% 0.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile takviye edilmiş, soğuk PBS 40 ul 10 ^7, toplam dalak hücrelerinin yeniden süspanse edin. (Non-CD4 ⁺ T hücreleri spesifik bağlanma antikorları), 10, manyetik izolasyon kitiyle birlikte verilen biyotin etiketli antikor kokteylinin ul ekleyin ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edilir.
   1. soğuk PBS 30 ul,% 0.5 BSA ve anti-biyotin mikro-20 ul ile takviye ekleyin. Buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
   2. 10 ml PBS, 5 dakika boyunca 390 x g'de,% 0.5 BSA ve santrifüj ile takviye edilmiş numune ekleyin. İki kez bu adımı yineleyin. % 0.5 BS ile takviye edilmiş, soğuk 1 ml PBS hücrelerin tekrarA.
   3. Manyetik alan negatif seçim prosedürü için özel bir sütun yerleştirin ve soğuk PBS 3 ml ile yıkayın kolon üzerine% 0.5 BSA ile takviye edilmiştir. soğuk PBS 3 ml ile 3 kez sütun üzerine hücre süspansiyonu ekleyin ve yıkama,% 0.5 BSA ile takviye edilmiştir.
   4. 5 dakika boyunca 390 xg'de atık maddenin Santrifüj hücreleri. Sütun üzerinden Atık geçen etiketsiz CD4 ⁺ T hücreleri içerir. % 0.5 BSA ile takviye edilmiş 1 ml PBS pelletini ve hücreleri sayın.
   5. Bir Neubauer sayım odası kullanarak hücreleri sayın. % 0,4 Tripan Mavisi solüsyonu 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın. 1-2 dakika boyunca inkübe edin.
      1. lekeli hücrelerin 10 ul hemositometre odasına doldurun. Dört 1 x 1 mm bir odanın ² kareler mikroskop altında hücrelerin sayısı ve kare başına hücrelerin ortalama sayısını belirlemek. Canlı hücreler beyaz, ölü hücreler mavi görünür görünür. hücre / ml çarpma cel sayısını belirlemek içinseyreltme faktörü ile l numarası. 2-4 kadran sayılır yapılıyorsa, kadranın sayısına göre bölün.
3. Pozitif seçim prosedürü için, 10 ^7, önceden zenginleştirilmiş CD4 ⁺ T hücresi ürünü kesimi başına CD62L mikro-10 ul ekle. Buz üzerinde 15 dakika kuluçkalayın.
   1. 10 ml PBS, 5 dakika boyunca 390 x g'de,% 0.5 BSA ve santrifüj ile takviye edilmiş numune ekleyin. İki kez bu adımı yineleyin. Soğuk 500 ul PBS içinde süspanse% 0.5 BSA ile takviye edilmiştir.
   2. Manyetik alan negatif seçim prosedürü için özel bir sütun yerleştirin ve kolon üzerine% 0.5 BSA ile takviye edilmiş, soğuk 500 ul PBS ile yıkayın. Soğuk 500 ul PBS ile 3 kez sütun üzerine hücre süspansiyonu ekleyin ve yıkama,% 0.5 BSA ile takviye edilmiştir.
   3. manyetik alandan sütun çıkarın ve uygun bir toplama tüpü üzerine yerleştirin. Kolon üzerine% 0.5 BSA ile takviye edilmiş PBS 1 ml ilave edilir ve CD4 ⁺ CD62L ⁺ T hücresi çalkalayınsıkıca sütuna pistonu iterek sütunda tutulan s.
      Not: İzole CD4 ⁺ CD62L ⁺ T hücrelerinin hemen örneğin in vivo deneyler gibi akış aşağı uygulamalar için hazırdır. CD4 ⁺ CD62L ⁺ T hücreleri izole kiti imalatçının talimatına göre, mikro-toksik değildir. Küçük boyutu (yaklaşık 50 nm) nedeniyle, onlar hücreleri aktive yoktur ve onlar hücre yüzey epitoplarını doyurmak olmayacaktır. Bu nedenle izole edilmiş hücreler, kolit ^37,44,45 uyarılması için bağışıklık yetersizliği olan farelere aktarılabilir.
   4. Bir Neubauer sayım odası kullanarak hücreleri sayın. % 0,4 Tripan Mavisi solüsyonu 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın. 1-2 dakika boyunca inkübe edin.
      1. lekeli hücrelerin 10 ul hemositometre odasına doldurun. Dört 1 x 1 mm bir odanın ² kareler mikroskop altında hücrelerin sayısı ve kare başına hücrelerin ortalama sayısını belirlemek. Canlı hücreler appeabeyaz, ölü hücreler mavi görünür r. hücrelerin sayısını belirlemek için / seyreltme faktörü ile hücre çarpın ml. 2 Eğer - 4 kadran sayılır ediliyor, kadranın sayısına göre bölün.

