Summary
De belangrijkste stappen van levende anionische polymerisatie van fenylglycidylether (PheGE) met methoxy-polyethyleenglycol (MPEG- -PPheGE b) worden beschreven. Het verkregen blokcopolymeer micellen (BCMS) werden beladen met doxorubicine 14% (gew%) en aanhoudende afgifte van geneesmiddel gedurende 4 dagen onder fysiologisch relevante omstandigheden werd verkregen.
Abstract
In deze studie, een amfifiel copolymeer met een kernvormende blok met fenylgroepen bevat werd gesynthetiseerd door levende anionische polymerisatie fenylglycidylether (PheGE) met methoxy-polyethyleenglycol (MPEG- b -PPheGE). Karakterisering van het copolymeer toonde een nauwe molecuulgewichtsverdeling (PDI <1,03) en bevestigd de polymerisatiegraad van mPEG 122 - b - (PheGE) 15. De kritische micel concentratie van het copolymeer werd geëvalueerd via een vastgestelde fluorescentiemethode het aggregatiegedrag geëvalueerd door dynamische lichtverstrooiing en transmissie elektronische microscopie. Het potentieel van het copolymeer voor toepassing bij geneesmiddelafgifte aanvragen geëvalueerd voorbereidingen getroffen zoals in vitro biocompatibiliteit, belading en afgifte van het hydrofobe geneesmiddel tegen kanker doxorubicine (DOX). Een stabiele micellen formulering van DOX werd bereid met geneesmiddelbelading concentraties tot 14% (gew%), geneesmiddelbelading efficiranten> 60% (w / w) en aanhoudende afgifte van geneesmiddel gedurende 4 dagen onder fysiologisch relevante omstandigheden (zure en neutrale pH, aanwezigheid van albumine). Het hoge drug beladingsgraad en vertraagde afgifte wordt toegeschreven aan het stabiliseren van π-π interacties tussen DOX en de kern vormen blok van de micellen.
Introduction
In waterige media, amfifiele blokcopolymeren assembleren nanoformaat blokcopolymeer micellen (BCMS) die bestaan uit een hydrofobe kern omgeven door een hydrofiele schil of corona vormen. De micel kern kan dienen als reservoir voor het opnemen van hydrofobe geneesmiddelen; terwijl de hydrofiele corona biedt een interface tussen de kern en het externe medium. Poly (ethyleenglycol) (PEG) en zijn derivaten zijn een van de belangrijkste klassen van polymeren en één van de meest gebruikte geneesmiddelformulering. 1-3 BCMS hebben bewezen een waardige medicijnafgifteplatform met verschillende samenstellingen te vertrouwen op dit punt technologie nu in een vergevorderd stadium van klinische ontwikkeling. 4 meestal het hydrofobe blok van het copolymeer bestaat uit polycaprolacton, poly (D, L-lactide), poly (propyleenoxide) en poly (β-benzyl-L-aspartaat). 5 -9
Kataoka de groep onderzochte bolvormige micellen gevormd uit PEO- b b -. (Polyasparaginezuur-geconjugeerd doxorubicine) voor afgifte van doxorubicine (DOX) 10,11 In hun verslagen Zij stelden dat π-π interacties tussen het polymeer-geconjugeerde geneesmiddel of PBLA en vrij DOX handelen om de micel kern leidde tot een verhoging geneesmiddelbelading en retentie stabiliseren. Er is vastgesteld dat de verenigbaarheid of interacties tussen een geneesmiddel en de kern vormblok zijn determinanten van key performance parameters. 12 Naast DOX, een aantal kanker therapeutica omvatten aromatische ringen in hun kernstructuur (bijvoorbeeld methotrexaat, olaparib, SN -38).
Daardoor is er aanzienlijke belangstelling voor de synthese van copolymeren die benzyl ringen in hun kern vormende blokken. Anionische ringopeningspolymerisatie van PEG en zijn derivaten mogelijk controle over het molecuulgewicht en resulteren in materialen van lage polydispersiteit in goede opbrengst. 13,14 Ethylene oxide met fenylglycidylether (PheGE) of styreen oxide (SO) kan worden (co) polymeriseren tot blokcopolymeren die micellen vormen voor het oplossen van hydrofobe geneesmiddelen vormen. 15-18 Het huidige rapport beschrijft de nodige stappen voor het leven anionische polymerisatie van fenyl glycidyl ether monomeer op mPEG-OH als macro-initiator (figuur 1). Het verkregen blokcopolymeer en aggregaten worden vervolgens gekarakteriseerd met betrekking tot eigenschappen die relevant zijn voor gebruik in geneesmiddelafgifte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figuur 1. Schematische voorstelling toont de negen belangrijkste stappen in de voorbereiding van de MPEG-b -PPheGE copolymeer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Voorbereiding van de reagentia onder droge omstandigheden
- Bereiding van reagentia.
- Weeg 15 g mPEG-5K (Mn = 5400 g / mol, 1,03 PDI) en plaats bij 50 ° C in een oven onder vacuüm gedurende 48 uur voor gebruik.
- Droge 200 ml dimethylsulfoxide (DMSO) over calciumhydride (CaH2) (~ 1 g), plaats onder vacuum gedurende 30 min, spoelen onder argon en roeren 48 uur vóór gebruik.
- Plaats 50 ml van de PheGE monomeer in een droge en schone fles (100 ml), voeg 1 g CaH2, verbinding onder vacuüm gedurende 15 min op ijs, zuivering onder argonen laat roeren gedurende 24 uur onder argon voor gebruik.
2. Voorbereiding van de Kalium Naphthalene
- Voorzichtig gesneden kleine stukjes natrium (~ 1,5 g) gedroogd met hexaan om de overmaat minerale olie te verwijderen en voeg aan de ronde kolf met de tetrahydrofuran (THF) (v = 500 ml).
LET OP: De brokken van natrium mag niet worden blootgesteld aan de lucht voor een lange vanwege het risico op brand. - benzofenon (~ 5 g), purge toe te voegen met argon en sluit de ronde kolf (2 halzen) met glazen stoppen.
