Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Anionisk polymerisation af en amfifil Copolymer for Udarbejdelse af blokcopolymer Miceller stabiliseret af π-Tr Stacking Interaktioner

Published: October 10, 2016 doi: 10.3791/54422
Automatic Translation
1, 1, 1
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto

Summary

De vigtigste trin i levende anioniske polymerisering af phenylglycidylether (PheGE) på methoxy-polyethylenglycol (mPEG b -PPheGE) er beskrevet. De resulterende blokcopolymer miceller (BCMS) blev fyldt med doxorubicin 14% (vægt%) og vedvarende afgivelse af lægemidlet over 4 dage under fysiologisk relevante betingelser blev opnået.

Abstract

I denne undersøgelse blev en amfifil copolymer, der indbefatter en kerne-dannende blok med phenylgrupper syntetiseret ved levende anionisk polymerisation af phenyl glycidylether (PheGE) på methoxy-polyethylenglycol (mPEG B -PPheGE). Karakterisering af copolymeren afslørede en smal molekylær fordeling (PDI <1,03) og bekræftede polymerisationsgrad mPEG 122 - b - (PheGE) 15. Den kritiske micellekoncentration af copolymeren blev vurderet ved anvendelse af en etableret fluorescensmetode med aggregeringen adfærd vurderes ved dynamisk lysspredning og transmission elektronisk mikroskopi. Potentialet af copolymeren til brug i lægemiddeltilførselsanvendelser blev evalueret i en foreløbig måde, herunder in vitro biokompatibilitet, lastning og frigivelse af den hydrofobe anti-cancer stof doxorubicin (DOX). En stabil micelle formulering af DOX blev fremstillet med medikamentloading niveauer op til 14% (vægt-%), lægemiddelfyldning efficiencies> 60% (vægt / vægt) og vedvarende afgivelse af lægemidlet over 4 dage under fysiologisk relevante betingelser (surt og neutralt pH, tilstedeværelse af albumin). Det høje medikamentbelastning niveau og langvarig frigivelse tilskrives stabilisere n-π interaktioner mellem DOX og kernedannende blok af micellerne.

Introduction

I vandige medier, amfifile blokcopolymerer samles for at danne nanostørrelse blokcopolymer miceller (BCMS), der består af en hydrofob kerne omgivet af en hydrofil skal eller corona. Den micelle kerne kan tjene som et reservoir for inkorporering af hydrofobe stoffer; mens den hydrofile corona giver en grænseflade mellem kernen og det ydre medium. Poly (ethylenglycol) (PEG) og derivater deraf er en af de vigtigste klasser af polymerer og en af de mest udbredte i lægemiddelformulering. 1-3 BCMS har vist sig at være en værdig drug delivery platform med flere formuleringer afhængige af dette teknologi nu i sen klinisk udvikling. 4 Mest almindeligt, den hydrofobe blok af copolymeren består af polycaprolacton, poly (D, L-lactid), poly (propylenoxid) eller poly (β-benzyl-L-aspartat). 5 -9

Kataoka gruppe undersøgte sfæriske miceller dannet af PEO- b b -. (Polyasparaginsyre-konjugeret doxorubicin) til levering af doxorubicin (DOX) 10,11 i deres rapporter, de fremførte, at π-Tr interaktioner mellem polymer-konjugeret lægemiddel eller PBLA og gratis DOX handle for at stabilisere micelle kerne resulterer i stigninger i medikamentifyldning og fastholdelse. Det er fastslået, at kompatibilitet eller interaktioner mellem et lægemiddel og kernen-dannende blok er determinanter for key performance parametre. 12 Ud over DOX, en række kræftmedicin omfatter aromatiske ringe inden for deres kerne struktur (fx methotrexat, olaparib, SN -38).

Som følge heraf er der betydelig interesse i syntesen af ​​copolymerer, der omfatter benzyl ringe i deres kernedannende blokke. Anionisk ringåbnende polymerisation af PEG og dets derivater muliggøre kontrol over molekylvægten og resulterer i materialer med lav polydispersitet i godt udbytte. 13,14 Ethylene oxid med phenylglycidylether (PheGE) eller styren oxid (SO) kan være (co) polymeriseres til at danne blokcopolymerer, der danner miceller til solubilisering af hydrofobe stoffer. 15-18 Den aktuelle rapport beskriver de nødvendige skridt for at leve anioniske polymerisering af phenyl glycidylether monomer på mPEG-OH som makroinitiator (figur 1). Den resulterende blokcopolymer og dets aggregater derpå karakteriseret i form af egenskaberne relevante at bruge i lægemiddeladministration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

figur 1
Figur 1. Skematisk viser de ni vigtigste skridt i forberedelsen af mPEG B -PPheGE copolymer. Klik her for at se en større version af dette tal.

1. Forberedelse af reagenser under tørre forhold

  1. Fremstilling af reagenserne.
    1. Afvej 15 g mPEG-5K (M n = 5.400 g / mol, PDI 1,03) og sted ved 50 ° C i en ovn under vakuum i 48 timer før brug.
    2. Tørre 200 ml dimethylsulfoxid (DMSO) over calciumhydrid (CaH2) (~ 1 g), anbringes under vakuum i 30 min, purge under argon og omrøres i 48 timer før brug.
    3. Anbring 50 ml af PheGE monomer i en tør og ren kolbe (100 ml), der tilsættes 1 g CaH2, sæl under vakuum i 15 minutter på is, udrensning under argonog lad omrøre i 24 timer under argon før anvendelse.

