Summary
De viktigaste stegen av levande anjoniska polymerisationen av fenylglycidyleter (PheGE) på metoxi-polyetylenglykol (MPEG b -PPheGE) beskrivs. De resulterande segmentsampolymer miceller (BCMS) laddades med doxorubicin 14% (vikt-%) och utdragen frisättning av läkemedel under 4 dygn under fysiologiskt relevanta förhållanden erhölls.
Abstract
I denna studie var en amfifil sampolymer som innehåller en kämbildande block med fenylgrupper syntetiseras genom levande anjonisk polymerisation av fenylglycidyleter (PheGE) på metoxi-polyetylenglykol (MPEG-b -PPheGE). Karakterisering av sampolymeren visade en snäv molekylfördelning (PDI <1,03) och som bekräftas av graden av polymerisation av mPEG 122 - b - (PheGE) 15. Den kritiska micellkoncentrationen av sampolymeren utvärderades med användning av en etablerad fluorescensmetod med aggregationen beteende utvärderades genom dynamisk ljusspridning och transmission elektronmikroskopi. Potentialen av sampolymeren för användning i läkemedelsleveranstillämpningar utvärderades i en preliminär sätt, inklusive in vitro biokompatibilitet, lastning och frigörande av hydrofoba läkemedel mot cancer doxorubicin (DOX). En stabil micell formulering av DOX framställdes med läkemedelsbelastningsnivåer upp till 14% (vikt%), läkemedelsbelastning effici-film> 60% (vikt / vikt) och utdragen frisättning av läkemedel under 4 dygn under fysiologiskt relevanta förhållanden (surt och neutralt pH, närvaro av albumin). Den höga läkemedelsladdningsnivån och fördröjd frisättning tillskrivs att stabilisera n-π växelverkan mellan DOX och kärnbildande block av micellerna.
Introduction
I vattenhaltiga medier, amfifila segmentsampolymerer samlas för att bilda nanostora segmentsampolymer miceller (BCMS) som består av en hydrofob kärna omgiven av ett hydrofilt skal eller korona. Micellen kärna kan tjäna som en reservoar för inkorporering av hydrofoba läkemedel; medan, tillhandahåller den hydrofila korona ett gränssnitt mellan kärnan och det externa mediet. Poly (etylenglykol) (PEG) och dess derivat är en av de viktigaste klasserna av polymerer och en av de mest använda inom läkemedelsformulering. 1-3 BCMS har visat sig vara en värdig läkemedelsavgivning plattform med flera formuleringar förlita sig på denna teknik nu i sen klinisk utvecklingsfas. 4 vanligast är det hydrofoba blocket av sampolymeren består av polykaprolakton, poly (D, L-laktid), poly (propylenoxid) eller poly (β-bensyl-L-aspartat). 5 -9
Kataoka grupp undersökte sfäriska miceller bildade från PEO- B b -. (Polyasparaginsyra-konjugerat doxorubicin) för leverans av doxorubicin (DOX) 10,11 i sina rapporter, de sätter fram att π-Tt interaktioner mellan polymer-konjugerat läkemedel eller PBLA och fri DOX agera för att stabilisera micellen kärnan resulterar i ökade läkemedelsladdning och lagring. Det är klarlagt att kompatibiliteten eller interaktioner mellan läkemedel och kärnbildande blocket är faktorer som påverkar viktiga prestandarelaterade parametrar. 12 Förutom DOX, ett antal cancerterapi inkluderar aromatiska ringar inom sin kärnstruktur (t.ex. metotrexat, olaparib, SN -38).
Som ett resultat finns det ett stort intresse för syntes av sampolymerer som innefattar bensyl ringar i sina kärnbildande block. Anjonisk ringöppningspolymerisation av PEG och dess derivat möjliggöra kontroll över molekylvikt och resulterar i material med låg polydispersitet i gott utbyte. 13,14 etylenne oxid med fenylglycidyleter (PheGE) eller styrenoxid (SO) kan vara (sam) polymeriseras för att bilda segmentsampolymerer som bildar miceller för solubilisering av hydrofoba läkemedel. 15-18 Den aktuella rapporten beskrivs de åtgärder som krävs för att leva anjoniska polymerisationen av fenyl glycidyleter monomer på mPEG-OH som makroinitiator (Figur 1). Den resulterande segmentsampolymeren och dess aggregat karakteriseras sedan med avseende på egenskaper som är relevanta för användning i läkemedelsavgivning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1. Schematisk visar de nio viktiga steg i beredningen av MPEG b -PPheGE sampolymer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Beredning av reagenser på torr vägbana
- Framställning av reagensen.
- Väg 15 g av mPEG-5K (Mn = 5400 g / mol, PDI 1,03) och placera vid 50 ° C i en ugn under vakuum under 48 h före användning.
- Torr 200 ml dimetylsulfoxid (DMSO) över kalciumhydrid (CaH2) (~ 1 g), placerades under vakuum under 30 min, purge under argon och rör om under 48 timmar före användning.
- Placera 50 ml av PheGE monomer i en torr och ren kolv (100 ml), tillsätt 1 g CaH2, tätning under vakuum i 15 minuter på is, utrensning under argonoch lämna under omrörning under 24 h under argon före användning.
2. Beredning av kalium Naftalen
- Noggrant, skär små bitar av natrium (~ 1,5 g) torkades med hexan för att avlägsna överskott av mineralolja och lägg till den runda kolven innehållande tetrahydrofuran (THF) (v = 500 ml).
OBS: De bitar av natrium får inte utsättas för luft under lång på grund av risk för brand. - Lägg bensofenon (~ 5 g), rensa med argon och försegla rundkolv (2 halsar) med glasproppar.