- Na roeren onder argon gedurende 24 uur, sluit de rondbodemkolf een destillatie-inrichting (figuur 2), destilleren donkere oplossing onder argon onder reflux (dwz terugvloeikoeling gedurende ongeveer 2 uur periode na de oplossing wordt blauw). Beginnen om het gewenste volume te verzamelen ~ 150 ml THF door het sluiten van de klep links (in het midden van de destillatie-inrichting).
LET OP: Als deze oplossing niet blauw wordt, stop de Distilning, afkoelen bij kamertemperatuur (RT) en voeg meer benzofenon of natrium en de destillatie opnieuw op. Dit is een indicatie dat THF bevat nog steeds water. - In droge conische kolf gedestilleerd THF (v = 100 ml) en los 3,9 g naftaleen.
OPMERKING: Stop de destillatie, afkoelen bij kamertemperatuur en open de rechter klep om het volume van THF dragen. - Zoals beschreven in punt 2.1, gesneden kleine stukjes van kalium (1,1 g) en toe te voegen aan de oplossing die het naftaleen (eindconcentratie ~ 0,3 mol / l). Verzegel de kolf met een spoeling adapter (T) (aan / uit) met een septum aan de bovenkant en spoelen met argon.
- Na roeren onder argon gedurende 24 uur, observeer de resulterende oplossing van kalium naftaleen base als homogene donkergroene kleur.
- Onder inerte omstandigheden, verwijdert een 5 ml aliquot van de basische oplossing uit de fles met een spuit en voeg aan 10 ml gedestilleerd water. Vervolgens voeg 1-2 druppels fenolftaleïne indicator voor deze oplossing,die blijkt de oplossing een fuchsia kleur.
- Gebruik een buret aan het kalium- naftaleen oplossing met een standaard zoutzuuroplossing (0,1 N) tot de kleur omslaat kleurloze titreren.
3. Materialen en de nodige voorzorgsmaatregelen voor effectieve Living anionische polymerisatie
- System argon / vacuüm spruitstuk.
LET OP: Zoals beschreven in figuur 2, is een dubbele glazen verdeler met isolerend glas kranen gebruikt om te schakelen tussen argon levering en vacuüm omstandigheden in het glaswerk.- Sluit de tank van argon (met manometer) tot een droge droogmiddel kolom en het spruitstuk lijn met behulp van inerte rubber slangen. Aan het andere uiteinde van de argon lijn, sluit u een bubbler (minerale olie).
- Om de glazen kranen, sluit flexibele inerte buizen en naalden. Om de andere lijn van het spruitstuk, sluit u een glas val ondergedompeld in een koude Dewar kolf (gevuld met ijs / water of vloeibare stikstof) tot een hoge vacuümpomp.
- Inrichting voor destillatie van monomeer en DMSO.
OPMERKING: Een handige (dwz alle in een) inrichting voor hoge vacuümdestillatie wordt toegepast (figuur 2). De droge glaswerk is gemaakt met hoog vacuüm kleppen, en ingebouwde condensors met een inwendige gekoelde kop.- Verbinding waterstroming door de inlaat (A) en uitlaat (B) van de koeleenheid (letter). Sluit de andere ingang / uitgang (C) aan de dubbele verdeelstuk argon / vacuüm. Toe te voegen en te verzegelen een septum (metalen draden) aan de levering / extractie-poort en sluit een roestvrij stalen canule voor de overdracht van de lucht gevoelige vloeistoffen (D) (bovenaan / lus).
- Vóór polymerisatie destilleren PheGE en DMSO op hemisferische verwarmingsmantels bij 100 ° C en 70 ° C respectievelijk gedurende 2 uur onder vacuüm roeren. De PheGE monomeer kookpunt is 254 ° C, terwijl het kookpunt van DMSO is 189 ° C (1 atm).
- Glaswerk voor anionische polymerization.
- Naast het destillatiesysteem, alleen hoge vacuümbestendig glaswerk waaronder rondbodemkolven (gecertificeerd door de fabrikant), maatcilinders (voor de overdracht van volumes oplosmiddel, base en monomeren), canules, septa en metaaldraden de septa dichten.
OPMERKING: Bij levende polymerisatie, warmte voorzichtig (onder vacuüm) en het glaswerk afkoelen onder argon stroom voor gebruik. Houd het warmtepistool op afstand ~ 10 cm van het glaswerk.
- Naast het destillatiesysteem, alleen hoge vacuümbestendig glaswerk waaronder rondbodemkolven (gecertificeerd door de fabrikant), maatcilinders (voor de overdracht van volumes oplosmiddel, base en monomeren), canules, septa en metaaldraden de septa dichten.
Figuur 2. Montage en key destillatie / overdracht stappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.4. Beschrijving van de belangrijkste stappen van de levens- anionische polymerisatie: destillatie en Transfer
- Weeg mPEG-5K (2 mmol, 10 g) in een droge fLask / Schlenk (oven) met een roerstaaf en sluit de blozen adapter (T) (aan / uit) met een septum aan de top.
- Verbind de kolf met het spruitstuk en zuiveren de kolf gedurende 2-3 min met argon flushes. Draai de klep om het vacuüm positie om de kolf te spoelen.
- handmatig Draai de kolf en droog het reactievat homogeen met een föhn (warmte kanon) tot mPEG-5K smelt.
LET OP: Houd de warmte kanon op een afstand ~ 10 cm uit de kolf. - Na 1 min, breek het vacuüm door de klep op het verdeelstuk naar de positie argon meerdere snelle drukknopen.
OPMERKING: Een continue stroom argon heeft in de bubbler in acht te nemen. Wanneer de stroom continu de klep blijft het argon positie. Herhaal verwarming en koeling stappen tweemaal om alle sporen van vocht te verwijderen. - Houd de polymere macro-initiator onder vacuüm ~ 2 uur en onder argon voordat de reactie begint.
- Mount twee high vacuümdestillatie apparaten onder de motorkap (Figure 2); een voor de destillatie van DMSO en een voor de destillatie van het monomeer (PheGE).
- Sluit de afzonderlijke kolven met de DMSO en monomeer tot de twee inrichtingen en plaats elk op een hemisferisch verwarmingsmantel (of in een oliebad). Verbinding koud water naar de top van de inrichting (in / uit) en het verdeelstuk (argon / vacuüm).