2. Forberedelse af Kalium Naphthalen

  1. Forsigtigt, skåret små bidder af natrium (~ 1,5 g) tørret med hexan for at fjerne overskydende mineralolie og tilsæt til det runde kolbe indeholdende tetrahydrofuran (THF) (v = 500 ml).
    BEMÆRK: bidder af natrium må ikke udsættes for luft i længere grund af risikoen for brand.
  2. Tilføj benzophenon (~ 5 g), udrensning med argon og forsegle rund kolbe (2 halse) med glasprop.
  3. Efter omrøring under argon i 24 timer, slutte rundbundet kolbe med et destillationsapparat (figur 2), destillere mørke opløsning under argon, mens tilbagesvaling (dvs. tilbagesvaling i ca. 2 hr periode efter opløsningen bliver blå). Begynd at indsamle de ønskede volumen ~ 150 ml THF ved at lukke venstre ventil (findes i midten af ​​destillationsapparatet).
    BEMÆRK: Hvis denne løsning ikke bliver blå, stoppe destillererning, afkøle ved stuetemperatur (RT) og tilføje flere benzophenon eller natrium og genstart destillation. Dette er en indikation af, at THF stadig indeholder vand.
  4. I en tør Erlenmeyer, tilsæt destilleret THF (v = 100 ml) og opløs 3,9 g naphthalen.
    BEMÆRK: Stop destillation, afkøles ved stuetemperatur og åbn højre ventil til at overføre mængden af ​​THF.
  5. Som beskrevet i punkt 2.1, skære små bidder af kalium (1,1 g) og tilsæt til opløsningen indeholdende naphthalen (slutkoncentration ~ 0,3 mol / l). Forsegl Erlenmeyer med en skylning adapter (T) (on / off) med en skillevæg øverst og rense med argon.
  6. Efter omrøring under argon i 24 timer, observere den resulterende opløsning af kalium naphthalen base som en homogen mørkegrøn farve.
  7. Under inerte betingelser, fjerne en 5 ml alikvot af den basiske opløsning fra kolben med en sprøjte, og der tilsættes til 10 ml destilleret vand. Efterfølgende tilsættes 1-2 dråber phenolphthalein indikator til denne opløsning,som drejer løsningen en fuchsia farve.
  8. Brug en burette at titrere kalium naphthalen løsning med en standard saltsyreopløsning (0,1 N), indtil opløsningen bliver farveløs.

3. Materialer og Nødvendige forholdsregler for effektiv Living Anionisk polymerisation

  1. System argon / vakuum manifold.
    BEMÆRK: Som beskrevet i figur 2, er en dobbelt glas manifold med hule glas stophaner bruges til at skifte mellem argon levering og vakuum i glas.
    1. Tilslut tank af argon (med manometer) til en tør tørremiddel søjle og til manifolden linje ved hjælp inert gummislanger. I den anden ende af argon linje, tilslutte en absorptionskolbe (indeholdende mineralolie).
    2. Til glas stophaner, tilslutte fleksible inaktive rør og nåle. Til den anden linje af manifolden, tilslutte et glas fælde nedsænket i en kold Dewarkar (fyldt med is / vand eller flydende nitrogen) til en høj vakuumpumpe.
    3. Apparatur til destillation af monomer og DMSO.
      BEMÆRK: En praktisk (dvs. alt i én) apparat til højvakuumdestillation anvendes (figur 2). Den tørre glasvarer er lavet med høj vakuum ventiler, og indbygget i kondensatorer med en indre nedkølet hoved.
      1. Tilslut vandstrømmen gennem indløbet (A) og udløbet (B) af køleenheden (brev). Forbind den anden indløb / udløb (C) til den dobbelte manifold til argon / vakuum. Tilføj og forsegle en skillevæg (metaltråde) ved levering / udvinding port, og tilslut en rustfri stål kanyle til overførsel af luftfølsomme væsker (D) (øverst / loop).
      2. Før polymerisering, destillere PheGE og DMSO på halvkugleformede varmekapper ved 100 ° C og 70 ° C henholdsvis i 2 timer under vakuum under omrøring. Den PheGE monomer kogepunkt er 254 ° C, hvorimod kogepunktet for DMSO er 189 ° C ved (1 atm).
    4. Glas til anioniske polymerization.
      1. Ud over den destillation systemet, bruger kun højt vakuum resistente glasvarer, herunder runde bund kolber (certificeret af producenten), uddannet cylindre (for overførsel af mængder af opløsningsmiddel, base og monomerer), kanyler, septa og metaltråde til at forsegle septa.
        BEMÆRK: levende polymerisation, varme omhyggeligt (under vakuum) og køle ned alt glasudstyr under argon flow før anvendelse. Hold varmepistol på afstand ~ 10 cm fra glas.

    Figur 2
    Figur 2. Montering og vigtige skridt destillering / transfer. Klik her for at se en større version af dette tal.