- Efter omröring under argon i 24 h, anslut den rundbottnade kolven till en destillationsapparat (Figur 2), destillera den mörka lösningen under argon medan återloppskokning (dvs., återloppskokning under ca en 2 h period efter det att lösningen blir blå). Börjar att samla ihop den önskade volymen ~ 150 ml THF genom att stänga den vänstra ventilen (som finns i mitten av destillationsapparaten).
OBS: Om den här lösningen inte blir blå, stoppa Distilningen svalna i rumstemperatur (RT) och tillsätt mer bensofenon eller natrium och starta om destillation. Detta är en indikation på att THF fortfarande innehåller vatten. - I en torr Erlenmeyerkolv tillsätt destillerat THF (v = 100 ml) och lös 3,9 g naftalen.
OBS: Stoppa destillation, svalna vid RT och öppna den högra ventilen för att överföra volymen av THF. - Som beskrivits i punkt 2.1, skär små bitar av kalium (1,1 g) och tillsätt lösningen innehållande naftalen (slutlig koncentration ~ 0,3 mol / L). Täta Erlenmeyerkolven med en spolnings adapter (T) (on / off) med en skiljevägg upptill och rensa med argon.
- Efter omröring under argon i 24 h, observera den resulterande lösningen av kalium naftalen basen som ett homogent mörkgrön färg.
- Under inerta betingelser, ta bort en 5 ml alikvot av den basiska lösningen från kolven med en spruta och tillsätt till 10 ml destillerat vatten. Därefter tillsätt 1-2 droppar fenolftalein-indikator till denna lösning,som vänder lösningen en fuchsia färg.
- Använd en byrett för att titrera kalium naftalen lösningen med en standardlösning av saltsyra (0,1 N) tills lösningen blir färglös.
3. Material och nödvändiga försiktighetsåtgärder för effektiv Living anjonpolymerisation
- System argon / vakuum grenrör.
OBS: Som beskrivs i figur 2, är en dubbel glas grenrör med ihåliga glas kranar används för att växla mellan argon leverans och vakuumförhållanden i glas.- Anslut tank argon (med manometer) till en torr torkpelaren och grenrörs rad med inert gummislang. Vid den andra änden av argon linje, ansluter en bubblare (innehållande mineralolja).
- Till glas kranar, anslut flexibla inerta rör och nålar. Till den andra linjen av grenröret, anslut en glasfälla nedsänkt i en kall Dewar-kolv (fylld med is / vatten eller flytande kväve) till en hög vakuumpump.
- Apparat för destillation av monomer och DMSO.
OBS! En bekväm (dvs., alla i en) anordning för högvakuumdestillation användes (Figur 2). Den torra glasvaror är gjord med hög vakuumventiler, och inbyggda kondensatorer med en inre kylt huvud.- Anslut vattenflödet genom inlopp (A) och utlopp (B) av kylenhet (brev). Anslut den andra inlopp / utlopp (C) till den dubbla grenröret för argon / vakuum. Lägg till och försegla en skiljevägg (metalltrådar) vid leveransen / extraktion sport och anslut en kanyl av rostfritt stål för överföring av luftkänsliga vätskor (D) (upptill / loop).
- Före polymerisering destillera PheGE och DMSO på halvsfäriska uppvärmningsmantlar vid 100 ° C och 70 ° C, respektive, under 2 timmar under vakuum med omröring. Den PheGE monomer kokpunkt är 254 ° C, medan kokpunkten för DMSO är 189 ° C vid (1 atm).
- Glas för anjonisk polymerizatJon.
- Förutom destillation systemet använder endast högvakuum resistent glas inklusive rund botten kolvar (certifierade av tillverkaren), mätglas (för överföring av volymer av lösningsmedel, bas och monomerer), kanyler, septa och metalltrådar för att täta skiljeväggarna.
OBS: För levande polymerisation, värme noggrant (under vakuum) och kyla ner alla glasvaror under argon flöde före användning. Håll värmepistol på ett avstånd ~ 10 cm från glas.
- Förutom destillation systemet använder endast högvakuum resistent glas inklusive rund botten kolvar (certifierade av tillverkaren), mätglas (för överföring av volymer av lösningsmedel, bas och monomerer), kanyler, septa och metalltrådar för att täta skiljeväggarna.
Figur 2. Montering och viktiga destillation / överföringssteg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.4. Beskrivning av de viktigaste stegen i Living anjonpolymerisation: Destillering och överföring
- Väg mPEG-5K (2 mmol, 10 g) i en torr fLask / Schlenk (ugn) innehållande en omrörarstav och försegla spolnings adapter (T) (på / av) med ett septum på toppen.
- Anslut kolven till fördelaren och rensa kolven i 2-3 min med argon spolningar. Vrid ventilen till vakuumläget för att spola kolven.
- Rotera kolven manuellt och torka reaktionskärlet homogent med en fön (värmepistol) tills mPEG-5K smälter.
OBS: Håll värmepistol på ett avstånd ~ 10 cm från kolven. - Efter 1 min, bryta vakuumet genom att vrida ventilen på grenröret mot argon ställning med flera snabba snaps.
OBS: Ett kontinuerligt argonflöde skall beaktas i bubbel. När flödet är kontinuerligt, förblir ventilen på argon position. Upprepa uppvärmning och kylningssteg två gånger för att avlägsna alla spår av fukt. - Håll polymera makroinitiator under vakuum för ~ 2 timmar och under argon innan reaktionen börjar.
- Mount två högvakuumdestillation apparater under huven (figure 2); en för destillation av DMSO och ett för destillation av monomeren (PheGE).
- Ansluta de separata kolvar innehållande DMSO och monomer till de två apparaterna och installera var och en på en halvsfärisk värmemantel (eller i ett oljebad). Ansluta kallt vatten till toppen av apparaten (in / ut) och till grenröret (argon / vakuum).
- Se till att varje apparat är säker och väl tillslutna. Engagera vakuumet via ventilen.