- Zorg ervoor dat elk apparaat is veilig en goed afgesloten. Schakel het vacuüm via de klep.
Opmerking. Zoals beschreven in stap 3,3, herhalen verwarming en koeling stappen tweemaal om alle sporen van vocht te verwijderen. - Zet de verwarming via een temperatuurregelaar en start roeren van de oplossing. Na 2 h circulatie / destillatie van DMSO, sluiten de hoge vacuümklep (in het midden van het destillatietoestel) tot ongeveer 20 ml oplossing te verzamelen (aan de binnenkant van de inrichting te wassen). Laat dan de fractie in de kolf en herhaal de handeling nog een keer om de zuiverheid van de gewenste fractie die c ervoor te zorgenlater ollected.
- Verhit de kolf met de MPEG-5K (onder vacuüm) met de hitte pistool totdat het polymeer (MPEG-5K) smelt. Spoel opnieuw met argon.
Opmerking: De procedure kan de ontbinding na de overdracht van de DMSO. - Na 2 uur, sluiten de hoge vacuümklep en verzamel de hoeveelheid oplosmiddel (DMSO = V ~ 100 ml). Stop dan het verwarmen en breek het vacuüm van het spruitstuk. Vrij argon (met drukknopen) in de kamer zoals hierboven beschreven.
- Onder een positieve druk van argon, sluit één zijde van de canule (hold op de plugkraan van het apparaat) naar een maatcilinder of rechtstreeks aan de kolf die de mPEG-5K (indien het destillatietoestel heeft graduatie) en dompel het andere uiteinde voorzichtig in de vers gedestilleerde fractie.
- Met argon druk, drijven de DMSO via de canule in de reactiekolf. Sluit een extra bubbler aan de kolf (of cilinder als dat nodig is voor de meting) en sluit het kraantje glas verbonden aan The bubbler aan de andere kant van het verdeelstuk.
LET OP: Wanneer de ene kant van een canule wordt verwijderd voor de overdracht, zorg ervoor dat de positieve argon druk wordt uitgeoefend. - Om ongelukken door argondruk vermijden, opent de afsluiter voor het glas 1-2 seconden en hersluiten om de stroom van DMSO (0,5 keer herhaald per minuut) totdat de volledige overdracht is voltooid. Open de kraan als u klaar bent.
OPMERKING: Dezelfde procedure moet nu worden gevolgd voor distillatie en het verzamelen van het monomeer. Het oplosmiddel en monomeer niet kan worden uitgevoerd op hetzelfde moment. - Transfer 5 ml van 0,3 M naftaleen kalium via infusen in een maatcilinder afgesloten door een septum met canule (loop).
OPMERKING: Dezelfde voorzorg zoals beschreven in toelichting 4.13. Positieve argondruk eerst uit naftaleen kalium kolf aan cilinder en vervolgens onderhouden van de cilinder aan de reactiekolf lucht / water voorkomen. - Plaats een andere naald uit de manifold in de cilinder (argon). Verwijder de canule verbonden met het destillatiesysteem voorzichtig en plaats snel in de reactiekolf.
OPMERKING: Gebruik deze techniek voor de overdracht van de basis en het monomeer. - Voeg de basis druppelsgewijs tot de oplossing donker. Naar aanleiding van de langzame verdwijning van kleur, voeg een ander deel tot de donkere kleur weer verschijnt, en herhaal tot de volledige overdracht.
- Breng de gewenste hoeveelheid monomeer (V PheGE = 5 ml) met een polymerisatiegraad van PPheGE ~ n = 18-20 bereiken.
- Laat de reactie gedurende 48 uur bij 80 ° C onder argonatmosfeer onder constant roeren om volledige polymerisatie te waarborgen.
- Schrik de reactie af door toevoegen van druppels HCl 1 N in methanol (gemeten met lakmoespapier (neutrale pH)) en geobserveerd door een kleur verdwijnen.
- Pak het naftaleen uit de DMSO-oplossing met hexaan (3 x 50 ml). Verwijder de DMSO door destillatie onder vacuüm ~ 70 ml (dezelfde apparatuur). kirrenl langs de slurry-oplossing en voeg 50 ml van THF.
- Verwijder het zout uit de suspensieoplossing door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 10 min. Breng de supernatant en voeg druppelsgewijs aan 500 ml koude diethylether.
- Verzamel het neerslag door filtratie of centrifugatie (tweemaal herhalen) en droog onder vacuüm bij 30 ° C gedurende 24-48 uur (opbrengst 85%).
OPMERKING: De copolymeer is nu klaar voor karakterisering.
5. Karakterisering van copolymeren
- Weeg 5-10 mg van copolymeer (dossier van de werkelijke massa) in een aluminium monster pan en sluit hermetisch met de aluminium deksel. Load sample pan en referentie-pan (leeg) in de differentiële scanning calorimeter.
- Programma werkwijze ( "verwarmen / koelen / verwarmen") cyclus: 1) verwarmen van 40 ° C tot 100 ° C bij 10 ° C / min, 2) afkoelen tot -70 ° C bij 10 ° C / min, 3) warmte tot 100 ° C bij 10 ° C / min. Herhaal 2) en 3) twee keer. Bepalen smeltpunt (Tm), crystallization (Tc) en glasovergangstemperaturen (Tg), en smeltwarmte (AH f) vanaf het thermische sporen uit de derde cyclus (indien van toepassing).
- Los de polymeren in THF (2 mg / ml) en filtreer door een 0,2 urn PTFE-filter. Het monster wordt in een gelpermeatiechromatografie (50 ui) en gebruik de retentietijd van het monster en een kalibratiecurve geproduceerd met verschillende polystyreen standaarden voor het molecuulgewicht van het polymeer te bepalen. 19
- Los het (co) polymeren (15 mg / ml) in d6 DMSO voor 1H NMR spectroscopie analyse. 19
- Bepaal de kritische micel concentratie (CMC) van het copolymeer gebruikt 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrieen (DPH) als probe fluorescentie. 9
- Bereid een DPH voorraadoplossing in THF (2,32 mg / l) in het donker en voeg 100 ul van deze voorraadoplossing aan elk van een reeks flesjes.