Antijen odaklı Kolitin 6. İndüksiyon

1. ^{- / -} Farelerde CX ₃ CR1 ^{GFP / +} x RAG intraperitonal 3 x 10 ⁵ OT-II / kırmızı CD4 ⁺ CD62L ⁺ T hücreleri enjekte edilir. Antijene spesifik kolit, E. yönetmek E. coli pCFP OVA ön dişlerin arkasına sonda ya da ağızdan instilasyon ile, hayvan başına 100 ul PBS içinde 1 x 10 ⁸ koloni oluşturan birimi (CFU) bir dozda her iki günde bir.
2. haftada iki kez vücut nakledilen farelerin kilo ve klinik durumunu (farelerin dışkı, dışkı kıvamı ve aktivitede kan bulunması) izleyin.

Histopatolojik Sınav 7. Doku Örnekleri

1. inci doku örnekleri almakDaha önce ^36,46 açıklandığı gibi farelerin e kalın bağırsak, parafin nötr tamponlu formalin (% 10) ve embed düzeltmek.
2. Bölüm bir mikrotom üzerinde parafin örnekleri, kızaklar üzerinde monte ve H & E boyama ^47,48 gerçekleştirin.
3. Daha önce ^47,48 yayınlanan kalın bağırsağın histoloji kategorize: Normal (0 puan); Hafif kolit (1 puan), orta kolit (2 puan) ve şiddetli kolit (3 puan).

Kolon Lamine Propria Hücreleri 8. İzolasyon

1. piyasada mevcut servikal dislokasyon herhangi halojenli eter soluma yoluyla anestezi sonrası (indüksiyon için% 5) tarafından nakledilen fareler Euthanize.
2. karın yukarı bakacak şekilde hayvan aşağı gelecek şekilde yerleştirin. üretral açılış öne cildi kapmak için forseps kullanabilir. göğüs kasık ventral orta hat boyunca cildi kesmek için makas kullanın. tarafta cilt geri çekin.
3. şeffaf periton kas duvarından kesin vevücut boşluğuna açılması. Çekum ^49. anüs gider kolon tanımlayın. 2 ekstremitelerde kesin ve herhangi bir yağ dokusu serbest.
4. uzunlamasına bir diseksiyon makas kullanılarak kolon açın. PBS, 25 ml ihtiva eden bir petri enkaz ve mukus kaldırmak için% 1 FBS ile takviye edilmiş, kolon dokusu sallamak için cımbız kullanarak. 8 mm parçalar - 5 içine kolon kesin.
5. Yıkama Tamponu 20 ml içeren 50 ml'lik bir tüp içinde kolon bölümleri yerleştirin. Yıkama tamponu 500 mi DPBS, 10 mM HEPES ve 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içerir.
6. maksimum hızda 30 saniye boyunca tüp vorteksleyin.
7. 200 rpm'de 10 dakika boyunca çalkalama ile 37 ° C'de bir su banyosu içinde kolon bölümleri ile tüp inkübe edin.
8. İnkübasyondan sonra, maksimum hızda 30 saniye boyunca tüp vorteks.
9. Süpernatantlar atın ve Yıkama Tamponu 20 ml ihtiva eden yeni bir 50 ml tüp içinde doku örnekleri yerleştirin. Tekrarlayın 6-9 üç defa adımları
10. s atınupernatants PBS, 25 ml ihtiva eden bir petri doku örnekleri yerleştirin. Birkaç saniye kalan epitel hücreleri çıkarmak için petri yavaşça doku örnekleri sallamak için bir cımbız kullanın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
11. 2 x 2 mm ² parçalar halinde kolon dokuları kesin ve Roswell Park Memorial Institute (RPMI), Clostridium histolyticum'dan 0.5 mg / ml kollajenaz tip VIII ve DNasel 10 U / ml ortamı 10 ml kuluçkalama ile bunları sindiremez.
12. maksimum hızda 30 saniye boyunca tüp vorteksleyin.
13. 200 rpm'de 35 dakika boyunca çalkalama ile 37 ° C'de bir su banyosu içinde kolon parçacıkları inkübe ve maksimum hızda, 30 saniye, her 5 dakika boyunca tüp vorteks.
14. İnkübasyonun sonunda maksimum hızda 30 saniye boyunca tüp vorteks.
15. Yeni bir 50 ml tüp üzerinde bulunan bir 70 mikron hücre süzgecinden geçirilmesiyle sindirilmiş parçalarını toplamak.
16. 5 dakika boyunca 400 g'de 20 DPBS ile yıkanır ve santrifüj ekleyerek örnek yıkayın. Sonra tekrar süspansiyon tDPBS 1 ml o hücreleri.
17. Bir Neubauer sayım odası kullanarak hücreleri sayın. % 0,4 Tripan Mavisi solüsyonu 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın. 1-2 dakika boyunca inkübe edin.
    1. lekeli hücrelerin 10 ul hemositometre odasına doldurun. Dört 1 x 1 mm bir odanın ² kareler mikroskop altında hücrelerin sayısı ve kare başına hücrelerin ortalama sayısını belirlemek. Canlı hücreler beyaz, ölü hücreler mavi görünür görünür. hücrelerin sayısını belirlemek için / seyreltme faktörü ile hücre çarpın ml. 2-4 kadran sayılır yapılıyorsa, kadranın sayısına göre bölün.