OBS:. Såsom beskrivs i steg 3,3, upprepa uppvärmning och kylningssteg två gånger för att avlägsna alla spår av fukt. - Ställ in värme via en temperaturregulator och börja omröring lösningarna. Efter två timmar av cirkulations / destillation av DMSO, stäng högvakuum ventilen (som finns i mitten av destillationsapparat) att samla ca 20 ml lösning (för att tvätta insidan av apparaten). Släpp sedan fraktionen in i kolven och upprepa procedur ytterligare en gång för att säkerställa renheten hos den önskade fraktionen som är collected senare.
- Värm kolven innehållande MPEG-5K (under vakuum) med värmepistol tills polymeren (MPEG-5K) smälter. Rensa igen med argon.
OBS: Proceduren kommer att bidra till upplösningen efter överföringen av DMSO. - Efter 2 timmar, stänga högvakuum ventilen och samla volymen av lösningsmedel (V DMSO = ~ 100 ml). Stoppa värme och bryta vakuumet från grenröret. Frigöra argon (genom tryckknappar) in i kammaren såsom beskrivits ovan.
- Under ett positivt tryck av argon, anslut ena sidan av kanylen (håll vid kranen av apparaten) till en graderad cylinder eller direkt till kolven innehållande MPEG-5K (om destillationsapparaten har examen) och sänk den andra änden försiktigt in i nydestillerad fraktionen.
- Med användning argontryck, driva DMSO genom kanylen in i reaktionskolven. Anslut en extra bubblare till kolven (eller cylinder vid behov för mätning) och stänger glas kranen ansluten till the bubblare på den motsatta sidan av grenröret.
NOTERA: När en sida av en kanyl avlägsnas för överföring, se till att positivt argontryck appliceras. - För att undvika olyckor orsakade av argontryck, öppna glas kranen för 1-2 sekunder och återförsluta för att fortsätta flödet av DMSO (upprepas en gång per 0,5 min) tills hela överföringen är klar. Öppna kranen när du är klar.
OBS: Samma procedur måste nu följas för destillering och insamling av monomeren. Lösningsmedlet och monomeren kan inte samlas in på samma gång. - Överföring 5 ml 0,3 M naftalen kalium via kanyle i en graderad cylinder förseglad med ett septum med kanyl införd (en slinga).
OBS: Samma försiktighet som beskrivs i not 4.13. Positivt argontryck måste upprätthållas först från naftalen kalium kolven till cylindern och sedan från cylindern till reaktionskolven för att undvika luft / vattenförorening. - Sätt in en annan nål från manifold in i cylindern (argon). Avlägsna kanylen ansluten till destillationssystemet noggrant och sätt snabbt in i reaktionskolven.
OBS: Använd denna teknik för överföring av basen och monomer. - Tillsätt bas droppe för droppe tills lösningen blir mörkt. Efter den långsamma försvinnandet av färg, lägga till en annan del tills den mörka färgen visas igen, och upprepa tills hela överföringen.
- Överföra den önskade volymen av monomer (V PheGE = 5 ml) för att nå en polymerisationsgrad av PPheGE ~ n = 18-20.
- Låt reaktionen under 48 timmar vid 80 ° C under argonatmosfär under konstant omröring för att säkerställa fullständig polymerisation.
- Släck reaktionen genom tillsats av droppar av HCI 1 N i metanol (mätt med användning av lackmuspapper (neutralt pH)) och observeras av en färg försvinnande.
- Extrahera naftalen från DMSO-lösningen med hexan (3 x 50 ml). Ta bort DMSO genom destillation under vakuum ~ 70 ml (samma apparater). Kuttral ned lösningen uppslamning och tillsätt 50 ml THF.
- Ta bort saltet från uppslamningen lösningen genom centrifugering vid 5000 xg under 10 min. Överför supernatanten, och tillsätt droppvis till 500 ml kall dietyleter.
- Samla upp fällningen genom filtrering eller centrifugering (upprepa två gånger) och torka under vakuum vid 30 ° C under 24-48 h (utbyte 85%).
OBS: Sampolymeren är nu klar för karakterisering.
5. Karakterisering av Sampolymerer
- Väg 5-10 mg sampolymer (rekord den verkliga massan) i en aluminiumprovpanna och försegla hermetiskt med locket aluminium. Belastningsprov pan och referens pan (tom) i differentialscanningskalorimeter.
- Programmet en metod ( "värme / kyla / värme") cykel: 1) värme från 40 ° C till 100 ° C vid 10 ° C / min, 2) kyl till -70 ° C vid 10 ° C / min, 3) värme till 100 ° C vid 10 ° C / min. Upprepa 2) och 3) två gånger. Bestämma smältpunkt (T m), kristallization (T c) och glastemperaturer (Tg), och smältvärme (AH f) från de termiska spår från den tredje cykeln (i förekommande fall).
- Upplösa polymerer i THF (2 mg / ml) och filtrera genom ett 0,2 ^ m PTFE-filter. Injicera provet i en gelpermeationskromatografi systemet (50 | il) och använda retentionstiden för provet och en kalibreringskurva som framställts med användning av ett intervall av polystyrenstandarder för att bestämma molekylvikten hos polymeren. 19
- Upplösa (sam) polymerer (15 mg / ml) i d6 DMSO för ett H-NMR-spektroskopi-analys. 19
- Bestämma den kritiska micellkoncentrationen (CMC) för sampolymeren med användning av 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien (DPH) som en fluorescenssond. 9
- Förbered en DPH stamlösning i THF (2,32 mg / L) i mörker och tillsätt 100 pl av denna stamlösning till var och en av en serie flaskor.
- Prepare en sampolymer stamlösning i THF och tillsätt alikvoter av lika stor volym (2 ml) till serien av ampuller (vardera innehållande en alikvot av DPH stamlösning) resulterar i slutliga sampolymer-koncentrationer som sträcker sig från 0,01 till 1000 | j, g sampolymer / ml.