- PrepaBent een copolymeer voorraadoplossing in THF en porties van gelijke hoeveelheid (2 ml) toe te voegen aan de reeks flesjes (elk een portie van de voorraadoplossing DPH) verkregen copolymeer in finale concentraties die variëren van 0,01 tot 1000 g copolymeer / ml.
- Vervolgens vortex het copolymeer-DPH oplossingen en druppelsgewijs toe te voegen aan 10 ml dubbel gedestilleerd water onder roeren bar. De oplossingen moeten vervolgens krachtig in het donker wordt geroerd gedurende 48 uur onder een stroom stikstof teneinde langzame verdamping van THF toe. De eindconcentratie van DPH in elke oplossing is 0,232 mg / l.
- Meet de fluorescentie-emissie van de monsters bij 430 nm (λ ex = 350 nm) met een dual-scanning microplaat spectrofluorometer en plot fluorescentie tegen log [polymeer]. Het snijpunt tussen de twee lineaire hellingen biedt de CMC waarde voor de copolymeer.
6. Procedure voor Laden doxorubicine in BCMS
- Los op 12 mg van DOX in 1 ml acetonitrile, voeg 10 ul van triëthylamine en laat de oplossing opschudding in het donker gedurende 2 uur.
- Los het copolymeer (45 mg) in 1 ml THF en roer gedurende dezelfde periode. Voeg de oplossing van het copolymeer DOX en spoel de flacon met resterende copolymeer met een extra volume van THF (0,5 ml).
- Voeg de copolymeer-geneesmiddelmengsel (2,5 ml) druppelsgewijs toegevoegd aan een flesje (20 ml) met 15 ml fysiologische zoutoplossing 0,9% (NaCl) onder roeren.
- Breng de oplossing voor een dialyse zak (3,5 kDa afgesneden) en dialyseren tegen zoutoplossing 0,9% (500 ml).
OPMERKING: Verander de externe zoutoplossing na 6 uur en laat de dialyse voortgezet gedurende 24 uur onder roeren in het donker bij kamertemperatuur. - Breng het dialysaat naar een 50 ml buis en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 15 min.
- Breng de supernatant aan een ultrafiltratie (met een 10 ml) dat een dialysemembraan (cut off 10 kDa) bevat. Zet de roeren adapter in de ultrafiltratie-systeem, sluit het deksel en open alstream stikstof.
- Concentreer de BCM oplossing tot een volume van 4 ml en voeg 6 ml vers zoutoplossing en herhaal de procedure tweemaal.
- Concentreer de oplossing BCM 4 ml, spoel de kamer met 0,5 ml zoutoplossing en voeg aan de oplossing. Bewaren in bruine flesjes bij kamertemperatuur in het donker voorafgaand aan verder gebruik.
7. Evaluatie van doxorubicine Laden in DOX-BCMS
- Oplossen DOX-BCM in dimethylformamide (100 ul in 400 ul) aan de micellen verstoren en verdund in waterige HCl-oplossing (0,1 N) voorafgaand aan evaluatie (100 ul in 900 ul 0,1 N HCl).
- Meet drug lading bij 490 nm met behulp van een benchtop microplaat spectrofotometrisch systeem. Gebruik de volgende vergelijkingen om de drug laadvermogen (DLC) en drugs laden efficiency (DLE) te bepalen:
DLC (wt%) = (gewicht van het geneesmiddel beladen / totaal gewicht van BCMS) x 100%
DLE (%) = (gewicht van met geneesmiddel beladen / gewicht geneesmiddel in voeder) x 100%
8. Evaluatievan In vitro afgifte van DOX van DOX-BCMS
- Onderzoek de afgifte van DOX van BCMS bij 37 ° C in 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) tegen PBS pH 7,4 bevattende 0,1% (w / v) Tween 80, BCMS + BSA (50 mg / ml) tegen PBS pH 7,4 en 0,1 M acetaat-buffer bij pH = 5,5. 20,21
- Verdun de BCM-DOX preparaat (700 ui) in de geselecteerde buffer (2,3 ml), hetgeen resulteerde in een totale hoeveelheid van 0,6-0,7 mg ≈ DOX in de dialysezak.
- Plaats de oplossing in de dialysezak afdichting met klemmen en dompel de zak in 200 ml van de respectieve externe media.
- Verwijder 2 ml van de oplossing buiten het dialysezak op voorafbepaalde tijdstippen en vervangen door hetzelfde volume verse buffer.
- Bewaar de monsters verwijderd bij -20 ° C voorafgaand aan analyse door UV-Vis spectrofotometrie (Abs 490 nm). Het cumulatieve percentage afgegeven geneesmiddel (E r) kan worden berekend met de volgende vergelijking:
OPMERKING: Indien m DOX is het bedrag van DOX in de BCMS, V 0 het totale volume van de afgiftemedia (200 ml), Vt = het volume van de vervangen media (Vt = 2 ml), Ci de concentratie voor correctie en C n de concentratie DOX in het monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3. Illustratie van de anionische polymerisatie van fenylglycidylether op mPEG macro-initiator aan MPEG b produceren - (PheGE) 15 voor de bereiding van blokcopolymeren micellen voor het laden van doxorubicine Het schema illustreert de deprotonering van de hydroxylgroep van mPEG gebruik naftaleen kalium. als een radicaal-anion, gevolgd door polymerisatie van de fenylglycidylether (PheGE) monomeer. Image elektronenmicroscopie vertegenwoordiger transmissie (TEM) van de BCMS gekleurd met uranyl acetaat (1% w / v) en de grootteverdeling van de micellen zoals bepaald door dynamische lichtverstrooiing (DLS). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
figuur 3, is anionische polymerisatie fenylglycidylether op mPEG macro-initiator gebruikt blokcopolymeer micellen (bereid DOX-MPEG b - (PhGE) 15 voor insluiten van doxorubicine Een smalle molecuulgewichtsverdeling de MPEG b -. (PhGE) 15 copolymeer werd door GPC (PDI = 1,03) en de polymerisatiegraad werd bepaald met 1H NMR-analyse (Figuur 4) [σ = 7,2 ppm (m , 2H meta, fenyl 2 (= CH -)), σ = 6,8 ppm (d, 3H, 2 ortho- en para 1 (- CH -), σ = 3,95 ppm (m, 2H, O- CH2 -CH-) ] de methylgroep eindgroep van het mPEG als referentie piek (σ = 3,22 ppm (s, 3H).