    4. Beskrivelse af de vigtigste skridt i Living Anionisk polymerisering: Destillation og Transfer

    1. Afvej mPEG-5K (2 mmol, 10 g) i en tør fLASK / Schlenk (ovn) indeholdende en omrørerstav og forsegle flushing adapter (T) (on / off) med en skillevæg øverst.
    2. Kolben forbindes til manifolden og rense kolben i 2-3 min med argon hedeture. Drej ventilen til vakuum position til at rense kolben.
    3. Drej flasken manuelt og tør reaktionsbeholderen homogent med en føntørrer (varmepistol), indtil mPEG-5K smelter.
      BEMÆRK: Hold varmen pistol på en afstand ~ 10 cm fra kolben.
    4. Efter 1 min, bryde vakuumet ved at dreje ventilen på manifolden mod argon position med flere hurtig snaps.
      BEMÆRK: En kontinuerlig argon flow skal overholdes i absorptionskolben. Når flowet er kontinuerligt, ventilen bliver på argon position. Gentag opvarmning og afkøling skridt to gange for at fjerne alle spor af fugt.
    5. Hold den polymere makroinitiator under vakuum i ~ 2 timer og under argon inden reaktionen begynder.
    6. Mount to højvakuumdestillation apparater under kølerhjelmen (Figure 2); én til destillation af DMSO og ét til destillation af monomeren (PheGE).
    7. Tilslut separate kolber indeholdende DMSO og monomer til de to apparater og installere hver på en halvkugleformet varmekappe (eller i et oliebad). Tilslut koldt vand til toppen af ​​apparatet (in / out) og til manifolden (argon / vakuum).
    8. Sørg for, at hvert apparat er sikkert og godt forseglet. Engager vakuum via ventilen.
      BEMÆRK:. Som beskrevet i trin 3.3, gentag opvarmning og køling trin to gange for at fjerne alle spor af fugt.
    9. Indstil opvarmning via en temperaturregulator og start omrøring af opløsninger. Efter 2 timer af omløb / destillation af DMSO, lukke højvakuum ventil (findes i midten af ​​destillationsapparatet) at indsamle ca. 20 ml opløsning (for at vaske indersiden af ​​apparatet). Derefter slipper den del ind i kolben, og gentag operationen en gang mere for at sikre renheden af ​​den ønskede fraktion, der er collected senere.
    10. Kolben opvarmes indeholdende mPEG-5K (under vakuum) med varmepistol indtil polymeren (mPEG-5K) smelter. Rense igen med argon.
      BEMÆRK: Proceduren vil bidrage til opløsningen efter overdragelsen af ​​DMSO.
    11. Efter 2 timer, lukke den høje vakuumventil og indsamle mængden af opløsningsmiddel (V DMSO = ~ 100 ml). Stop opvarmning og bryde vakuum fra manifolden. Slip argon (ved snaps) ind i kammeret som beskrevet ovenfor.
    12. Under et positivt tryk af argon, forbinde den ene side af kanylen (hold på stophanen af ​​apparatet) til en gradueret cylinder eller direkte til kolben indeholdende mPEG-5K (hvis destillationsapparatet har graduering) og nedsænke den anden ende forsigtigt ind i frisk destilleret fraktion.
    13. Under anvendelse argontryk, drive DMSO gennem kanylen ind i reaktionskolben. Tilslut en ekstra bobler til kolben (eller cylinder hvis det er nødvendigt for måling) og luk glasset stophane tilsluttet til the bubbler på den modsatte side af manifolden.
      BEMÆRK: Når den ene side af en kanyle fjernes til overførsel, sørg for, at positivt argon tryk.
    14. For at undgå ulykker forårsaget af argon tryk, åbne glas stophane til 1-2 sek og genlukke at fortsætte strømmen af ​​DMSO (gentaget én gang pr 0,5 min), indtil den fulde overførslen er færdig. Åbn stophanen når du er færdig.
      BEMÆRK: Samme procedure skal nu følges til destillation og indsamling af monomeren. Opløsningsmidlet og monomer ikke kan indsamles på samme tid.
    15. Overfør 5 ml 0,3 M naphthalen kalium via kanylering i et måleglas forseglet med en skillevæg med kanyle isat (loop).
      BEMÆRK: Samme forholdsregler som beskrevet i NOTE 4.13. Positive argontryk skal opretholdes først fra naphthalen kalium kolben til cylinderen og derefter fra cylinderen til reaktionskolben for at undgå luft / vandforurening.
    16. Indsæt en anden nål fra manifold ind i cylinderen (argon). Fjern kanylen forbundet til destillationsanlægget omhyggeligt og sæt hurtigt ind i reaktionskolben.
      BEMÆRK: Brug denne teknik til overførsel af base og monomer.
    17. Tilføj basen dråbevis, indtil opløsningen bliver mørkt. Efter den langsomme forsvinden af ​​farve, tilføje en anden del, indtil den mørke farve vises igen, og gentag indtil den fulde overførsel.
    18. Overfør det ønskede volumen af monomer (V PheGE = 5 ml) for at nå en polymerisationsgrad af PPheGE ~ n = 18-20.
    19. Man lader reaktionen i 48 timer ved 80 ° C under argonatmosfære under konstant omrøring for at sikre fuldstændig polymerisation.
    20. Stands reaktionen ved tilsætning af dråber af HCI 1 N i methanol (målt under anvendelse af lakmuspapir (neutral pH)) og observeret af en farve forsvinden.
    21. Ekstraher naphthalen fra DMSO-opløsningen med hexan (3 x 50 ml). Fjern DMSO ved destillation under vakuum ~ 70 ml (samme apparater). Cool ned opslæmningen og der tilsættes 50 ml THF.
    22. Fjerne saltet fra opslæmningen opløsningen ved centrifugering ved 5000 xg i 10 min. Supernatanten overføres, og tilsæt dråbevis til 500 ml kold diethylether.
    23. Bundfaldet filtrering eller centrifugering (gentag to gange) og tør under vakuum ved 30 ° C i 24-48 timer (udbytte 85%).
      BEMÆRK: Copolymeren er nu klar til karakterisering.

    5. Karakterisering af copolymererne

    1. Afvejes 5-10 mg copolymer (record den faktiske masse) i en aluminium prøve gryde og forsegle hermetisk med låget aluminium. Load prøve pan og reference pan (tom) ind i differential scanning kalorimeter.
    2. Program en fremgangsmåde ( "varme / køle / varme") cyklus: 1) varme fra 40 ° C til 100 ° C ved 10 ° C / min, 2) afkøles til -70 ° C ved 10 ° C / min, 3) varme til 100 ° C ved 10 ° C / min. Gentag 2) og 3) to gange. Bestem smeltepunkt (T m), kryallization (T c) og glasovergangstemperaturer (T g), og smeltevarme (AH f) fra de termiske spor fra den tredje cyklus (hvis relevant).
    3. Opløs de polymerer i THF (2 mg / ml) og filtreres gennem et 0,2 um PTFE-filter. Prøven sprøjtes ind i en gelpermeationskromatografi systemet (50 pi) og bruge retentionstiden for prøven og en kalibreringskurve fremstillet ved anvendelse af en række polystyrenstandarder til bestemmelse af molekylvægten af polymeren. 19
    4. Opløse (co) polymerer (15 mg / ml) i d6 DMSO for 1H NMR-spektroskopi-analyse. 19
    5. Bestem den kritiske micellekoncentration (CMC) af copolymeren under anvendelse af 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH) som et fluorescens-probe. 9
      1. Der fremstilles en DPH stamopløsning i THF (2,32 mg / l) i mørke, og 100 pi af denne stamopløsning til hver af en række hætteglas.
      2. Prepare en copolymer stamopløsning i THF og tilsættes alikvoter af tilsvarende volumen (2 ml) til rækken af ​​hætteglas (hver indeholder en portion af DPH stamopløsning) resulterer i endelige copolymer koncentrationer, der spænder fra 0,01 til 1,000 ug copolymer / ml.
      3. Efterfølgende, vortex copolymer-DPH løsninger og tilsæt dråbevis til 10 ml dobbelt-destilleret vand med omrøring bar. Opløsningerne skal derefter omrørt kraftigt i mørke i 48 timer under en strøm af nitrogen for at tillade langsom fordampning af THF. Slutkoncentrationen af ​​DPH i hver opløsning er 0,232 mg / l.
      4. Måle fluorescens emission af prøverne ved 430 nm (λ ex = 350 nm) under anvendelse af en dual-scanning mikroplade spektrofluorometer og plot fluorescens versus log [polymer]. Skæringspunktet mellem de to lineære skråninger giver CMC værdi for copolymeren.