- Därefter, virvel sampolymeren-DPH lösningar och tillsätt droppvis till 10 ml dubbeldestillerat vatten under omrörning bar. Lösningarna måste därefter omrördes kraftigt i mörker i 48 timmar under en ström av kväve för att tillåta långsam förångning av THF. Den slutliga koncentrationen av DPH i varje lösning är 0,232 mg / L.
- Mät fluorescensemissionen av proverna vid 430 nm (λ ex = 350 nm) med hjälp av en dubbel-scanning mikro spektrofluorometer och plot fluorescens mot log [polymer]. Interceptet mellan de två linjära backarna tillhandahåller CMC värde för sampolymeren.
6. Förfarande för Laddar doxorubicin i BCMS
- Lös 12 mg DOX i 1 ml acetonitrile, tillsätt 10 | il trietylamin och låt lösningen rör i mörker under två timmar.
- Upplösa sampolymeren (45 mg) i 1 ml THF och rör om under samma tidsperiod. Lägga sampolymerlösningen till DOX lösningen och skölj flaskan innehållande rest-sampolymer med en extra volym av THF (0,5 ml).
- Lägga sampolymeren-läkemedelsblandningen (2,5 ml) droppvis till en flaska (20 ml) innehållande 15 ml saltlösning 0,9% (NaCl) under omröring.
- Överför lösningen till en dialyspåse (3,5 kDa avskuren) och dialysera mot saltlösning 0,9% (500 ml).
OBS: Ändra extern saltlösning efter 6 h och låta dialysen fortsätter under 24 timmar under omröring i mörker vid RT. - Överföra dialysatet till ett 50 ml rör och centrifugera vid 5000 xg under 15 min.
- Överför supernatanten till ett ultrafiltreringssystem (med en 10 ml kapacitet), som innehåller ett dialysmembran (avskuren 10 kDa). Sätt omrörning adaptern i ultrafiltreringssystem, stäng locket och öppna för somtream av kväve.
- Koncentrera BCM lösningen till en volym av 4 ml och tillsätt 6 ml färsk saltlösning och upprepa proceduren två gånger.
- Koncentrera BCM lösningen till 4 ml, skölj kammaren med 0,5 ml koksaltlösning och tillsätt till lösningen. Förvaras i bruna flaskor vid RT i mörker före vidare användning.
7. Utvärdering av doxorubicin Loading i DOX-BCMS
- Lös DOX-BCM i dimetylformamid (100 pl i 400 pl) för att störa micellema och späd i vattenlösning av HCl (0,1 N) före utvärdering (100 ul i 900 pl HCI 0,1 N).
- Mät läkemedelsbelastning på 490 nm med hjälp av en bänk mikro spektrofotometrisk systemet. Använd följande ekvationer för att bestämma läkemedels lastkapacitet (DLC) och läkemedelsladdningseffektivitet (DLE):
DLC (vikt-%) = (vikt av läkemedelsladdade / total vikt av BCMS) x 100%
DLE (%) = (vikt av läkemedelsladdade / vikt av läkemedel i foder) x 100%
8. Utvärderingav in vitro frisättning av DOX från DOX-BCMS
- Undersöka frisättning av DOX från BCMS vid 37 ° C i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) mot PBS pH 7,4 innehållande 0,1% (vikt / volym) Tween 80, BCMS + BSA (50 mg / ml) mot PBS pH 7,4 och 0,1 M acetat-buffert vid pH = 5,5. 20,21
- Späd BCM-DOX formulering (700 l) i den valda bufferten (2,3 ml) för att resultera i en total mängd av ≈ 0,6-0,7 mg DOX i dialyspåsen.
- Placera lösningen i dialyspåsen, förslut med clips och sänk påsen i 200 ml respektive externa media.
- Ta 2 ml av lösningen utanför dialyspåsen vid förutbestämda tidpunkter och ersätt med samma volym färsk buffert.
- Lagra alikvoter avlägsnades vid -20 ° C före analys genom UV-Vis-spektrofotometri (Abs 490 nm). Den kumulativa andelen frisatt läkemedel (E r) kan beräknas med hjälp av följande ekvation:
OBS: Där m DOX representerar mängden DOX i BCMS, är V 0 den totala volymen av frigöringsmedium (200 ml), V t volymen av de ersatta media (V t = 2 ml), Ci är koncentrationen före korrigering, och C n representerar koncentrationen av DOX i provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3. Illustration av den anjoniska polymerisationen av fenylglycidyleter på mPEG makroinitiator för att producera MPEG b - (PheGE) 15 för framställning av segmentsampolymer miceller för laddning av doxorubicin Den schematiska illustrerar deprotonering av hydroxylgruppen hos mPEG med användning av naftalen kalium. som en radikal-anjonen, följt av polymerisation av fenylglycidyleter (PheGE) monomer. Representativa transmissionselektronmikroskopbild (TEM) av BCMS färgade med uranylacetat (1% vikt / volym) och storleksfördelning av micellema som bestäms genom dynamisk ljusspridning (DLS). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
figur 3, var anjonisk polymerisation av fenylglycidyleter på mPEG makroinitiator som användes för framställning segmentsampolymerarmar miceller (DOX-MPEG-b - (PHGE) 15 för infångning av doxorubicin En smal molekylviktsfördelning för MPEG-b -. (PHGE) 15 sampolymeren bekräftades genom GPC (PDI = 1,03) och graden av polymerisation bestämdes genom 1H NMR-analys (figur 4) [σ = 7,2 ppm (m , 2H meta, fenyl 2 (= CH -)), σ = 6,8 ppm (d, 3H, två orto och en para (- CH -), σ = 3,95 ppm (m, 2H, O-CH 2-CH-) ] med metyländen grupp med mPEG används som en referenstopp (σ = 3,22 ppm (s, 3H).