Figuur 4. Karakterisering en analyse. A) GPC analyse van mPEG en het copolymeer in THF. B) 1HNMR-spectra van mPEG5K (bovenste spectrum) en MPEG-b -. (PheGE) 15 (lagere spectrum) in d6-DMSO Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Kenmerken van het copolymeer.
In waterige media, amfifiele blokcopolymeren zoals MPEG b - (PheGE) 15 assembleren micellen die bestaan uit een hydrofobe kern omgeven door een hydrofiele schil te vormen. De CMC van het copolymeer werd gemeten via een vastgestelde fluorescentiemethode. De CMC van MPEG b - (PheGE) 15 werd bepaald op ~ 9 ug / ml (Figuur 5A inzet). Transmissie elektronische microscopie bevestigd een bolvormige morfologie van het copolymeer aggregaten en dus dynamischlichtverstrooiing (Figuur 3 en Tabel 2) werd gebruikt om de hydrodynamische diameter (Dh ~ 25 nm) te beoordelen. Zoals in de figuur 6-a werden L929 fibroblastcellen muizen blootgesteld aan MPEG b - (PhGE) 15 BCMS en geen cytotoxiciteit werd waargenomen na 24 uur incubatie periode.
Figuur 5. Fluorescentie intensiteit en CMC karakterisering. A) Plot van de fluorescentie-intensiteit van DPH als functie van de concentratie van MPEG b - (Phe) 15 blokcopolymeer. Inzet toont het vroege stadium van aggregatie van het blokcopolymeer van 0,1-10 ug / ml. B) plot van CMC-waarden uit de literatuur voor diverse copolymeren met hanger fenylgroepen op de kern vormblok. Rode vierkanten stellen de berekende waarden voor de Gibbs energie muizenllization van de overeenkomstige copolymeren (± 0,5 kJ / mol). 22,25-28 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 2. Karakterisatie van de BCMS bereid volgens de dialysewerkwijze.
Oplossen van geneesmiddel in BCMS wordt beïnvloed door de oplosbaarheid van het geneesmiddel en de neiging van interactie tussen het geneesmiddel en zelf en / of kernvormende blok van de micellen. In zijn zoutvorm, DOX relatief oplosbaar (~ 10 mg / ml) in water. Zo kunnen laden in de BCMS, DOX werd opgelost in acetonitril en geneutraliseerd met TEA om de vrije base te verkrijgen (3 eq.). Met een pKa van 8,5, DOX wordt relatief onoplosbaar onder basische omstandigheden rijden inkapseling in de BCMS met Stabilisatie door π-π stacking interacties (MPEG-b - (PhGE) 15). Zoals beschreven in de literatuur, vergelijkbaar laadcapaciteit voor DOX in DOX-MPEG b -. (PhGE) 15 werden gerapporteerd met een gemiddelde waarde van 14% (w / w) 21-24 Na ultrafiltratie werd vastgesteld dat copolymeer concentraties zo laag als 10 mg / ml met succes opgelost tot 1,6 mg DOX / ml. De geneesmiddelbelading rendement bedroeg tot 52% (w / w) voor de MPEG b - (PhGE) 15 BCMS (tabel 2). De afgifteprofielen van DOX van het BCMS in verschillende media onderzocht (Figuur 6c).
Figuur 6. cytotoxiciteit en geneesmiddelafgiftekinetiek. A) Evaluatie van de cytotoxiciteit in muizen L929 fibroblastcellen van MPEG- b -. (PheGE) 15 copolymeer micellen zoals bepaald met de MTS assay na een 24 uur incubatie tijd (n = 3 afzonderlijke experimenten, SD <10%) B) genormaliseerde emissiespectra vrij DOX en DOX-geladen micellen in PBS, pH 7,4 bij 10 ug / ml concentratie DOX. De golflengte excitatie is 480 nm en de emissie spectrum wordt verzameld 500-700 nm C) Vrijlating profielen van DOX uit het blok MPEG b -. (PhGE) 15 copolymeer micellen (vierkanten) in PBS 0,1 M pH 7,4, (cirkels) in PBS 0,1 M pH 7,4 bevattende 50 mg BSA / ml (in de zak) en (driehoeken) in Na + acetaat buffer 0,1 M pH 5,5 en (omlaag driehoeken) vrij DOX (n = 2) in PBS pH 7,4. (voor elke conditie, n = 3 individuele experimenten, SD <10%). Klik hier om een grotere versie van deze figur bekijkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Door de goede controle die anionische polymerisatie verschaft via molecuulgewicht is een van de meest toegepaste werkwijzen in de industrie voor de bereiding van polymeren op basis van oxiraan monomeren (PEG en PPG). Optimale en stringente omstandigheden worden gebruikt voor een succesvolle polymerisatie te bereiken. Strenge zuivering van reagentia en geschikte apparatuur nodig voor het levende karakter van de synthese. Beperkingen van de huidige opstelling worden meestal geassocieerd met de overdracht techniek die is gebaseerd op infusen. Met behulp van de juiste druk, infusen is een veilige laboratoriumschaal techniek voor de academische setting. Het toepassen van deze maatregelen zal een betere reproduceerbaarheid en controle tijdens het polymerisatieproces (laag PDI) te verstrekken. Daarnaast kunnen deze overdracht en zuiveringsprocedures echter worden gebruikt voor de bereiding van copolymeren zoals MPEG b -PCL, MPEG- b -PLLA en MPEG b -PAGE. 19,29, deze handige procedure niet voldoende zijn voor de polymerisatie van een aantal monomeren die strengere voorwaarden (bijvoorbeeld styreen) vereisen. Als alternatief wordt het break-seal techniek meestal de voorkeur bij anionische polymerisatie. 30 Om deze stappen industrie temperen, soortgelijke systemen (RVS / glas) met elkaar verbonden via hermetische kleppen.