FCM Analizi 9. Hücre dışı Boyama

1. Santrifüj 390 x g'de CLP hücreleri 5 dakika. FACS 1 ml hücrelerin tekrar (PBS,% 1 BSA ve% 0.1 sodyum azid ile takviye edilmiş)
   NOT: Sodyum azit son derece toksiktir. Bu hipotansiyon, hipotermi, baş ağrısı konvülsiyonlar veya ölüme yol açabilir. (0 sodyum azid seyreltik çözeltiler0,1% 1,0), genellikle kullanıcıya olağanüstü tehlike arz, ancak göz ve cilt tahriş edicidir yok. Bir laboratuvar önlüğü ve tek kullanımlık nitril eldiven çift çifti giyerek Bu nedenle, sadece kimyasal kaput sodyum azit kullanın.
2. FACS A'da seyreltildi FcyRIII / II CD16 / CD32 karşı yönlendirilen tek klonlu bir antikor (mAb) 2.4G2 (0.5-1 ug mAb / 10 ⁶ hücre) ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe hücreleri
3. 390 x g'de hücreleri ve santrifüj 5 dakika FACS A 200 ul ekleyin. İki kez bu adımı yineleyin. 0.5, 4 ° C'de 20 dakika hakkında mAb'nin / 10 ⁶ hücre ng hücreleri inkübe edin. FACS A'da antikorlar seyreltilir
4. 390 x g'de hücreleri ve santrifüj 5 dakika FACS A 200 ul ekleyin. İki kez bu adımı yineleyin. FACS A 100 ul numuneler yeniden süspanse
5. CX ₃ T hücreleri analiz CR1 ^{GFP / +} x RAG ^{- / -} OT-II / ³⁷ akış sitometresi Red CD4 T hücreleri ile yeniden fareler.

10. Konfokal Mikroskop Analizi

1. OT-II / Kırmızı CD4 ⁺ CD62L ⁺ T hücre ile yeniden veya CX ₃ CR1 ^{GFP / +} farelerin kolon Analiz ve E. 1 x 10 ⁸ CFU ile her ikinci gün ağızdan beslenir coli suşu DH10B pCFP OVA.
2. makas ve cımbız kullanarak farelerden alınan kolon çıkarın. uzunlamasına bir diseksiyon makas kullanarak açın.
3. makas kullanılarak kolon örnek bir 5-8 mm parça kesin, cam slaytlar üzerine koymak ve lamelleri ile kaplayın.
4. 40 / 1.30 büyütülerek konfokal mikroskop ile kolon örnekleri analiz edin.
5. 509 nm'de 488 nm 'de bir eksitasyon ve emisyon ile belirlenen bir filtre kullanılarak, yeşil floresan proteini (GFP) ile etiketlenmiş CX ₃ CR1 ⁺ milletvekillerine algılar.
6. 58 C 554 nm 'de bir eksitasyon ve emisyon ile belirlenen bir filtre kullanılarak kırmızı proteini eksprese eden CD4 ⁺ T hücresi Algılama6 nm.
7. 480 nm'de 450 nm 'de bir eksitasyon ve emisyon ile belirlenen bir filtre kullanılarak E. coli pCFP-OVA algılar.
8. Ilgi alanı tanımlayabilir ve daha önce co-lokalizasyon analiz yürütmek için ⁵⁰ açıklandığı gibi dağılım diyagramları oluşturmak. Manders ve Pearson Katsayısı göre Overlap katsayısı: 2 farklı formüller kullanın.