Figur 4. Karakterisering och analys. A) GPC-analys av mPEG och sampolymeren i THF. B) 1 HNMR-spektra för mPEG5K (övre spektrum) och MPEG-b -. (PheGE) 15 (lägre spektrum) i d6-DMSO Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Egenskaper hos sampolymeren.
I vattenhaltiga medier, amfifila segmentsampolymerer, såsom MPEG-b - (PheGE) 15 samman för att bilda miceller som består av en hydrofob kärna omgiven av ett hydrofilt skal. CMC av sampolymeren mättes med användning av en etablerad fluorescensmetoden. CMC av MPEG b - (PheGE) 15 bestämdes vara ~ 9 pg / ml (Figur 5A infälld). Transmission elektronmikroskopi bekräftade en sfärisk morfologi för sampolymeren aggregaten och således dynamiskljusspridning (Figur 3 och Tabell 2) användes för att utvärdera den hydrodynamiska diameter (Dh ~ 25 nm). Såsom visas i figuren 6-a, var L929 mus-fibroblastceller exponeras för MPEG-b - (PHGE) 15 BCMS och ingen cytotoxicitet observerades efter 24 hr inkubationsperioden.
Figur 5. Fluorescensintensitet och CMC karakterisering. A) Rita av fluorescensintensiteten hos DPH som en funktion av koncentration av MPEG-b - (Phe) 15 segmentsampolymer. Infällda bilden visar ett tidigt skede av aggregation av segmentsampolymeren vid 0,1-10 | ig / ml. B) Rita av CMC-värden erhållna från litteraturen för ett antal av sampolymerer med hängande fenylgrupper på kämbildande blocket. Röda fyrkanter representerar de beräknade värdena för Gibbs energi mössllization av motsvarande sampolymerer (± 0,5 kJ / mol). 22,25-28 klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 2. Karakterisering av BCMS framställda genom dialysmetoden.
Solubilisering av läkemedlet i BCMS påverkas av den vattenhaltiga lösligheten av läkemedlet såväl som benägenheten för interaktion mellan läkemedlet och sig själv och / eller den kärnbildande block av micellerna. I dess saltform, är DOX relativt lösliga (~ 10 mg / ml) i vatten. Sålunda för att ladda in i BCMS ades DOX löstes i acetonitril och neutraliserades med TEA för att erhålla den fria basen (3 ekv.). Med pKa 8,5, blir DOX relativt olöslig under basiska betingelser som driver inkapsling i de BCMS med stabilisering av π-Tt stapling interaktioner (MPEG b - (PHGE) 15). Som beskrivits i litteraturen, liknande kapacitet laddar för DOX i DOX-MPEG b -. (PHGE) 15 har rapporterats med ett medelvärde av 14% (v / v) 21-24 Efter ultrafiltrering, konstaterades det att sampolymer koncentrationer så låga som 10 mg / ml med framgång solubiliseras upp till 1,6 mg DOX / ml. Läkemedelsladdningen Effektiviteten var upp till 52% (vikt / vikt) för MPEG-b - (PHGE) 15 BCMS (tabell 2). Frisättningsprofilerna för DOX från de BCMS i olika medier undersöktes (figur 6c).
Figur 6. cytotoxicitet och läkemedelsfrisättningskinetiken. A) Evaluaning av cytotoxicitet i L929 musfibroblastceller av MPEG B -. (PheGE) 15 sampolymer miceller som bestäms med hjälp av MTS-analys efter en 24 h inkubationsperiod (n = 3 olika experiment, SD <10%) B) Normaliserad emissionsspektra av fri DOX och DOX-laddade miceller i PBS, pH 7,4 vid 10 | ig / ml DOX-koncentrationen. Excitationsvåglängden är 480 nm och emissionsspektrat hämtas från 500-700 nm C) Release profiler av DOX från blocket MPEG B -. (PHGE) 15 sampolymer miceller (kvadrater) i PBS 0,1 M pH 7,4, (cirklar) i PBS 0,1 M pH 7,4 innehållande BSA 50 mg / ml (i påsen) och (trianglar) i acetat Na + buffert 0,1 M pH 5,5 och (ner trianglar) fri DOX (n = 2) i PBS pH 7,4. (för varje tillstånd, n = 3 olika experiment, SD <10%). Klicka här för att se en större version av denna figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av den goda kontroll som anjonpolymerisation ger över molekylvikt är en av de mest tillämpade processer i industrin för framställning av polymerer baserade på oxiran-monomerer (PEG och PPG). Optimala och stringenta betingelser måste användas för framgångsrik polymerisation skall uppnås. Rigorös rening av alla reagenser och lämpliga apparater är väsentliga för den levande karaktären av syntesen. Begränsningar i det nuvarande uppställnings är oftast i samband med överföringsteknik som bygger på kanyle. Med hjälp av lämpligt tryck, är kanyle ett säkert laboratorieskala teknik för akademisk miljö. Tillämpa dessa försiktighetsåtgärder kommer att ge bättre reproducerbarhet och kontroll under polymerisationsprocessen (lågt PDI). Dessutom kan dessa överförings och reningsmetoder användas för framställning av sampolymerer, såsom MPEG-B -PCL, MPEG b -PLLA, och MPEG-B -sidan. 19,29 dock bekvämt procedure kanske inte är tillräcklig för polymerisation av vissa monomerer som kräver strängare villkor (t.ex. styren). Alternativt break-tätningsteknik vanligtvis föredras för anjonpolymerisation. 30 För att kontrollera dessa steg inom industrin, är liknande system (rostfritt / glas) är förbundna med varandra via hermetiska ventiler.