Voor oxiraan monomeren, een algemeen mechanisme is een nucleofiele aanval van het oxyanion (vrij ion of ionenpaar) op de oxiraan ring, wat leidt tot ringopening polymerisatie. Echter, afhankelijk van de aard van oxiraan gesubstitueerde monomeren, sommige monomeren kunnen niet polymeriseren of ze kunnen niet worden gepolymeriseerd hoog molecuulgewicht. Dit type polymerisatie tolereert geen zure of basische componenten, waaronder het monomeer zelf, het oplosmiddel of andere soorten die leiden tot beëindiging reacties en / of ketenoverdrachtsmiddel middellange (verlies van controle van de reactie). Om een gePEGyleerde blokcopolymeer dragende fenyl producerengroepen van anionische polymerisatie, kunnen alternatieven fenylglycidylether monomeer gevonden: styreen, styreenoxide of allylglycidylether gevolgd door een radicaal Michael reactie van benzylmercaptan zijn opties. mPEG kan worden bereid door condensatie van ethyleenoxyde monomeer vervolgens gepolymeriseerd onder dezelfde omstandigheden als beschreven in dit document, met behulp van een gehydroxyleerd initiator (bijvoorbeeld methanol). Echter, mPEG met verschillende molecuulgewichten met lage PDI is commercieel verkrijgbaar.
Om water reststoffen, de macro-initiator (bijvoorbeeld mPEG-OH) moet goed worden gedroogd door voordrogen in een oven, gevolgd door het warmtepistool-droging. De reacties kunnen worden uitgevoerd in polaire aprotische oplosmiddelen, coördinerende oplosmiddelen of in bulk. Wanneer de polymerisatie vereist specifieke omstandigheden, zoals hoge temperatuur, moeten oplosmiddelen met een grotere polariteit dan THF worden gebruikt, zoals DMSO, HMPA of diglyme. Zoals beschreven in het protocol (deel 4 CaH2) nodig. DMSO is hygroscopisch en als de destillatie wordt niet goed uitgevoerd kunnen sporen water de actieve species inactiveren. Andere oplosmiddelen kunnen worden gebruikt, maar DMSO een hoog oplosvermogen voor kationen, laag oplosvermogen voor anionen en laat polymerisatiewerkwijze bij hoge temperatuur. 31,32 DMSO is een uitstekend oplosmiddel voor base gekatalyseerde polymerisatie van epoxiden en alkenen met sterke elektronenzuigende substituenten. Initiatie van de polymerisatie kan worden bereikt door in situ vorming van kaliumalkoxide initiatoren met titratie van mPEG-OH met een verdunde oplossing van kalium naftaleen. 33 Het is belangrijk om de oplossing van kalium- naftaleen zorgvuldig bereiden en de oplossing met zuur vóór titratie het gebruik ervan. Inderdaad, indien de kaliumconcentratie naftaleen onder of overschat de macro-initiator kan aggregaten of niet volledig activereninitiator en op zijn beurt de polymerisatie kan worden aangetast. Wanneer de kalium naftaleen wordt druppelsgewijs toegevoegd, het langzame verdwijning van kleur geeft visuele controle op het verbruik van de basis door de initiator. Onder deze omstandigheden, de snelle proton uitwisseling tussen de hydroxylgroepen (slapende) en alkoxiden (actieve) zorgt voor een gecontroleerde polymerisatie van het monomeer. 13
Het aggregatiegedrag van blokcopolymeren soortgelijke samenstelling mPEG 122 - b -. (PhGE) 15 zijn onderzocht door verscheidene groepen gerapporteerde CMC waarden variërend van 1 tot 10 ug / ml 25,27,28,34-36 CMC waarden een specifiek copolymeer kan variëren afhankelijk van de specifieke methode toegepast voor bepalen. In deze studie werd een fluorescentie gebaseerde methode toegepast met DPH gekozen als de probe aangezien het alleen resulteert in een fluorescentiesignaal die zijn opgenomen in de BCMS (figuur 5A inzet). Figuur 5Bomvat de CMC waarden voor verschillende blokcopolymeren met hanger fenylgroepen. Zoals getoond is de CMC waarden van de copolymeren zijn afhankelijk van de aard van het polymeerskelet met het fenylgroepen en de polymerisatiegraad. 25,27,28,34-36 uitwisseling copolymeerketens tussen de micellen en het externe medium afhankelijk stand van de micel kern en de Flory-Huggins interactie parameter tussen de twee blokken en het oplosmiddel. De glasovergangstemperatuur (Tg) van bulk PPheGE homopolymeer bekend is lager dan die van bulk PS is. 37 Vanwege de glasachtige aard van PS, copolymeren met een hoge polymerisatiegraad van PS (n> 35) bezitten een glasachtige kern bij kamertemperatuur (Tg ~ 80 ° C). 38
Thermodynamisch zijn twee belangrijke benaderingen naar voren gebracht om de micellering proces, namelijk de fasescheiding model (fase scheiding aan de CMC), en de massa-actie-model (ass beschrijvenociation-dissociatie evenwicht micellen / unimers). 39 Volgens beide benaderingen, de standaard Gibbs energie change (Ag ◦) voor de overdracht van 1 mol amfifiel van oplossing van de micellaire fase (Ag ◦ vrije energie van micellering), in afwezigheid van elektrostatische interacties, wordt gegeven door Ag ◦ = RT ln (CMC). 39 Zoals getoond in figuur 5B, de waarden voor CMC en Ag ◦ zijn in overeenstemming met de waarden verkregen voor copolymeren die qua samenstelling (in termen van totale copolymeer M w en de verhouding van hydrofoob naar hydrofiel bloklengte) naar b MPEG zijn - (PhGE) 15. Zoals getoond in Tabel 1, DSC analyse van de MPEG b - (PhGE) 15 copolymeer stortmateriaal bevestigd een Tm bij 51 ° C die wordt toegeschreven aan het hydrofiele blok en wordt ingedrukt ten opzichtemPEG alleen (60 ° C). In oplossing wordt verondersteld dat de kernen van MPEG b -PS copolymeer micellen, met polystyreen blokken van gelijke lengte als die van PhGE in MPEG b - (PhGE) 15, beginnen mobiele bij fysiologische temperatuur (dat wil zeggen, 37 ° wordt . C) 38,40 Daarom is de MPEG-b - (PhGE) 15 BCMS waarschijnlijk beschikken over een relatief mobiele kern die de lokale beweging in staat stelt bij kamertemperatuur en fysiologische temperaturen.
In deze studie dialyse en ultrafiltratie gebruikt als geschikt middel om vrij geneesmiddel te verwijderen en de concentratie van het geneesmiddel / copolymeer in vivo toepassingen te verhogen voor latere. Alternatief kan vriesdrogen worden toegepast om de formulering te concentreren; Dit vereist echter optimalisatie inclusief eventuele toevoeging van stabilisatoren (bijvoorbeeld PEG, dextrose) om bevochtigbaarheid voor reconstitutie verbeteren. De resulterende DOX-MPEG-b - (PhGE) toonde vergelijkbare s 15 BCMSustained afgifteprofielen (PBS 7,4) BCM systemen door Kataoka en medewerkers. 21 in PBS ontwikkeld bij pH 7,4, minder dan 10% van het totale geneesmiddel werd vrijgegeven binnen zes uur terwijl meer dan 95% van de vrije DOX vrijkomt uit de dialyse bag binnen diezelfde periode. Duurzame afgifte bij neutrale pH geeft goede stabiliteit van de formulering gedurende de vier dagen.
Menselijk bloedserum bestaat uit ongeveer 7% eiwit, tweederde waarvan albumine. 41 Teneinde de in vivo condities simuleert geneesmiddelafgifte wordt gewoonlijk geëvalueerd in bufferoplossingen met fysiologisch relevante concentraties van dit eiwit. In de onderhavige studie werd BSA in de dialysezak met een concentratie van 50 mg / ml. In aanwezigheid van albumine, de afgifte van DOX van het BCMS verhoogd tot ongeveer 30% na 4 dagen incubatie bij 37 ° C. Afgifte van DOX van het BCMS in buffer bij pH 5,5 dat bevestigd protonation van DOX onder deze omstandigheden leidt tot een toename van geneesmiddelafgifte na 72 uur en dit verhoogt tot 60% na 4 dagen. Kortom, de resulterende DOX-BCMS hebben veelbelovende resultaten in vitro, vergelijkbaar of gelijkwaardig zijn aan andere BCM formuleringen van DOX die in de literatuur, en dus extra evaluatie stimuleren in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HAMF12 | Gibco, Life Technologies | 12500 | Supplemented with 10% FBS. Warm in 37 °C water bath. |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Sigma-Aldrich | T4049 | Warm in 37 °C water bath |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F1051 | Canada origin |
| MDA-MB-468 cell line | ATCC | HTB-132 | |
| MTS tetrazolium reagent | PROMEGA | G111B | |
| Phenazine ethosulfate (PES) | Sigma-Aldrich | P4544 | >95% |
| mPEG5K (Mn 5,400 g/mol) | Sigma-Aldrich | 81323 | PDI=1.02 |
| Dimethylsolfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5% |
| Naphthalene | Sigma-Aldrich | 147141 | >99% |
| Phenyl glycidyl ether | Sigma-Aldrich | A32608 | >85% |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich | 427551 | >99% |
| Potassium | Sigma-Aldrich | 451096 | >98% |
| Tetrahydrofuran | Caledon Laboratory Chemicals | 8900 1 | ACS |
| Hexane | Caledon Laboratory Chemicals | 5500 1 | ACS |
| Calcium hydride (CaH2) | ACP | C-0460 | >99.5% |
| Diethyl Ether | Caledon Laboratory Chemicals | 1/10/4800 | ACS |
| Microplate reader | BioTek Instruments | ||
| Differential scanning calorimetry (DSC) | TA Instruments Inc | DSC Q100 | |
| Gel permeation chromatography (GPC) | Waters | 2695 separation moldule / 2414 detector | 2 Columns: Agilent Plgel 5 µm Mixed-D |
| NMR spectroscopy | Varian Mercury 400MHz | ||
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151858 | 99.96% |
| DMSO-d | Sigma-Aldrich | 156914 | 99.96% |
| Vaccum pump | Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc. | Ultimate pressure 1x10-4 torr | |
| Drierit with indicator, 8 mesh | Sigma-Aldrich | 238988 | Regenerated at 230 °C for 2 hr |
References
- Dickerson, T. J., Reed, N. N., Janda, K. D. Soluble Polymers as Scaffolds for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, 3325-3344 (2002).
- van Heerbeek, R., Kamer, P. C. J., van Leeuwen, P. W. N. M., Reek, J. N. H. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102 (10), 3717-3756 (2002).
- Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D., Schubert, U. S. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition. 49 (36), 6288-6308 (2010).
- Eetezadi, S., Ekdawi, S. N., Allen, C. The challenges facing block copolymer micelles for cancer therapy: In vivo barriers and clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 91, 7-22 (2015).
- Attwood, D., Booth, C., Yeates, S. G., Chaibundit, C., Ricardo, N. Block copolymers for drug solubilisation: Relative hydrophobicities of polyether and polyester micelle-core-forming blocks. International Journal of Pharmaceutics. 345 (1-2), 35-41 (2007).
- Matsumura, Y., Kataoka, K. Preclinical and clinical studies of anticancer agent-incorporating polymer micelles. Cancer Science. 100 (4), 572-579 (2009).
- Chan, A. S., Chen, C. H., Huang, C. M., Hsieh, M. F. Regulation of particle morphology of pH-dependent poly(epsilon-caprolactone)-poly(gamma-glutamic acid) micellar nanoparticles to combat breast cancer cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 10 (10), 6283-6297 (2010).
- Diao, Y. Y., et al. Doxorubicin-loaded PEG-PCL copolymer micelles enhance cytotoxicity and intracellular accumulation of doxorubicin in adriamycin-resistant tumor cells. International Journal of Nanomedicine. 6, 1955-1962 (2011).