Representative Results

Antijen tahrik kolit modeli, bir E. kurmak coli suşu güçlü yapısal promotör P _hiper (Şekil 1A) kontrolü altında ifade edilir CFP gen tavuk ovalbümin proteininin füzyon yapısı için kodlama dizisine kaynaşmış olduğu bir plazmidi içeren inşa edilmiştir. Floresan mikroskopi gösterir Rekombinant E. E. coli pCFP OVA, fakat ana E. E. coli DH10B, CFP (Şekil 1B) ifade eder. E. üreten CFP-OVA E. coli, in vitro olarak OT-II hücrelerini aktive ederek ve bir E. aksine IFN-γ üretimini teşvik edebilen CFP ifade coli suşu sadece (Şekil 2). Şekil 3A E. ile beslenen CX ₃ CR1 ^{GFP / +} fareler kolonik doku ex vivo 3D konfokal görüntüleme gösterir E. coli pCFP OVA. E. E. coli pCFP OVA canepitel hücreleri ve bağırsak yakın bulunan kolon crypts içinde tespit edilebilir CX ₃ CR1 ⁺ fagositler ile co-lokalize. E. göreceli oranını belirlemek için, E. coli pCFP OVA ₃ CR1 ⁺ fagositler, mavi ve yeşil floresans yoğunluğu dağılım blot ile belirlenmiştir tanımlanan CX tarafından içselleştirilmiş. Analiz CX ₃ CR1 ⁺ hücrelerinin E. 11.9 ± 1.5% örneklenmiş ortaya E. coli pCFP OVA kolonda. OT-II'de (Şekil 3B) / Kırmızı hayvanlar tespit, CD4 ⁺ T hücreleri Kırmızı ifade ve Vβ ile karakterize edilir flow sitometri (Şekil 4) ile gösterilen 5.1 ifadesi. Şekil 5A genel bir gösterir antijen tahrik kolit modeli. OT-II / Kırmızı ^+, CD4 ⁺ T CD62L ⁺ hücrelerin adoptively CX ₃ aktarılmıştır CR1 ^{GFP / +} x RAG ^{- / -} daha sonra E. ile her ikinci gün zorla ağız yolundan verilmiştir edildi alıcılarıE. coli pCFP OVA. E. ile karşılaştıklarında E. coli pCFP OVA, CX ₃ transfer CR1 ^{GFP / +} x RAG ^{- / -} fareler vücut kilo ve kolit (Şekil 5B) klinik belirtilerini geliştirmek 6 gösterileri ex vivo 3D kolon dokusunda 7, 14 ve 21 gün sonra konfokal görüntüleme Şekil. heterozigot CX sulandırma ₃ CR1 ^{GFP / +} x RAG ^{- / -} OT-II ile alıcıları / Kırmızı ⁺ hücreleri E. ile meydan E. coli pCFP OVA. Yedi gün hücre transferinden sonra yalnızca birkaç CX ₃ CR1 ⁺ fagositler E. örneklenmiş E. coli pCFP OVA ve OT-II / Kırmızı ⁺ hücreleri tespit edilememiştir. Hücre transferinden sonra on dört gün, CX E. örneklenmiş ₃ CR1 ⁺ fagositler E. coli pCFP OVA OT-II yakın / Kırmızı ⁺ hücreleri bulunurdu. Yirmi bir gün hücrede sonra E. örneklenmiş ₃ CR1 ⁺ hücrelerinin CX sayısının yüksek aktarmak E. coli pCFP OVA ve OT-II / Ryakın CLP boyunca dağılmış ed ⁺ hücreler, ₃ CR1 ⁺ fagositler CX için.