    6. Procedure for Loading Doxorubicin til BCMS

    1. Opløs 12 mg DOX i 1 ml acetonitrile tilsættes 10 pi triethylamin, hvorefter opløsningen omrøres i mørke i 2 timer.
    2. Opløs copolymer (45 mg) i 1 ml THF og omrøres i samme periode. Tilføj copolymeropløsningen til DOX opløsning og skyl hætteglasset med tilbageværende copolymer med en ekstra mængde af THF (0,5 ml).
    3. Tilsæt copolymer-drug-blanding (2,5 ml) dråbevis til et hætteglas (20 ml) indeholdende 15 ml saltvand 0,9% (NaCl) under omrøring.
    4. Overfør opløsningen til en dialysepose (3,5 kDa afskåret) og dialyseres mod saltvand 0,9% (500 ml).
      BEMÆRK: Skift den eksterne saltvand efter 6 timer og lad dialyse fortsætte i 24 timer med omrøring i mørke ved stuetemperatur.
    5. Overfør dialysatet til et 50 ml rør og centrifugeres ved 5000 xg i 15 min.
    6. Supernatanten overføres til et ultrafiltreringssystem (med en 10 ml kapacitet), der indeholder en dialysemembran (afskåret 10 kDa). Sæt omrøring adapteren i ultrafiltrering systemet, luk låget og åbne for somtream af nitrogen.
    7. Koncentrer BCM opløsningen til et volumen på 4 ml og tilsættes 6 ml frisk saltvand og gentage proceduren to gange.
    8. Koncentrer BCM opløsning til 4 ml, skylles kammeret med 0,5 ml saltvand og tilsæt til opløsningen. Opbevares i brune hætteglas ved stuetemperatur i mørke forud for yderligere anvendelse.

    7. Evaluering af doxorubicin Loading i DOX-BCMS

    1. Opløs DOX-BCM i dimethylformamid (100 pi i 400 ul) for at forstyrre miceller og fortyndes i HCI vandig opløsning (0,1 N) før evaluering (100 pi i 900 pi HCI 0,1 N).
    2. Mål lægemiddelfyldning ved 490 nm under anvendelse af en benchtop mikroplade spektrofotometrisk system. Brug følgende ligninger til at bestemme stoffet lastkapacitet (DLC) og medikamentbelastning effektivitet (DLE):
      DLC (wt%) = (vægt af lægemiddel fyldte / samlet vægt BCMS) x 100%
      DLE (%) = (vægt af lægemiddel fyldte / vægt af lægemiddel i foder) x 100%

    8. Evalueringaf In Vitro Frigivelse af DOX fra DOX-BCMS

    1. Undersøg frigivelsen af ​​DOX fra BCMS ved 37 ° C i 0,1 M phosphatbufret saltvand (PBS, pH 7,4) mod PBS, pH 7,4 indeholdende 0,1% (w / v) Tween 80, BCMS + BSA (50 mg / ml) mod PBS pH 7,4 og 0,1 M acetat-buffer ved pH = 5,5. 20,21
    2. Fortynd BCM-DOX-formulering (700 pi) i den valgte puffer (2,3 ml) til opnåelse af en samlet mængde på ≈ 0,6-0,7 mg DOX i dialyseposen.
    3. Placer løsning i dialyse taske, forsegles med clips og fordybe posen i 200 ml af de respektive eksterne medier.
    4. Fjern 2 ml af opløsningen uden dialyseposen ved forudbestemte tidspunkter og erstattes med samme volumen frisk puffer.
    5. Opbevar de afmålte mængder fjernet ved -20 ° C inden analyse ved UV-Vis spektrofotometri (Abs 490 nm). Den kumulative procentdel af lægemiddel frigivet (E r) kan beregnes under anvendelse af følgende ligning:
      "Ligning1" BEMÆRK: Når m DOX repræsenterer den mængde DOX i BCMS, V 0 er det totale volumen af frigivelsen medier (200 ml), V t er rumfanget af de udskiftede medier (V t = 2 ml), Ci er koncentrationen før korrektion, og C n repræsenterer koncentrationen af DOX i prøven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3
Figur 3. Illustration af den anioniske polymerisation af phenylglycidylether på mPEG makroinitiator til frembringelse mPEG b - (PheGE) 15 til fremstilling af blokcopolymer-miceller til lastning af doxorubicin Den skematiske illustrerer deprotonering af hydroxylgruppen i mPEG hjælp naphthalen kalium. som en radikal-anion, efterfulgt af polymerisering af phenylglycidylether (PheGE) monomer. Repræsentative transmissionselektronmikroskopi billede (TEM) af BCMS farvet med uranylacetat (1% vægt / volumen) og størrelsesfordelingen af micellerne som bestemt ved dynamisk lysspredning (DLS). Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 3 blev anionisk polymerisation af phenylglycidylether på mPEG makroinitiator anvendes til fremstilling af blokcopolymer miceller (DOX-mPEG b - (PhGE) 15 for indfangning af doxorubicin En snæver molekylvægtsfordeling for mPEG b. - (PhGE) 15 copolymer blev bekræftet ved GPC (PDI = 1,03) og graden af polymerisation blev bestemt ved 1H NMR-analyse (figur 4) [σ = 7,2 ppm (m , 2H meta, phenyl 2 (= CH -)), σ = 6,8 ppm (d, 3H, 2 ortho- og para 1 (- CH -), σ = 3,95 ppm (m, 2H, O- CH2 -CH-) ] med methylenden gruppe med mPEG bruges som reference top (σ = 3,22 ppm (s, 3H).