- Mikhail, A. S., Allen, C. Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) Micelles Containing Chemically Conjugated and Physically Entrapped Docetaxel: Synthesis, Characterization, and the Influence of the Drug on Micelle Morphology. Biomacromolecules. 11 (5), 1273-1280 (2010).
- Kataoka, K., Harada, A., Nagasaki, Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (1), 113-131 (2001).
- Nakanishi, T., et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release. 74 (1-3), 295-302 (2001).
- Liu, J., Xiao, Y., Allen, C. Polymer-drug compatibility: A guide to the development of delivery systems for the anticancer agent, ellipticine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (1), 132-143 (2004).
- Flory, P. J. Molecular Size Distribution in Ethylene Oxide Polymers. Journal of the American Chemical Society. 62 (6), 1561-1565 (1940).
- Kazanskii, K. S., Solovyanov, A. A., Entelis, S. G. Polymerization of ethylene oxide by alkali metal-naphthalene complexes in tetrahydrofuran. European Polymer Journal. 7 (10), 1421-1433 (1971).
- Crothers, M., et al. Micellization and Gelation of Diblock Copolymers of Ethylene Oxide and Styrene Oxide in Aqueous Solution. Langmuir. 18 (22), 8685-8691 (2002).
- Taboada, P., et al. Block Copolymers of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether: Micellization, Gelation, and Drug Solubilization. Langmuir. 21 (12), 5263-5271 (2005).
- Taboada, P., et al. Micellization and Drug Solubilization in Aqueous Solutions of a Diblock Copolymer of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether. Langmuir. 22 (18), 7465-7470 (2006).
- Attwood, D., Booth, C. Colloid Stability. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 61-78 (2010).
- Le Devedec, F., et al. Postalkylation of a Common mPEG-b-PAGE Precursor to Produce Tunable Morphologies of Spheres, Filomicelles, Disks, and Polymersomes. ACS Macro Letters. 5 (1), 128-133 (2016).
- Chtryt, V., Ulbrich, K. Conjugate of Doxorubicin with a Thermosensitive Polymer Drug Carrier. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 16 (6), 427-440 (2001).
- Kataoka, K., et al. Doxorubicin-loaded poly(ethylene glycol)-poly(β-benzyl-l-aspartate) copolymer micelles: their pharmaceutical characteristics and biological significance. Journal of Controlled Release. 64 (1-3), 143-153 (2000).
- Cammas, S., Matsumoto, T., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. Design of functional polymeric micelles as site-specific drug vehicles based on poly (α-hydroxy ethylene oxide-co-β-benzyl l-aspartate) block copolymers. Materials Science and Engineering: C. 4 (4), 241-247 (1997).
- Lv, S., et al. Doxorubicin-loaded amphiphilic polypeptide-based nanoparticles as an efficient drug delivery system for cancer therapy. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9330-9342 (2013).
- Kim, J. O., Oberoi, H. S., Desale, S., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Polypeptide nanogels with hydrophobic moieties in the cross-linked ionic cores: synthesis, characterization and implications for anticancer drug delivery. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 981-993 (2013).
- Zhao, C. L., Winnik, M. A., Riess, G., Croucher, M. D. Fluorescence probe techniques used to study micelle formation in water-soluble block copolymers. Langmuir. 6 (2), 514-516 (1990).
- Wilhelm, M., et al. Poly(styrene-ethylene oxide) block copolymer micelle formation in water: a fluorescence probe study. Macromolecules. 24 (5), 1033-1040 (1991).
- Cammas, S., Kataoka, K. Functional poly[(ethylene oxide)-co-(β-benzyl-L-aspartate)] polymeric micelles: block copolymer synthesis and micelles formation. Macromolecular Chemistry and Physics. 196 (6), 1899-1905 (1995).
- Kwon, G., et al. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(.beta.-benzyl L-aspartate). Langmuir. 9 (4), 945-949 (1993).
- Ahmed, F., Discher, D. E. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. Journal of Controlled Release. 96 (1), 37-53 (2004).
- Uhrig, D., Mays, J. W. Experimental techniques in high-vacuum anionic polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 43 (24), 6179-6222 (2005).
- Parker, A. J. The effects of solvation on the properties of anions in dipolar aprotic solvents. Quarterly Reviews, Chemical Society. 16 (2), 163-187 (1962).
- Cram, D. J. Fundamentals o] Carbanion Chemistry. , (1965).
- Szwarc, M. ACS Symposium Series. 166, American chemistry society. 1-15 (1981).
- Cho, Y. W., Lee, J., Lee, S. C., Huh, K. M., Park, K. Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release. 97, 249-257 (2004).
- Dewhurst, P. F., Lovell, M. R., Jones, J. L., Richards, R. W., Webster, J. R. P. Organization of Dispersions of a Linear Diblock Copolymer of Polystyrene and Poly(ethylene oxide) at the Air−Water Interface. Macromolecules. 31 (22), 7851-7864 (1998).
- Opanasopit, P., et al. Block Copolymer Design for Camptothecin Incorporation into Polymeric Micelles for Passive Tumor Targeting. Pharmaceutical Research. 21 (11), 2001-2008 (2004).
- Allen, G., Booth, C., Price, C. VI-The physical properties of poly(epoxides). Polymer. 8, 414-418 (1967).
- Jada, A., Hurtrez, G., Siffert, B., Riess, G. Structure of polystyrene-block-poly(ethylene oxide) diblock copolymer micelles in water. Macromolecular Chemistry and Physics. 197 (11), 3697-3710 (1996).
- Attwood, D., Florence, A. T. Surfactant systems : their chemistry, pharmacy, and biology. , Chapman and Hall. (1983).
- Rekatas, C. J., et al. The effect of hydrophobe chemical structure and chain length on the solubilization of griseofulvin in aqueous micellar solutions of block copoly(oxyalkylene)s. Physical Chemistry Chemical Physics. 3 (21), 4769-4773 (2001).
- Encyclopædia Britannica Online. , http://www.britannica.com/EBchecked/topic/479680/protein/72559/Proteins-of-the-blood-serum (2015).