Şekil 1: CFP-OVA Üreten E. İlgili kısıtlama siteleri ile pCFP-OVA coli. (A) Harita, OVA ve parlak mavi floresan proteini OBP kodlayan gen. (B) Aydınlık alan ve yabani tip E. floresan mikroskobik görüntüleri E. coli DH10B E. E. coli DH10B pCFP E. E. coli DH10B pCFP OVA. Ölçek çubuğu:. 10 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: OTCFP-OVA ile uyarılmış -II Hücreler IFN-y üretin. Dalak izole sonra, OT-II hücreleri E. belirtilen numaraları ile uyarıldı E. coli DH10B pCFP OVA. Bakteriyel hücreler 5 ug / ml gentamisin ile 2 saat kuluçkadan sonra inaktive edildi. kültür, 72 saat sonra, süpernatanlar toplanmış ve IFN-γ konsantrasyonları ELISA ile tespit edilmiştir. Deneyler ortalama ± SEM olarak sunulan üç kez ve veri yürütülmüştür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: CX ₃ CR1 ⁺ Fagositler Numune E. E. coli pCFP OVA. (A) CX ₃ CR1 CLP doku^{GFP / +} fareler 1 x 10 ⁸ E. zorla ağız yolundan verilmiştir E. coli pCFP OVA 7 gün ve ex vivo konfokal mikroskobu ile analiz edilmiştir. Büyütme 40X / 1.30. Ölçek çubuğu 30 mikron =. (B) içselleştirilmiş E. yüzdesi E. coli pCFP OVA hesaplanır ve veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Mann-Whitney testi p <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:. OT-II / kırmızı ⁺ CD4 ⁺ T hücrelerinin Karakterizasyonu (A) OT-II transgenik hayvanlar, OT-II elde etmek için kırmızı flöresanlı proteinin ifade hayvanlarla çaprazlandı / Kırmızı ⁺Hücreler. OT-II / kırmızı ⁺ hücreleri OT-II / kırmızı dalaklarından izole edilmiştir transgenik hayvanlar, CD4 ve Vß5.1 için lekeli ve flow sitometri ile analiz edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: OVA odaklı transfer kolit (A) antijeni tahrik kolit modelinde şematik temsili.. E. ile fareler ve ana zorla ağız yolundan verilmiştir edildi her ikinci gün ^{- / -} OT-II / Kırmızı ^+, CD4 ⁺ T CD62L ⁺ hücrelerin adoptively ₃ CR1 ^{GFP / +} x RAG CX aktarılmıştır E. coli pCFP OVA. Belirtilen grupların (B) vücut ağırlığı haftada iki kere ölçülmüştür. ± SEM vücut ağırlığı kaybı (%) ortalama sunulmuştur. Mann-Whitney testi olarakp <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6:. CX _3, CR1 ⁺ MP'ler OVA odaklı transfer kolit esnasında OT-II hücrelerin ile iletişim (A), kolon doku örnekleri OT-II / kırmızı transferi gün sonra 7, 14 ve 21 'ex vivo 3D konfokal görüntüleme ile incelendi ^{/ - -} alıcıları CX ₃ CR1 ^{GFP / +} x RAG içinde ^+, CD4 ⁺ T CD62L ⁺ hücreler. Büyütme 40X / 1.30. Ölçek çubuğu 30 mikron =.

Discussion

her modelde olduğu gibi, yukarıda tarif edilen antijen odaklı kolit modeli tekniği gerçekleştiren araştırmacı farkında olmalıdır birkaç sorunları ortaya çıkabilir. OT-II hosts / Kırmızı ^+, CD4 ⁺ T CD62L ⁺ hücreleri enjekte zaman araştırmacı periton boşluğuna iğneyi çok nazik ve dikkatli olmak gerekir. Aksi takdirde, ölüme yol açabilecek bir fare ya da bir hastalık oluşturmak olmaz hücre deri altına bağırsak yırtılabilir.

Tipik olarak, fareler, hücre transferinden sonra ilk haftasında ağırlık kazanacaktır. Araştırmacı her kilo zaman noktasında aynı anda fareler tartmak ve tüm işlem boyunca aynı tartı denge kullanmalıdır. Bazen deneysel fareler, deney başında kendi ağırlığı 18 gr altında, özellikle israf sendromu herhangi bir belirti ortaya çıkmaz. Bununla birlikte, bu hayvanlar might hala makroskopik değerlendirme aşamasındadır önemli bağırsak iltihabı gelişir.

Genetiği değiştirilmiş bakteriler ile çalışırken, bulaşmalar oluşabilir. Son derece bakteri çubuk şeklindeki (tipik E.coli şekli) floresan ve eğer analiz etmek için floresan mikroskop kullanılarak CFP-OVA ifade eden E.coli kontrol edilmesi tavsiye edilir bu sorunları önlemek için.

Önerilen antijen tahrik-kolit gözleme dayanıyor kararlı halde ve inflamatuar durumlar ^36,37 sırasında CX ₃ CR1 ⁺ milletvekilleri örnek ortakçı luminal bakteriler. Antijen tahrik kolit modelinde T hücrelerinin tepkileri indüksiyonu CX ₃ CR1 ^GFP kolon ^OT-II, CD4 ⁺ T hücreleri için yüksek ölçüde aktif bir fenotip ile gösterilmiştir ^{/ +} x RAG ^{- / -} antijen ile tehdit fareler, CX ₃ CR1 ^{GFP / +} x RAG izole edilen T hücreleri ile karşılaştırıldığında 37 ile meydan değil fareler> kadar. ^{- / -} Farelerde, ana OVA-eksprese eden E. aşılandığında kolit, sadece indüklenmiştir Bu önceki çalışmalarda, bez OT-II T hücrelerinin adoptif nakli sonrasında tutarlı E. coli ^51.

Konfokal görüntüleme onlar E. tadabilirsiniz böylece CX ₃ CR1 ⁺ fagositler bağırsak epiteli yakın konumda olduğunu göstermektedir E. coli pCFP OVA ve OT-II / kırmızı ^+, CD4 ⁺ T hücreleri ile etkileşime girer. CX ₃ CR1 ⁺ fagositler E. örneklenmiş sonra E. coli pCFP OVA luminal antijen CX ₃ CR1 ⁺ fagositler tarafından CD103 ⁺ dendritik hücrelerin (DC) teslim edilir. CD103 ⁺ DC'ler asal CD4 T hücrelerinin ^37,52 mezenterik lenf nodu (MLN) göç edebiliyoruz. Hazırlanan T hücreleri CX ₃ CR1 ⁺ fagositler e OVA antijen göstermek CLP toplanacakffector T hücreleri inflamasyonunu indüklemek amacıyla. CX tarafından antijenin teslim ve sunum ₃ CR1 ⁺ fagositler kolit gelişiminde önemli bir olay olabilir.

Belirli bir antijeni ifade eden bir tanımlanmış bakteri kolit ikna yeteneği kolit ²⁴ gelişmesi için gerekli koşulları incelemek için fırsat sağlar. T hücreleri, bağırsak mikroflorası belirli antijene tepki olduğunu düşündürmektedir, ana ^{- / -} Bu model, bir antijenik peptit (E. coli tarafından eksprese edilen OVA) için belirli bir tepki RAG bağırsak iltihabı oluşturmak için yeterli olduğunu göstermektedir. Tek bir antijen hayvan modellerinde intestinal inflamasyonu neden olabilir ancak tek antijenler insan IBD neden olduğu kabul edilemez. Ayrıca, transfer kolit modelinde henüz tanımlanmamış antijenlerin, birden çok reaktif olabilir ve bu yüzden bilinmeyen özgüllüğe sahip ve naif CD4 ⁺ T hücrelerinden, oradaMikrobiyota. Başlıca analiz ve çalışmalar daha iyi mukozal inflamasyon patogenezinde spesifik antijen rolünü açıklığa kavuşturmak için ihtiyaç vardır.

Son yıllarda, kolit, farklı hayvan modelinin kullanımı, IBD ⁵³ patogenezinde bilgisi bir genişlemeye yol açmıştır. Karmaşıklığına ve hastalığın patogenezinde nedeniyle Ancak, kesin bir tedavi ⁵⁴ yoktur. açıklanan modeli kullanarak, bu tür monositler ve dendritik hücreleri arasındaki (i) etkileşimlerin yanı sıra henüz açıklık bulunmayan IBD çeşitli yönlerini ele almak mümkündür, MLN bağırsak DC'lerin (ii) göç, (iii) antijen sunumu, CX ₃ CR1 ⁺ fagositler lamina propria lamina propria ve efektör T hücrelerinin (V) aktivasyonuna MLN efektör T hücrelerinin (IV) hedef arama. Ancak, ileri çalışmalar CX ₃ CR1 ⁺ fagosit / CD4 ⁺ T hücre etkileşimi önemli bir rol oynadığı onaylamak için gerekli olanIBD patogenezi. Fareler insan gerçek temsilcisi olamaz ve fare modelleri insan IBD ² incelemek için kullanıldığında bu akılda tutulmalıdır.