Figur 4
Figur 4. Karakterisering og analyse. A) GPC-analyse af mPEG og copolymeren i THF. B) 1HNMR spektre af mPEG5K (øvre spektrum) og mPEG b -. (PheGE) 15 (lavere spektrum) i d6-DMSO Klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 1
Tabel 1. Beskrivelse af copolymeren.

I vandige medier, amfifile blokcopolymerer, såsom mPEG b - (PheGE) 15 samles for at danne miceller, der består af en hydrofob kerne omgivet af en hydrofil skal. CMC for copolymeren blev målt ved anvendelse af en etableret fluorescens-metode. CMC af mPEG b - (PheGE) 15 blev bestemt til at være ~ 9 ug / ml (figur 5A indsat). Transmission elektronisk mikroskopi bekræftet en sfærisk morfologi for copolymer aggregater og dermed dynamisklysspredning (figur 3 og tabel 2) blev anvendt til at vurdere den hydrodynamiske diameter (D h ~ 25 nm). Som vist i figur 6-a, blev L929 muse fibroblastceller eksponeret for mPEG b - (PhGE) 15 BCMS og blev ikke observeret nogen cytotoksicitet efter 24 timers inkubationsperiode.

Figur 5
Figur 5. Fluorescensintensitet og CMC karakterisering. A) Plot af fluorescensintensiteten af DPH som en funktion af koncentrationen af mPEG b - (Phe) 15 blokcopolymeren. Indsatte viser den tidlige fase af aggregering af blokcopolymeren ved 0,1-10 ug / ml. B) Plot af CMC værdier opnået fra litteraturen for en række copolymerer med vedhæng phenylgrupper på kernedannende blok. Røde firkanter repræsenterer de beregnede værdier for Gibbs energi af musllization af de tilsvarende copolymerer (± 0,5 kJ / mol). 22,25-28 Klik her for at se en større version af dette tal.

tabel 2
Tabel 2. Karakterisering af de BCMS fremstillet ved dialyse fremgangsmåde.

Solubilisering af lægemiddel i BCMS påvirkes af den vandige opløselighed af lægemidlet samt tilbøjeligheden til interaktion mellem lægemidlet og selv og / eller kernedannende blok af micellerne. I sin saltform, DOX er relativt opløselig (~ 10 mg / ml) i vand. Således til tilførsel til de BCMS, blev DOX opløst i acetonitril og neutraliseret med TEA at opnå den frie base (3 ækv.). Med en pKa på 8,5, DOX bliver relativt uopløselige under basiske betingelser køre indkapsling i BCMS med stabilining af π-Tr stabling interaktioner (mPEG b - (PhGE) 15). Som beskrevet i litteraturen, lignende Kapaciteter for DOX i DOX-mPEG b -. (PhGE) 15 er blevet rapporteret med en gennemsnitlig værdi på 14% (w / w) 21-24 Efter ultrafiltrering, blev det konstateret, at copolymer koncentrationer så lavt som 10 mg / ml held solubiliseret op til 1,6 mg DOX / ml. Lægemidlet belastningseffektivitet var op til 52% (vægt / vægt) for mPEG b - (PhGE) 15 BCMS (tabel 2). Frigivelsesprofilerne af DOX fra BCMS i forskellige medier blev undersøgt (figur 6c).

Figur 6
Figur 6. cytotoksicitet og drug frigivelseskinetik. A) Evaluaordning for cytotoksicitet i L929 muse fibroblastceller af mPEG b. - (PheGE) 15 copolymer miceller som bestemt under anvendelse af MTS-assayet efter en 24 timers inkubationsperiode (n = 3 individuelle eksperimenter, SD <10%) B) Normalized emissionsspektre af fri DOX og DOX-loaded miceller i PBS, pH 7,4 ved 10 ug / ml DOX koncentration. Excitationsbølgelængden er 480 nm, og emissionsspektret opsamles fra 500-700 nm C) release profiler af DOX fra blokken mPEG b. - (PhGE) 15 copolymer miceller (kvadrater) i PBS 0,1 M pH 7,4, (cirkler) i PBS 0,1 M pH 7,4 indeholdende BSA 50 mg / ml (i posen) og (trekanter) i acetat Na + buffer 0,1 M pH 5,5 og (ned trekanter) fri DOX (n = 2) i PBS pH 7,4. (for hver tilstand, n = 3 individuelle eksperimenter, SD <10%). Klik her for at se en større version af denne figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grund af den gode kontrol, anionisk polymerisation giver over molekylvægten er det en af ​​de mest anvendte processer i industrien til fremstilling af polymerer baseret på oxiran monomerer (PEG og PPG). Optimale og stringente betingelser skal anvendes for vellykket polymerisation skal opnås. Streng oprensning af alle reagenser og passende apparat er essentielle for levende karakter af syntesen. Begrænsninger i den nuværende setup er for det meste forbundet med overførslen teknik, der er afhængig af kanyle. Ved hjælp af passende tryk, kanylering er en sikker laboratorieskala teknik til det akademiske miljø. Anvendelsen af ​​disse forholdsregler vil give bedre reproducerbarhed og kontrol under polymerisationsprocessen (lav PDI). Desuden kan disse overførsel og rensning procedurer anvendes til fremstilling af copolymerer såsom mPEG b -PCL, mPEG B -PLLA, og mPEG B PAGE. 19,29 Men denne bekvemme procedure kan ikke være tilstrækkelig til polymerisering af visse monomerer, der kræver strengere betingelser (f.eks styren). Alternativt break-segl teknik normalt foretrækkes til anioniske polymerisering. 30 For at styre disse trin i industrien, er lignende systemer (rustfrit / glas) er forbundet til hinanden via hermetiske ventiler.