För oxiran monomerer, är den allmänna mekanismen en nukleofil attack av oxianjon (fri jon eller jonpar) på oxiranringen, vilket leder till ringöppningspolymerisation. Men beroende på vilken typ av substituerade oxiran monomerer, vissa monomerer kan inte polymerisera eller de kanske inte polymeriseras till hög molekylvikt. Denna typ av polymerisation inte tolererar sura eller basiska komponenter, inklusive monomeren själv, lösningsmedlet eller andra arter som leder till termineringsreaktioner och / eller kedjeöverföring i mediet (förlorad kontroll av reaktionen). För att producera en PEGylerad segmentsampolymer bärande fenylgrupper genom anjonisk polymerisation, kan alternativ till fenylglycidyleter monomer hittas: styren, styrenoxid eller allylglycidyleter följt av en radikal Michael reaktion av bensylmerkaptan finns alternativ. mPEG kan framställas genom kondensation av etylenoxid monomeren och sedan polymeriseras under samma betingelser som beskrivs i detta dokument, med hjälp av en hydroxylerad initiator (t.ex., metanol). Dock är mPEG med varierande molekylvikter med låg PDI kommersiellt tillgängliga.
Att undvika att vatten rest, den makroinitiator (t.ex., mPEG-OH) måste vara väl torkas genom förtorkning i en ugn, följt av värmepistol-torkningsproceduren. Reaktionerna kan utföras i polära aprotiska lösningsmedel, koordinerande lösningsmedel, eller i bulk. När polymerisationen kräver särskilda villkor, såsom hög temperatur, måste lösningsmedel med en starkare polaritet än THF användas, såsom DMSO, diglym eller HMPA. Såsom beskrivs i protokollet (avsnitt 4 CaH2). DMSO är hygroskopisk och om destillation inte väl genomförd, kan spår av vatten inaktivera det aktiva ämnet. Andra lösningsmedel kan användas, men DMSO har en hög solvatiserande förmågan för katjoner, låg solvatiserande förmågan för anjoner och tillåter polymerisationsförfarande vid hög temperatur. 31,32 DMSO är ett utmärkt lösningsmedel för baskatalyserad polymerisation av epoxider och olefiner med starka elektrondragande substituenter. Initiering av polymerisationen kan åstadkommas genom alstring in situ av kaliumalkoxid initiatorer genom titrering av mPEG-OH med en utspädd lösning av kalium naftalen. 33 Det är viktigt att noggrant framställa lösningen av kalium-naftalen och att titrera lösningen med syra före dess användning. Faktum är att om koncentrationen av kalium naftalen är under eller överskattas, kan makroinitiator bilda aggregat eller misslyckas med att fullständigt aktiverainitiator och i sin tur polymerisationen kan äventyras. När kalium naftalen tillsätts droppvis, ger den långsamma försvinnandet av färg visuell begränsning av förbrukningen av basen av initiatorn. Under dessa betingelser, den snabba protonutbyte mellan de hydroxylgrupper (vilande) och alkoxider (aktiva) säkerställer en kontrollerad polymerisation av monomeren. 13
Sammanläggning beteende segmentsampolymerer med liknande sammansättning till MPEG 122 - b -. (PHGE) 15 har undersökts av flera grupper med redovisade CMC-värden från 1 till 10 ng / ml 25,27,28,34-36 CMC-värden för en specifik sampolymer kan variera beroende på den specifika metod som används för bestämning. I denna studie framställdes en fluorescensbaserad metod som används med DPH valts som sonden med tanke på att den endast resulterar i en fluorescenssignal när den väl införlivats i de BCMS (figur 5A infälld). Figur 5Binnefattar CMC-värden som erhållits för olika segmentsampolymerer med hänge fenylgrupper. Såsom visas, CMC-värdena för de sampolymerer varierar beroende på beskaffenheten av polymerhuvudkedjan som bär fenylgrupperna och polymerisationsgrad. 25,27,28,34-36 Utbytet sampolymerkedjor mellan micellerna och det externa mediet beror på tillståndet i micellen kärna samt Flory-Huggins interaktionsparameter mellan de två blocken och lösningsmedlet. Glasövergångstemperaturen (Tg) för bulk PPheGE homopolymer är känd för att vara lägre än den hos bulk PS. 37 På grund av den glasartade natur PS, sampolymerer med en hög grad av polymerisation av PS (n> 35) besitter en glasartad kärna vid RT (Tg ~ 80 ° C). 38
Termodynamiskt, har två huvudsakliga tillvägagångssätt lagts fram för att beskriva micellization processen, nämligen fasseparationen modellen (fasseparation vid CMC), och massverkande modell (association-dissociation jämvikt micell / unimers). 39 Enligt båda tillvägagångssätten, standarden Gibbs energi förändring (AG ◦) för överföring av en mol av amfifil från lösning till micellär fas (AG ◦ fria energin för micellization), i frånvaro av elektrostatiska interaktioner, ges av AG ◦ = RT ln (CMC). 39 Såsom visas i figur 5B, värdena för CMC och AG ◦ överensstämmer med de värden som erhållits för sampolymerer som har liknande sammansättning (i termer av total sampolymer M W och förhållandet mellan hydrofoba till hydrofila blocklängd) till MPEG-b - (PHGE) 15. Såsom visas i tabell 1, DSC-analys av MPEG-b - (PHGE) 15 sampolymer bulkmaterial bekräftade en enda T m vid 51 ° C, som kan tillskrivas den hydrofila blocket och är intryckt relativtensam mPEG (60 ° C). I lösning, antas det att kärnorna i MPEG b -PS sampolymer miceller, med polystyren block av samma längd som i PHGE i MPEG b - (PHGE) 15, börjar bli mobil vid fysiologisk temperatur (dvs 37 ° . C) 38,40 Därför MPEG b - (PHGE) 15 BCMS sannolikt har en relativt mobil kärna som möjliggör lokal rörelse i rummet och fysiologiska temperaturer.
I denna studie dialys och ultrafiltrering användes som ett bekvämt sätt för att avlägsna fritt läkemedel och för att öka koncentrationen av läkemedlet / sampolymeren för efterföljande in vivo-tillämpningar. Alternativt kan frystorkning användas för att koncentrera formuleringen; Detta kräver dock optimering inklusive eventuell tillsats av stabilisatorer (t.ex. PEG, dextros) för att förbättra vätbarheten för beredning. Den resulterande DOX-MPEG b - (PHGE) 15 BCMS visade liknande sustained frisättningsprofiler (PBS 7,4) och BCM system som utvecklats av Kataoka och medarbetare. 21 i PBS vid pH 7,4, var mindre än 10% av den totala frisatt läkemedel inom sex timmar medan mer än 95% av den fria DOX frigörs från dialys väska inom samma tidsperiod. Fördröjd frisättning vid neutralt pH indikerar god stabilitet av formuleringen över fyra-dagars period.
Humant blodserum består av cirka 7% protein, varav två tredjedelar är albumin. 41 Därför, för att simulera in vivo-förhållanden frisättning av läkemedel är vanligen utvärderas buffertlösningar innehållande fysiologiskt relevanta koncentrationer av detta protein. I föreliggande studie, var BSA ingår i dialyspåsen i en koncentration av 50 mg / ml. I närvaro av albumin, frisättningen av DOX från BCMS ökas till ca 30% efter 4 dagars inkubation vid 37 ° C. Frisättning av DOX från BCMS i buffert vid pH 5,5 bekräftade att protonation av DOX under dessa betingelser resulterar i en ökning av läkemedelsfrisättning efter 72 timmar och detta ökar upp till 60% efter 4 dagar. Sammantaget resulterande DOX-BCMS har visat lovande resultat in vitro, liknande eller motsvarande andra BCM formuleringar av DOX presenteras i litteraturen, och på så sätt uppmuntra ytterligare utvärdering in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HAMF12 | Gibco, Life Technologies | 12500 | Supplemented with 10% FBS. Warm in 37 °C water bath. |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Sigma-Aldrich | T4049 | Warm in 37 °C water bath |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F1051 | Canada origin |
| MDA-MB-468 cell line | ATCC | HTB-132 | |
| MTS tetrazolium reagent | PROMEGA | G111B | |
| Phenazine ethosulfate (PES) | Sigma-Aldrich | P4544 | >95% |
| mPEG5K (Mn 5,400 g/mol) | Sigma-Aldrich | 81323 | PDI=1.02 |
| Dimethylsolfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5% |
| Naphthalene | Sigma-Aldrich | 147141 | >99% |
| Phenyl glycidyl ether | Sigma-Aldrich | A32608 | >85% |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich | 427551 | >99% |
| Potassium | Sigma-Aldrich | 451096 | >98% |
| Tetrahydrofuran | Caledon Laboratory Chemicals | 8900 1 | ACS |
| Hexane | Caledon Laboratory Chemicals | 5500 1 | ACS |
| Calcium hydride (CaH2) | ACP | C-0460 | >99.5% |
| Diethyl Ether | Caledon Laboratory Chemicals | 1/10/4800 | ACS |
| Microplate reader | BioTek Instruments | ||
| Differential scanning calorimetry (DSC) | TA Instruments Inc | DSC Q100 | |
| Gel permeation chromatography (GPC) | Waters | 2695 separation moldule / 2414 detector | 2 Columns: Agilent Plgel 5 µm Mixed-D |
| NMR spectroscopy | Varian Mercury 400MHz | ||
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151858 | 99.96% |
| DMSO-d | Sigma-Aldrich | 156914 | 99.96% |
| Vaccum pump | Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc. | Ultimate pressure 1x10-4 torr | |
| Drierit with indicator, 8 mesh | Sigma-Aldrich | 238988 | Regenerated at 230 °C for 2 hr |
References
- Dickerson, T. J., Reed, N. N., Janda, K. D. Soluble Polymers as Scaffolds for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, 3325-3344 (2002).
- van Heerbeek, R., Kamer, P. C. J., van Leeuwen, P. W. N. M., Reek, J. N. H. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102 (10), 3717-3756 (2002).
- Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D., Schubert, U. S. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition. 49 (36), 6288-6308 (2010).
- Eetezadi, S., Ekdawi, S. N., Allen, C. The challenges facing block copolymer micelles for cancer therapy: In vivo barriers and clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 91, 7-22 (2015).
- Attwood, D., Booth, C., Yeates, S. G., Chaibundit, C., Ricardo, N. Block copolymers for drug solubilisation: Relative hydrophobicities of polyether and polyester micelle-core-forming blocks. International Journal of Pharmaceutics. 345 (1-2), 35-41 (2007).
- Matsumura, Y., Kataoka, K. Preclinical and clinical studies of anticancer agent-incorporating polymer micelles. Cancer Science. 100 (4), 572-579 (2009).
- Chan, A. S., Chen, C. H., Huang, C. M., Hsieh, M. F. Regulation of particle morphology of pH-dependent poly(epsilon-caprolactone)-poly(gamma-glutamic acid) micellar nanoparticles to combat breast cancer cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 10 (10), 6283-6297 (2010).
- Diao, Y. Y., et al. Doxorubicin-loaded PEG-PCL copolymer micelles enhance cytotoxicity and intracellular accumulation of doxorubicin in adriamycin-resistant tumor cells. International Journal of Nanomedicine. 6, 1955-1962 (2011).
- Mikhail, A. S., Allen, C. Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) Micelles Containing Chemically Conjugated and Physically Entrapped Docetaxel: Synthesis, Characterization, and the Influence of the Drug on Micelle Morphology. Biomacromolecules. 11 (5), 1273-1280 (2010).
- Kataoka, K., Harada, A., Nagasaki, Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (1), 113-131 (2001).
- Nakanishi, T., et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release. 74 (1-3), 295-302 (2001).
- Liu, J., Xiao, Y., Allen, C. Polymer-drug compatibility: A guide to the development of delivery systems for the anticancer agent, ellipticine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (1), 132-143 (2004).
- Flory, P. J. Molecular Size Distribution in Ethylene Oxide Polymers. Journal of the American Chemical Society. 62 (6), 1561-1565 (1940).
- Kazanskii, K. S., Solovyanov, A. A., Entelis, S. G. Polymerization of ethylene oxide by alkali metal-naphthalene complexes in tetrahydrofuran. European Polymer Journal. 7 (10), 1421-1433 (1971).
- Crothers, M., et al. Micellization and Gelation of Diblock Copolymers of Ethylene Oxide and Styrene Oxide in Aqueous Solution. Langmuir. 18 (22), 8685-8691 (2002).
- Taboada, P., et al. Block Copolymers of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether: Micellization, Gelation, and Drug Solubilization. Langmuir. 21 (12), 5263-5271 (2005).
- Taboada, P., et al. Micellization and Drug Solubilization in Aqueous Solutions of a Diblock Copolymer of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether. Langmuir. 22 (18), 7465-7470 (2006).
- Attwood, D., Booth, C. Colloid Stability. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 61-78 (2010).
- Le Devedec, F., et al. Postalkylation of a Common mPEG-b-PAGE Precursor to Produce Tunable Morphologies of Spheres, Filomicelles, Disks, and Polymersomes. ACS Macro Letters. 5 (1), 128-133 (2016).
- Chtryt, V., Ulbrich, K. Conjugate of Doxorubicin with a Thermosensitive Polymer Drug Carrier. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 16 (6), 427-440 (2001).
- Kataoka, K., et al. Doxorubicin-loaded poly(ethylene glycol)-poly(β-benzyl-l-aspartate) copolymer micelles: their pharmaceutical characteristics and biological significance. Journal of Controlled Release. 64 (1-3), 143-153 (2000).
- Cammas, S., Matsumoto, T., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. Design of functional polymeric micelles as site-specific drug vehicles based on poly (α-hydroxy ethylene oxide-co-β-benzyl l-aspartate) block copolymers. Materials Science and Engineering: C. 4 (4), 241-247 (1997).
- Lv, S., et al. Doxorubicin-loaded amphiphilic polypeptide-based nanoparticles as an efficient drug delivery system for cancer therapy. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9330-9342 (2013).
- Kim, J. O., Oberoi, H. S., Desale, S., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Polypeptide nanogels with hydrophobic moieties in the cross-linked ionic cores: synthesis, characterization and implications for anticancer drug delivery. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 981-993 (2013).
- Zhao, C. L., Winnik, M. A., Riess, G., Croucher, M. D. Fluorescence probe techniques used to study micelle formation in water-soluble block copolymers. Langmuir. 6 (2), 514-516 (1990).
- Wilhelm, M., et al. Poly(styrene-ethylene oxide) block copolymer micelle formation in water: a fluorescence probe study. Macromolecules. 24 (5), 1033-1040 (1991).
- Cammas, S., Kataoka, K. Functional poly[(ethylene oxide)-co-(β-benzyl-L-aspartate)] polymeric micelles: block copolymer synthesis and micelles formation. Macromolecular Chemistry and Physics. 196 (6), 1899-1905 (1995).
- Kwon, G., et al. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(.beta.-benzyl L-aspartate). Langmuir. 9 (4), 945-949 (1993).
- Ahmed, F., Discher, D. E. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. Journal of Controlled Release. 96 (1), 37-53 (2004).
- Uhrig, D., Mays, J. W. Experimental techniques in high-vacuum anionic polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 43 (24), 6179-6222 (2005).
- Parker, A. J. The effects of solvation on the properties of anions in dipolar aprotic solvents. Quarterly Reviews, Chemical Society. 16 (2), 163-187 (1962).
- Cram, D. J. Fundamentals o] Carbanion Chemistry. , (1965).
- Szwarc, M. ACS Symposium Series. 166, American chemistry society. 1-15 (1981).
- Cho, Y. W., Lee, J., Lee, S. C., Huh, K. M., Park, K. Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release. 97, 249-257 (2004).
- Dewhurst, P. F., Lovell, M. R., Jones, J. L., Richards, R. W., Webster, J. R. P. Organization of Dispersions of a Linear Diblock Copolymer of Polystyrene and Poly(ethylene oxide) at the Air−Water Interface. Macromolecules. 31 (22), 7851-7864 (1998).
- Opanasopit, P., et al. Block Copolymer Design for Camptothecin Incorporation into Polymeric Micelles for Passive Tumor Targeting. Pharmaceutical Research. 21 (11), 2001-2008 (2004).
- Allen, G., Booth, C., Price, C. VI-The physical properties of poly(epoxides). Polymer. 8, 414-418 (1967).
- Jada, A., Hurtrez, G., Siffert, B., Riess, G. Structure of polystyrene-block-poly(ethylene oxide) diblock copolymer micelles in water. Macromolecular Chemistry and Physics. 197 (11), 3697-3710 (1996).
- Attwood, D., Florence, A. T. Surfactant systems : their chemistry, pharmacy, and biology. , Chapman and Hall. (1983).
- Rekatas, C. J., et al. The effect of hydrophobe chemical structure and chain length on the solubilization of griseofulvin in aqueous micellar solutions of block copoly(oxyalkylene)s. Physical Chemistry Chemical Physics. 3 (21), 4769-4773 (2001).
- Encyclopædia Britannica Online. , http://www.britannica.com/EBchecked/topic/479680/protein/72559/Proteins-of-the-blood-serum (2015).