For oxiran monomerer, den generelle mekanisme er en nukleofilt angreb af oxyanion (fri ion eller ionpar) på oxiranringen, hvilket fører til ringåbningspolymerisation. Men afhængig af beskaffenheden af ​​substituerede oxiran monomerer, nogle monomerer kan ikke polymerisere eller de kan ikke polymeriseres til høj molekylvægt. Denne type polymerisation tåler ikke sure eller basiske komponenter, herunder monomeren selv, opløsningsmidlet eller andre arter, der fører til terminering reaktioner og / eller overførsel kæde i mediet (tab af kontrol af reaktionen). Til frembringelse af en PEGyleret blokcopolymer bærer phenylgrupper af anionisk polymerisation, kan findes alternativer til phenylglycidylether monomer: styren, styrenoxid eller allylglycidylether efterfulgt af en radikal Michael reaktion af benzylmercaptan er muligheder. mPEG kan fremstilles ved kondensation af ethylenoxid-monomer og polymeriseres derefter under de samme betingelser som beskrevet i dette dokument, ved anvendelse af en hydroxyleret initiator (fx methanol). Imidlertid mPEG af varierende molekylvægte med lav PDI er kommercielt tilgængelig.

At undgå vand rest, (f.eks mPEG-OH) har brug for makroinitiator være godt tørret ved fortørring i en ovn efterfulgt af varmepistol-tørring procedure. Reaktionerne kan udføres i polære aprotiske opløsningsmidler, koordinerende opløsningsmidler, eller i løs vægt. Når polymeriseringen kræver særlige betingelser, såsom høj temperatur, skal opløsningsmidler med en stærkere polaritet end THF anvendes, såsom DMSO, diglym eller HMPA. Som beskrevet i protokollen (afsnit 4 CaH2), der kræves. DMSO er hygroskopisk og hvis destillationen ikke er godt udført, kan spor af vand inaktivere de aktive arter. Andre opløsningsmidler kan anvendes, men DMSO har en høj opløsende evne for kationer, lav opløsende evne for anioner og tillader høj temperatur polymerisation. 31,32 DMSO er et fremragende opløsningsmiddel til basekatalyseret polymerisation af epoxider og olefiner med stærke elektrontiltrækkende substituenter. Indledning af polymerisationen kan opnås ved in situ-generering af kaliumalkoxid initiatorer gennem titrering af mPEG-OH med en fortyndet opløsning af kalium naphthalen. 33 Det er vigtigt nøje forberede opløsning af kalium naphthalen og at titrere opløsningen med syre før dets anvendelse. Faktisk hvis koncentrationen af ​​kalium naphthalen er under eller overvurderet, kan makroinitiator danne aggregater eller ikke fuldstændigt aktivereinitiativtager og til gengæld polymerisering kan være kompromitteret. Når kalium naphthalen tilsættes dråbevis, den langsomme forsvinden af ​​farve giver visuel kontrol over forbruget af basen af ​​initiator. Under disse betingelser, den hurtige protonudveksling mellem hydroxylgrupperne (hvilende) og alkoxider (aktive) sikrer en kontrolleret polymerisering af monomeren. 13

Den sammenlægning opførsel af blokcopolymerer med lignende sammensætning til MPEG 122 - b. - (PhGE) 15 er blevet undersøgt af flere grupper med rapporterede CMC-værdier fra 1 til 10 ug / ml 25,27,28,34-36 CMC-værdier for en specifik copolymer kan variere afhængigt af den specifikke metode anvendt til bestemmelse. I denne undersøgelse blev en fluorescens-baseret metode anvendt med DPH valgt som probe eftersom den kun medfører et fluorescenssignal når inkorporeret i BCMS (figur 5A indsat). Figur 5Bomfatter CMC værdierne opnået for forskellige blok-copolymerer med vedhæng phenylgrupper. Som vist varierer CMC værdier af copolymererne afhængig af beskaffenheden af polymerrygraden bærer phenylgrupperne og polymerisationsgrad. 25,27,28,34-36 Udvekslingen af copolymerkæder mellem miceller og det ydre medium afhænger tilstanden af ​​micellen kerne samt Flory-Huggins interaktion parameter mellem de to blokke og opløsningsmidlet. Glasovergangstemperaturen (Tg) af bulk PPheGE homopolymer er kendt for at være lavere end den for bulk-PS. 37 På grund af den glasagtige art PS, copolymerer med en høj grad af polymerisation af PS (n> 35) besidder en glasagtig kerne ved stuetemperatur (Tg ~ 80 ° C). 38

Termodynamisk, har to primære fremgangsmåder blevet fremført at beskrive micelledannelse proces, nemlig faseseparationen model (faseadskillelse på CMC), og massen-handling model (røvociation-dissociation ligevægt micelle / unimerer). 39 Ifølge begge tilgange, standard Gibbs energi ændring (AG ◦) til overførsel af 1 mol af amfifil fra opløsning til den micellære fase (AG ◦ frie energi micelledannelse), i fravær af elektrostatiske interaktioner, er givet ved AG ◦ = RT ln (CMC). 39 Som vist i figur 5B, værdierne for CMC og AG ◦ er i overensstemmelse med de værdier, der er opnået for copolymerer, der ligner i sammensætning (i form af total copolymer M W og forholdet mellem hydrofobe til hydrofile blok længde) til MPEG b - (PhGE) 15. som vist i tabel 1, DSC-analyse af mPEG b - (PhGE) 15 copolymer bulkmateriale bekræftet en enkelt T m ved 51 ° C, som er tilskrevet den hydrofile blok og er deprimeret i forhold tilmPEG alene (60 ° C). I løsning, antages det, at kernerne af mPEG b PS copolymer miceller, med polystyren blokke af samme længde som i PhGE i mPEG b - (PhGE) 15, begynder at blive mobil ved fysiologisk temperatur (dvs. 37 ° . C) 38,40 Derfor mPEG b - (PhGE) 15 BCMS sandsynligt har en relativt mobil kerne, som gør det muligt for lokale bevægelse ved stue- og fysiologiske temperaturer.

I denne undersøgelse dialyse og ultrafiltrering blev anvendt som et bekvemt middel til fjernelse af frit lægemiddel og at forøge koncentrationen af lægemidlet / copolymer til efterfølgende in vivo-applikationer. Alternativt kan frysetørring anvendes til at koncentrere formuleringen; Men dette kræver optimering herunder eventuel tilsætning af stabilisatorer (fx PEG, dextrose) for at forbedre befugteligheden til rekonstitution. Den resulterende DOX-mPEG b - (PhGE) 15 BCMS viste lignende sustained release profiler (PBS 7.4) til BCM-systemer udviklet af Kataoka og kolleger. 21 i PBS ved pH 7,4, blev mindre end 10% af det samlede stof frigivet inden for seks timer mens mere end 95% af den frie DOX frigives fra dialyse taske inden for samme tidsrum. Vedvarende frigivelse ved neutral pH indikerer god stabilitet af formuleringen i perioden fire-dag.

Humant blodserum består af ca. 7% protein, to tredjedele er albumin. 41 Derfor, for at simulere in vivo betingelser lægemiddelfrigivelse er almindeligt evalueret i pufferopløsninger indeholdende fysiologisk relevante koncentrationer af dette protein. I den foreliggende undersøgelse blev BSA inkluderet i dialyseposen ved en koncentration på 50 mg / ml. I nærværelse af albumin, frigivelse af DOX fra BCMS forøges til ca. 30% efter 4 dages inkubation ved 37 ° C. Frigivelse af DOX fra BCMS i buffer ved pH 5,5 bekræftet, at protonation af DOX under disse betingelser resulterer i en stigning i lægemiddelfrigivelse efter 72 timer, og dette stiger op til 60% efter 4 dage. Generelt har de resulterende DOX-BCMS vist lovende resultater in vitro, lignende eller ækvivalente med andre BCM formuleringer af DOX præsenteret i litteraturen, og således tilskynde yderligere evaluering in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/HAMF12 Gibco, Life Technologies 12500 Supplemented with 10% FBS. Warm in 37 °C water bath.
Trypsin-EDTA (0.25%) Sigma-Aldrich T4049 Warm in 37 °C water bath
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051 Canada origin
MDA-MB-468 cell line ATCC HTB-132
MTS tetrazolium reagent PROMEGA G111B
Phenazine ethosulfate (PES) Sigma-Aldrich P4544 >95%
mPEG5K (Mn 5,400 g/mol) Sigma-Aldrich 81323 PDI=1.02
Dimethylsolfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 >99.5%
Naphthalene Sigma-Aldrich 147141 >99%
Phenyl glycidyl ether Sigma-Aldrich A32608 >85%
Benzophenone Sigma-Aldrich 427551 >99%
Potassium Sigma-Aldrich 451096 >98%
Tetrahydrofuran Caledon Laboratory Chemicals 8900 1 ACS
Hexane Caledon Laboratory Chemicals 5500 1 ACS
Calcium hydride (CaH2) ACP C-0460 >99.5%
Diethyl Ether Caledon Laboratory Chemicals 1/10/4800 ACS
Microplate reader BioTek Instruments
Differential scanning calorimetry (DSC) TA Instruments Inc DSC Q100
Gel permeation chromatography (GPC) Waters 2695 separation moldule / 2414 detector  2 Columns: Agilent Plgel 5 µm Mixed-D
NMR spectroscopy Varian Mercury 400MHz
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151858 99.96%
DMSO-d Sigma-Aldrich 156914 99.96%
Vaccum pump Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc. Ultimate pressure 1x10-4 torr
Drierit with indicator, 8 mesh Sigma-Aldrich 238988 Regenerated at 230 °C for 2 hr

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickerson, T. J., Reed, N. N., Janda, K. D. Soluble Polymers as Scaffolds for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, 3325-3344 (2002).
  2. van Heerbeek, R., Kamer, P. C. J., van Leeuwen, P. W. N. M., Reek, J. N. H. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102 (10), 3717-3756 (2002).
  3. Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D., Schubert, U. S. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition. 49 (36), 6288-6308 (2010).
  4. Eetezadi, S., Ekdawi, S. N., Allen, C. The challenges facing block copolymer micelles for cancer therapy: In vivo barriers and clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 91, 7-22 (2015).
  5. Attwood, D., Booth, C., Yeates, S. G., Chaibundit, C., Ricardo, N. Block copolymers for drug solubilisation: Relative hydrophobicities of polyether and polyester micelle-core-forming blocks. International Journal of Pharmaceutics. 345 (1-2), 35-41 (2007).
  6. Matsumura, Y., Kataoka, K. Preclinical and clinical studies of anticancer agent-incorporating polymer micelles. Cancer Science. 100 (4), 572-579 (2009).
  7. Chan, A. S., Chen, C. H., Huang, C. M., Hsieh, M. F. Regulation of particle morphology of pH-dependent poly(epsilon-caprolactone)-poly(gamma-glutamic acid) micellar nanoparticles to combat breast cancer cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 10 (10), 6283-6297 (2010).
  8. Diao, Y. Y., et al. Doxorubicin-loaded PEG-PCL copolymer micelles enhance cytotoxicity and intracellular accumulation of doxorubicin in adriamycin-resistant tumor cells. International Journal of Nanomedicine. 6, 1955-1962 (2011).
  9. Mikhail, A. S., Allen, C. Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) Micelles Containing Chemically Conjugated and Physically Entrapped Docetaxel: Synthesis, Characterization, and the Influence of the Drug on Micelle Morphology. Biomacromolecules. 11 (5), 1273-1280 (2010).
  10. Kataoka, K., Harada, A., Nagasaki, Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (1), 113-131 (2001).
  11. Nakanishi, T., et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release. 74 (1-3), 295-302 (2001).
  12. Liu, J., Xiao, Y., Allen, C. Polymer-drug compatibility: A guide to the development of delivery systems for the anticancer agent, ellipticine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (1), 132-143 (2004).
  13. Flory, P. J. Molecular Size Distribution in Ethylene Oxide Polymers. Journal of the American Chemical Society. 62 (6), 1561-1565 (1940).
  14. Kazanskii, K. S., Solovyanov, A. A., Entelis, S. G. Polymerization of ethylene oxide by alkali metal-naphthalene complexes in tetrahydrofuran. European Polymer Journal. 7 (10), 1421-1433 (1971).
  15. Crothers, M., et al. Micellization and Gelation of Diblock Copolymers of Ethylene Oxide and Styrene Oxide in Aqueous Solution. Langmuir. 18 (22), 8685-8691 (2002).
  16. Taboada, P., et al. Block Copolymers of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether: Micellization, Gelation, and Drug Solubilization. Langmuir. 21 (12), 5263-5271 (2005).
  17. Taboada, P., et al. Micellization and Drug Solubilization in Aqueous Solutions of a Diblock Copolymer of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether. Langmuir. 22 (18), 7465-7470 (2006).
  18. Attwood, D., Booth, C. Colloid Stability. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 61-78 (2010).
  19. Le Devedec, F., et al. Postalkylation of a Common mPEG-b-PAGE Precursor to Produce Tunable Morphologies of Spheres, Filomicelles, Disks, and Polymersomes. ACS Macro Letters. 5 (1), 128-133 (2016).
  20. Chtryt, V., Ulbrich, K. Conjugate of Doxorubicin with a Thermosensitive Polymer Drug Carrier. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 16 (6), 427-440 (2001).
  21. Kataoka, K., et al. Doxorubicin-loaded poly(ethylene glycol)-poly(β-benzyl-l-aspartate) copolymer micelles: their pharmaceutical characteristics and biological significance. Journal of Controlled Release. 64 (1-3), 143-153 (2000).
  22. Cammas, S., Matsumoto, T., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. Design of functional polymeric micelles as site-specific drug vehicles based on poly (α-hydroxy ethylene oxide-co-β-benzyl l-aspartate) block copolymers. Materials Science and Engineering: C. 4 (4), 241-247 (1997).
  23. Lv, S., et al. Doxorubicin-loaded amphiphilic polypeptide-based nanoparticles as an efficient drug delivery system for cancer therapy. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9330-9342 (2013).
  24. Kim, J. O., Oberoi, H. S., Desale, S., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Polypeptide nanogels with hydrophobic moieties in the cross-linked ionic cores: synthesis, characterization and implications for anticancer drug delivery. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 981-993 (2013).
  25. Zhao, C. L., Winnik, M. A., Riess, G., Croucher, M. D. Fluorescence probe techniques used to study micelle formation in water-soluble block copolymers. Langmuir. 6 (2), 514-516 (1990).
  26. Wilhelm, M., et al. Poly(styrene-ethylene oxide) block copolymer micelle formation in water: a fluorescence probe study. Macromolecules. 24 (5), 1033-1040 (1991).
  27. Cammas, S., Kataoka, K. Functional poly[(ethylene oxide)-co-(β-benzyl-L-aspartate)] polymeric micelles: block copolymer synthesis and micelles formation. Macromolecular Chemistry and Physics. 196 (6), 1899-1905 (1995).
  28. Kwon, G., et al. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(.beta.-benzyl L-aspartate). Langmuir. 9 (4), 945-949 (1993).
  29. Ahmed, F., Discher, D. E. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. Journal of Controlled Release. 96 (1), 37-53 (2004).
  30. Uhrig, D., Mays, J. W. Experimental techniques in high-vacuum anionic polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 43 (24), 6179-6222 (2005).
  31. Parker, A. J. The effects of solvation on the properties of anions in dipolar aprotic solvents. Quarterly Reviews, Chemical Society. 16 (2), 163-187 (1962).
  32. Cram, D. J. Fundamentals o] Carbanion Chemistry. , (1965).
  33. Szwarc, M. ACS Symposium Series. 166, American chemistry society. 1-15 (1981).
  34. Cho, Y. W., Lee, J., Lee, S. C., Huh, K. M., Park, K. Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release. 97, 249-257 (2004).
  35. Dewhurst, P. F., Lovell, M. R., Jones, J. L., Richards, R. W., Webster, J. R. P. Organization of Dispersions of a Linear Diblock Copolymer of Polystyrene and Poly(ethylene oxide) at the Air−Water Interface. Macromolecules. 31 (22), 7851-7864 (1998).
  36. Opanasopit, P., et al. Block Copolymer Design for Camptothecin Incorporation into Polymeric Micelles for Passive Tumor Targeting. Pharmaceutical Research. 21 (11), 2001-2008 (2004).
  37. Allen, G., Booth, C., Price, C. VI-The physical properties of poly(epoxides). Polymer. 8, 414-418 (1967).
  38. Jada, A., Hurtrez, G., Siffert, B., Riess, G. Structure of polystyrene-block-poly(ethylene oxide) diblock copolymer micelles in water. Macromolecular Chemistry and Physics. 197 (11), 3697-3710 (1996).
  39. Attwood, D., Florence, A. T. Surfactant systems : their chemistry, pharmacy, and biology. , Chapman and Hall. (1983).
  40. Rekatas, C. J., et al. The effect of hydrophobe chemical structure and chain length on the solubilization of griseofulvin in aqueous micellar solutions of block copoly(oxyalkylene)s. Physical Chemistry Chemical Physics. 3 (21), 4769-4773 (2001).
  41. Encyclopædia Britannica Online. , http://www.britannica.com/EBchecked/topic/479680/protein/72559/Proteins-of-the-blood-serum (2015).

Tags

Kemi anionisk polymerisation blokcopolymersystemer miceller phenylglycidylether doxorubicin drug delivery π-Tr stabling interaktioner
Anionisk polymerisation af en amfifil Copolymer for Udarbejdelse af blokcopolymer Miceller stabiliseret af π-Tr Stacking Interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Le Dévédec, F., Houdaihed, … More

Le Dévédec, F., Houdaihed, L., Allen, C. Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by π-π Stacking Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54422, doi:10.3791/54422 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter