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Chemistry

ब्लॉक Copolymer micelles π-π Stacking सहभागिता द्वारा स्थिर की तैयारी के लिए एक Amphiphilic Copolymer की anionic polymerization

Published: October 10, 2016 doi: 10.3791/54422
Automatic Translation
1, 1, 1
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto

Summary

Methoxy-पॉलीथीन ग्लाइकोल (एमपीईजी ख -PPheGE) पर फिनाइल glycidyl ईथर (PheGE) की anionic polymerization रहने का महत्वपूर्ण कदम बताया गया है। जिसके परिणामस्वरूप ब्लॉक copolymer micelles (BCMs) के तहत physiologically प्रासंगिक शर्तों प्राप्त किया गया था 4 दिनों में साथ डॉक्सोरूबिसिन 14% (wt%) और दवा की निरंतर जारी भरी हुई थी।

Abstract

इस अध्ययन में, एक amphiphilic copolymer कि फिनाइल समूहों के साथ एक कोर के गठन ब्लॉक शामिल methoxy-पॉलीथीन ग्लाइकोल (एमपीईजी ख -PPheGE) पर फिनाइल glycidyl ईथर (PheGE) की anionic polymerization रहने से संश्लेषित किया गया था। Copolymer की विशेषता एक संकीर्ण आणविक वितरण (PDI <1.03) से पता चला है और एमपीईजी 122 के polymerization की डिग्री की पुष्टि की - बी - (PheGE) 15। copolymer की महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता एकत्रीकरण व्यवहार गतिशील प्रकाश बिखरने और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन के साथ एक की स्थापना की प्रतिदीप्ति विधि का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। दवा वितरण अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए copolymer की क्षमता में इन विट्रो biocompatibility, लदान और हाइड्रोफोबिक कैंसर रोधी दवा डॉक्सोरूबिसिन (DOX) की रिहाई सहित एक प्रारंभिक ढंग से मूल्यांकन किया गया था। DOX का एक स्थिर मिसेल सूत्रीकरण 14% (wt%), दवा लोड हो रहा है effici के लिए दवा लोडिंग का स्तर ऊपर के साथ तैयार किया गया थाencies> 60% (डब्ल्यू डब्ल्यू /) physiologically प्रासंगिक शर्तों (अम्लीय और तटस्थ पीएच, एल्बुमिन की मौजूदगी) के तहत 4 दिनों में दवा की और निरंतर जारी। उच्च दवा लोडिंग के स्तर पर और निरंतर जारी DOX और micelles की कोर के गठन ब्लॉक के बीच π-π बातचीत को स्थिर करने के लिए जिम्मेदार ठहराया है।

Introduction

जलीय मीडिया में, amphiphilic copolymers ब्लॉक नैनो आकार के ब्लॉक copolymer micelles (BCMs) है कि एक हाइड्रोफिलिक खोल या प्रभामंडल से घिरा हुआ एक हाइड्रोफोबिक कोर से मिलकर फार्म के लिए इकट्ठा। मिसेल कोर हाइड्रोफोबिक दवाओं के समावेश के लिए एक जलाशय के रूप में काम कर सकते हैं; जबकि, हाइड्रोफिलिक कोरोना कोर और बाहरी मध्यम बीच एक इंटरफेस प्रदान करता है। पाली (ethylene glycol) (खूंटी) और उसके डेरिवेटिव पॉलिमर का सबसे महत्वपूर्ण वर्गों में से एक है और सबसे व्यापक रूप से दवा तैयार करने में इस्तेमाल में से एक हैं। 1-3 BCMs कई योगों इस पर निर्भर के साथ एक योग्य दवा वितरण मंच साबित किया है प्रौद्योगिकी अब अंतिम चरण नैदानिक विकास में। 4 सबसे अधिक, copolymer के हाइड्रोफोबिक ब्लॉक पॉलिकैप्रोलैक्टोन, पाली (डी, एल lactide), पाली (प्रोपलीन आक्साइड) या पाली (β-लोबान एल aspartate) के शामिल है। 5 -9

Kataoka के समूह जनता ख से गठित गोलाकार मिसेल्स जांच बी - (DOX) 10,11 डॉक्सोरूबिसिन की डिलीवरी के लिए अपनी रिपोर्ट में (polyaspartic एसिड संयुग्मित डॉक्सोरूबिसिन), वे कहते हैं कि बहुलक संयुग्मित दवा या PBLA के बीच π-π बातचीत आगे रखा और नि: शुल्क दवा DOX लोड हो रहा है और बनाए रखने में बढ़ जाती है, जिसके परिणामस्वरूप मिसेल कोर स्थिर करने के लिए काम करते हैं। यह एक दवा और कोर के गठन ब्लॉक के बीच अनुकूलता या बातचीत स्थापित कर रहे हैं मुख्य निष्पादन संबंधी मापदंडों के निर्धारकों। 12 DOX के अलावा, कैंसर चिकित्सा विज्ञान के एक नंबर उनके मूल संरचना (जैसे, methotrexate, olaparib, एसएन भीतर खुशबूदार छल्ले शामिल -38)।

एक परिणाम के रूप में वहाँ copolymers कि उनकी कोर के गठन ब्लॉक में लोबान के छल्ले में शामिल के संश्लेषण में महत्वपूर्ण हित है। खूंटी और उसके डेरिवेटिव की anionic अंगूठी खोलने polymerization आणविक वजन पर नियंत्रण को सक्षम और अच्छी उपज में कम polydispersity की सामग्री में परिणाम। 13,14 Ethyleफिनाइल glycidyl ईथर (PheGE) या styrene ऑक्साइड के साथ ne ऑक्साइड (एसओ) (सीओ) हो सकता है कि copolymers ब्लॉक हाइड्रोफोबिक दवाओं के solubilization के लिए micelles फार्म के लिए फार्म polymerized। 15-18 वर्तमान रिपोर्ट फिनाइल की anionic polymerization जीने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन macroinitiator के रूप में एमपीईजी-ओह ईथर मोनोमर glycidyl (चित्रा 1)। जिसके परिणामस्वरूप ब्लॉक copolymer और उसके समुच्चय तो प्रासंगिकता दवा वितरण में उपयोग करने के गुणों के संदर्भ में विशेषता है।

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Protocol

आकृति 1
चित्रा 1. योजनाबद्ध एमपीईजी ख -PPheGE copolymer की तैयारी में नौ महत्वपूर्ण कदम को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. सूखे की स्थिति के तहत अभिकर्मकों की तैयारी

  1. अभिकर्मकों की तैयारी।
    1. एमपीईजी-5K (एम एन = 5400 जी / मोल, PDI 1.03) और जगह की 15 ग्राम 48 घंटा पहले का उपयोग करने के लिए वैक्यूम के तहत एक ओवन में 50 डिग्री सेल्सियस पर वजन।
    2. सूखी 200 30 मिनट के लिए वैक्यूम के अंतर्गत dimethylsulfoxide (DMSO) कैल्शियम हाइड्राइड अधिक (CAH 2) (~ 1 ग्राम), जगह की मिलीलीटर, आर्गन के तहत शुद्ध और 48 घंटा पहले का उपयोग करने के लिए हलचल।
    3. एक सूखी और साफ कुप्पी (100 मिलीलीटर) में PheGE मोनोमर की 50 मिलीलीटर की जगह 1 ग्राम CAH 2 की आर्गन के तहत बर्फ पर 15 मिनट के लिए वैक्यूम के अंतर्गत जोड़ने, सील, शुद्ध करनाऔर आर्गन के तहत 24 घंटा पहले का उपयोग करने के लिए हलचल करने के लिए छोड़ दें।

2. पोटेशियम नेफ़थलीन की तैयारी

  1. ध्यान से, सोडियम (~ 1.5 ग्राम) हेक्सेन के साथ सूखे की छोटी मात्रा में कटौती अतिरिक्त खनिज तेल को हटाने और दौर कुप्पी tetrahydrofuran (THF) (v = 500 मिलीलीटर) युक्त में जोड़ने के लिए।
    नोट: सोडियम की मात्रा आग के जोखिम के कारण लंबे समय के लिए हवा के संपर्क में नहीं किया जाना चाहिए।
  2. benzophenone (~ 5 ग्राम), शुद्ध आर्गन के साथ जोड़ें और कांच stoppers के साथ दौर कुप्पी (2 गर्दन) सील।
  3. 24 घंटे के लिए आर्गन के तहत सरगर्मी के बाद, एक आसवन उपकरण (चित्रा 2) के दौर नीचे कुप्पी कनेक्ट आर्गन के नीचे काले समाधान गढ़ने जबकि refluxing (यानी, भाटा के बारे में 2 घंटा अवधि के लिए के बाद समाधान नीला पड़ जाता है)। वांछित मात्रा ~ THF की 150 मिलीलीटर बाईं वाल्व (आसवन तंत्र के बीच में पाया जाता है) बंद करके इकट्ठा करने के लिए शुरू करते हैं।
    नोट: इस समाधान नीले रंग की बारी नहीं है, चुलाना रोकआबादी, कमरे के तापमान (आरटी) में शांत और अधिक benzophenone या सोडियम जोड़ सकते हैं और आसवन को पुनः आरंभ। यह एक संकेत है कि THF अभी भी पानी होता है।
  4. एक सूखी Erlenmeyer में, आसुत THF (v = 100 मिलीलीटर) जोड़ने और नेफ़थलीन की 3.9 ग्राम भंग।
    नोट: आसवन बंद करो, आरटी पर शांत और THF की मात्रा हस्तांतरण का अधिकार वाल्व खुला।
  5. बिंदु 2.1 में वर्णित है, पोटेशियम (1.1 ग्राम) की छोटी मात्रा में कटौती और समाधान नेफ़थलीन (अंतिम एकाग्रता ~ 0.3 मोल / एल) युक्त करने के लिए जोड़ें। एक निस्तब्धता एडाप्टर (टी) (/ बंद) शीर्ष पर एक पट साथ साथ Erlenmeyer को सील करने और आर्गन के साथ शुद्ध करना।
  6. 24 घंटे के लिए आर्गन के तहत सरगर्मी के बाद, एक सजातीय गहरे हरे रंग के रूप में पोटेशियम नेफ़थलीन आधार के परिणामस्वरूप समाधान निरीक्षण करते हैं।
  7. अक्रिय शर्तों के तहत, एक सिरिंज के साथ कुप्पी से बुनियादी समाधान का एक 5 मिलीलीटर विभाज्य निकालें और आसुत जल के 10 मिलीलीटर में जोड़ें। इसके बाद इस समाधान के लिए phenolphthalein सूचक की 1-2 बूँदें जोड़ने के लिए,जो समाधान के लिए एक फूहड़ रंग बदल जाता है।
  8. एक मानक हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान (0.1 एन) जब तक समाधान बेरंग हो जाता है साथ पोटेशियम नेफ़थलीन समाधान titrate करने के लिए एक burette का प्रयोग करें।

3. सामग्री और प्रभावी रहने का anionic polymerization के लिए आवश्यक सावधानियों

  1. प्रणाली आर्गन / वैक्यूम कई गुना।
    नोट: चित्रा 2 में वर्णित है, खोखले कांच stopcocks के साथ एक डबल ग्लास कई गुना कांच के बने पदार्थ में आर्गन वितरण और वैक्यूम की स्थिति के बीच स्विच करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    1. एक सूखी शोषक के स्तंभ के लिए और निष्क्रिय रबर टयूबिंग का उपयोग कर कई गुना लाइन के लिए आर्गन (दबाव नापने का यंत्र के साथ) की टंकी से कनेक्ट। आर्गन लाइन के दूसरे छोर पर, कनेक्ट एक bubbler (खनिज तेल युक्त)।
    2. कांच stopcocks करने के लिए, लचीला अक्रिय ट्यूब और सुइयों से कनेक्ट। कई गुना की दूसरी लाइन करने के लिए, एक उच्च वैक्यूम पंप करने के लिए एक गिलास जाल एक ठंडा देवर कुप्पी (बर्फ / पानी या तरल नाइट्रोजन से भरा) में डूबे कनेक्ट।
    3. मोनोमर और DMSO के आसवन के लिए उपकरण।
      नोट: एक सुविधाजनक (यानी, सभी एक में) उच्च निर्वात आसवन के लिए तंत्र (चित्रा 2) कार्यरत है। सूखे कांच के बने पदार्थ उच्च वैक्यूम वाल्व के साथ बनाया है, और एक आंतरिक प्रशीतित सिर के साथ निर्मित में condensers है।
      1. शीतलन इकाई (पत्र) के प्रवेश (ए) और आउटलेट (बी) के माध्यम से पानी के प्रवाह से कनेक्ट। आर्गन / वैक्यूम के लिए दोहरी कई गुना करने के लिए अन्य इनलेट / आउटलेट (सी) कनेक्ट करें। जोड़ें और वितरण / निकालना बंदरगाह पर एक पट (धातु के तारों) सील और (डी) हवा संवेदनशील तरल पदार्थ के हस्तांतरण (ऊपर / पाश पर) के लिए एक स्टेनलेस स्टील प्रवेशनी कनेक्ट।
      2. polymerization करने से पहले, 100 डिग्री सेल्सियस पर अर्धगोल हीटिंग आवरण पर PheGE और DMSO गढ़ने और 70 डिग्री सेल्सियस, क्रमशः, सरगर्मी के साथ वैक्यूम के तहत 2 घंटे के लिए। PheGE मोनोमर का क्वथनांक 254 डिग्री सेल्सियस है, जबकि DMSO के लिए उबलते बिंदु (1 एटीएम) में 189 डिग्री सेल्सियस है।
    4. ऋणात्मक polymerizat के लिए कांच के बने पदार्थआयन।
      1. आसवन प्रणाली के अलावा, नीचे बोतल (निर्माता द्वारा प्रमाणित) दौर सहित केवल उच्च वैक्यूम प्रतिरोधी कांच के बने पदार्थ का उपयोग स्नातक की उपाधि प्राप्त cannulas, सेप्टा और धातु के तारों सेप्टा सील करने के लिए (विलायक, आधार और monomers के संस्करणों के हस्तांतरण के लिए) सिलेंडरों।
        नोट: (वैक्यूम) के तहत ध्यान से polymerization, गर्मी रहने वाले और आर्गन प्रवाह का उपयोग करने से पहले के तहत सभी कांच के बने पदार्थ नीचे शांत करने के लिए। कांच के बने पदार्थ से 10 सेमी की दूरी पर गर्मी बंदूक रखें ~।

    चित्र 2
    चित्रा 2. विधानसभा और चाबी आसवन / स्थानांतरण कदम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    4. लिविंग anionic polymerization की महत्वपूर्ण कदम का विवरण: आसवन और स्थानांतरण

    1. एक सूखी च में एमपीईजी 5K (2 mmol, 10 ग्राम) वजनLask / Schlenk (ओवन) एक हलचल बार युक्त और निस्तब्धता एडाप्टर (टी) मुहर (/ बंद) शीर्ष पर एक पट के साथ।
    2. कई गुना करने के कुप्पी कनेक्ट और आर्गन पर लालिमा के साथ 2-3 मिनट के लिए कुप्पी शुद्ध करना। निर्वात की स्थिति के लिए वाल्व बारी कुप्पी शुद्ध करने के लिए।
    3. कुप्पी मैन्युअल बारी बारी से और एक झटका ड्रायर (गर्मी बंदूक) तक एमपीईजी-5K पिघला देता है साथ ही ढंग प्रतिक्रिया पोत सूखी।
      नोट: कुप्पी से 10 सेमी की दूरी पर गर्मी बंदूक रखें ~।
    4. 1 मिनट के बाद, कई त्वरित तस्वीरें के साथ आर्गन स्थिति की ओर कई गुना पर वाल्व मोड़ से निर्वात को तोड़ने।
      ध्यान दें: एक सतत प्रवाह आर्गन bubbler में मनाया जाना है। जब प्रवाह निरंतर है, वाल्व आर्गन स्थिति पर रहता है। दोहराएँ हीटिंग और ठंडा कदम दो बार नमी के सभी निशान हटाने के लिए।
    5. पहले प्रतिक्रिया शुरू होता है ~ 2 घंटे के लिए और आर्गन के तहत वैक्यूम के अंतर्गत बहुलक macroinitiator रखें।
    6. माउंट हूड के तहत दो उच्च निर्वात आसवन apparatuses (छविUre 2); DMSO के आसवन के लिए एक और मोनोमर (PheGE) के आसवन के लिए एक।
    7. दो apparatuses को DMSO और मोनोमर युक्त अलग बोतल कनेक्ट और एक अर्धगोल हीटिंग विरासत पर प्रत्येक स्थापित (या एक तेल स्नान में)। (/ बाहर में) और कई गुना (आर्गन / वैक्यूम) के लिए तंत्र के शीर्ष करने के लिए ठंडे पानी से कनेक्ट।
    8. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक तंत्र सुरक्षित और अच्छी तरह से बंद है। वाल्व के माध्यम से वैक्यूम संलग्न हैं।
      नोट:। 3.3 कदम में वर्णित है, नमी के सभी निशान को दूर करने के लिए दो बार हीटिंग और ठंडा चरणों को दोहराएँ।
    9. एक तापमान नियंत्रक के माध्यम से हीटिंग सेट और समाधान सरगर्मी शुरू करते हैं। (तंत्र के अंदर धोने के लिए) DMSO के संचलन / आसवन के 2 घंटे के बाद, उच्च वैक्यूम वाल्व (आसवन तंत्र के बीच में पाया जाता है) समाधान के लगभग 20 मिलीलीटर इकट्ठा करने के लिए बंद कर दें। फिर, फ्लास्क में अंश जारी है और एक बार फिर ऑपरेशन दोहराएँ वांछित अंश की पवित्रता है कि सी सुनिश्चित करने के लिएबाद में ollected।
    10. बहुलक तक गर्मी बंदूक के साथ एमपीईजी-5K (वैक्यूम के अंतर्गत) युक्त कुप्पी गर्मी (एमपीईजी -5 K) पिघला देता है। आर्गन के साथ फिर से पर्ज।
      ध्यान दें: प्रक्रिया DMSO के हस्तांतरण के बाद विघटन करने में मदद मिलेगी।
    11. 2 घंटे के बाद, उच्च वैक्यूम वाल्व को बंद करने और विलायक की मात्रा (वी DMSO = ~ 100 मिलीलीटर) इकट्ठा। हीटिंग बंद करो और कई गुना वैक्यूम तोड़ने। जैसा कि ऊपर वर्णित कक्ष में (तस्वीरें) के द्वारा आर्गन रिलीज।
    12. आर्गन का एक सकारात्मक दबाव के तहत, प्रवेशनी के एक तरफ (पकड़ तंत्र के पानी निकलने की टोंटी पर) एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर के लिए सीधे एमपीईजी-5K (स्नातक स्तर की पढ़ाई यदि आसवन उपकरण है) और युक्त कुप्पी के लिए, कनेक्ट या दूसरे छोर विसर्जित ध्यान से हौसले आसुत अंश में।
    13. आर्गन दबाव का प्रयोग, प्रतिक्रिया कुप्पी में प्रवेशनी के माध्यम से DMSO ड्राइव। (यदि माप के लिए की जरूरत है या सिलेंडर) कुप्पी के लिए एक अतिरिक्त bubbler कनेक्ट और, करीब गिलास वें से जुड़ा पानी निकलने की टोंटीकई गुना के विपरीत दिशा में ई bubbler।
      नोट: जब एक प्रवेशनी के एक तरफ हस्तांतरण के लिए निकाल दिया जाता है, यकीन है कि सकारात्मक आर्गन दबाव लागू है।
    14. आर्गन दबाव की वजह से किसी भी दुर्घटना से बचने के लिए, 1-2 सेकंड के लिए गिलास पानी निकलने की टोंटी खोलने के लिए और पूर्ण हस्तांतरण पूरा हो गया है जब तक DMSO के प्रवाह (0.5 प्रति मिनट एक बार दोहराया) जारी रखने के लिए reclose करने के लिए। जब समाप्त पानी निकलने की टोंटी फिर से खोलना।
      ध्यान दें: एक ही प्रक्रिया अब आसवन और मोनोमर की वसूली के लिए पीछा किया जाना चाहिए। विलायक और मोनोमर एक ही समय में एकत्र नहीं किया जा सकता।
    15. स्थानांतरण डाला प्रवेशनी के साथ एक पट (लूप) द्वारा सील एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर में केन्युलेशन के माध्यम से 0.3 एम नेफ़थलीन पोटेशियम के 5 मिलीलीटर।
      नोट: एक ही एहतियात नोट 4.13 में वर्णित है। सकारात्मक आर्गन दबाव हवा / पानी के संक्रमण से बचने के लिए प्रतिक्रिया फ्लास्क सिलेंडर से पहले सिलेंडर के लिए नेफ़थलीन पोटेशियम कुप्पी से और फिर बनाए रखा जाना चाहिए।
    16. manifo से दूसरे सुई डालेंसिलेंडर (आर्गन) में एलडी। प्रवेशनी ध्यान से आसवन प्रणाली से जुड़े निकालें और प्रतिक्रिया कुप्पी में तेजी से डालें।
      नोट: आधार और मोनोमर के हस्तांतरण के लिए इस तकनीक का प्रयोग करें।
    17. ड्रॉप द्वारा आधार बूंद जोड़ें जब तक समाधान अंधेरा हो जाता है। जब तक काले रंग फिर से प्रकट होता रंग की धीमी गति से लापता होने के बाद, एक और हिस्से को जोड़ने के लिए, और पूर्ण हस्तांतरण जब तक दोहराएँ।
    18. मोनोमर की वांछित मात्रा (वी PheGE = 5 मिलीलीटर) स्थानांतरण n PPheGE ~ के polymerization = 18-20 की एक डिग्री तक पहुंचने के लिए।
    19. आर्गन लगातार सरगर्मी के साथ वातावरण के तहत 80 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए छोड़ दें प्रतिक्रिया पूरा polymerization सुनिश्चित करने के लिए।
    20. मेथनॉल में एचसीएल 1 एन की बूँदें (लिटमस पेपर (तटस्थ पीएच) का उपयोग मापा जाता है) और एक रंग लापता होने से मनाया के अलावा द्वारा प्रतिक्रिया बुझाने।
    21. हेक्सेन (3 × 50 एमएल) के साथ DMSO के समाधान से नेफ़थलीन निकालें। 70 मिलीलीटर (एक ही उपकरण) आसवन द्वारा DMSO हटाये वैक्यूम के अंतर्गत ~। कूजनाघोल समाधान नीचे एल और THF की 50 मिलीलीटर जोड़ें।
    22. 10 मिनट के लिए 5000 XG पर centrifugation द्वारा घोल समाधान से नमक निकालने। सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण, और ड्रॉप ठंड Diethyl ईथर के 500 मिलीलीटर के लिए बुद्धिमान जोड़ें।
    23. 24-48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस (85% उपज) में वैक्यूम के अंतर्गत निस्पंदन या centrifugation (दो बार दोहराएँ) और सूखे से वेग लीजिए।
      ध्यान दें: copolymer अब लक्षण वर्णन के लिए तैयार है।

    5. Copolymers की विशेषता

    1. एक एल्यूमीनियम नमूना पैन में copolymer (रिकॉर्ड वास्तविक मास) के 5-10 मिलीग्राम वजन और एल्यूमीनियम ढक्कन के साथ भली भांति बंद करके सील। लोड नमूना पैन और अंतर स्कैनिंग कैलोरीमीटर में संदर्भ पैन (खाली)।
    2. कार्यक्रम की एक विधि ( "गर्मी / शांत / गर्मी") चक्र: 1) 100 डिग्री सेल्सियस से 40 डिग्री सेल्सियस से 10 डिग्री सेल्सियस गर्मी / मिनट पर, 2) 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट में -70 डिग्री सेल्सियस तक शांत, 3) गर्मी 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट से कम 100 डिग्री सेल्सियस के लिए। 2 दोहराएँ) और 3) दो बार। गलनांक (टी एम), क्रिस्टल का निर्धारण करते हैंallization (टी सी) और कांच संक्रमण तापमान (टी जी), और के विलय (ΔH च) गर्मी तीसरे चक्र से थर्मल निशान से (यदि लागू हो)।
    3. THF में पॉलिमर (2 मिलीग्राम / एमएल) को भंग करने और एक 0.2 माइक्रोन PTFE फिल्टर के माध्यम से फिल्टर। एक जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी प्रणाली (50 μl) में नमूना इंजेक्षन और नमूने के लिए अवधारण समय का उपयोग करें और एक अंशांकन वक्र बहुलक की आणविक वजन का निर्धारण करने के लिए polystyrene मानकों की एक श्रृंखला का उपयोग कर उत्पादन किया। 19
    4. (सीओ) 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए डी 6 DMSO में पॉलिमर (15 मिलीग्राम / एमएल) भंग। 19
    5. Copolymer एक प्रतिदीप्ति जांच के रूप में 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH) का उपयोग कर के महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) निर्धारित करते हैं। 9
      1. अंधेरे में THF में एक DPH शेयर समाधान (2.32 मिलीग्राम / एल) तैयार करें और शीशियों की एक श्रृंखला से प्रत्येक के लिए इस शेयर समाधान के 100 μl जोड़ें।
      2. prepaTHF में एक copolymer शेयर समाधान पुन और (प्रत्येक DPH शेयर समाधान के एक विभाज्य युक्त) अंतिम copolymer सांद्रता है कि 0.01 से 1000 माइक्रोग्राम copolymer / एमएल श्रृंखला में जिसके परिणामस्वरूप शीशियों की श्रृंखला के बराबर मात्रा (2 मिलीलीटर) की aliquots जोड़ें।
      3. बाद में, भंवर copolymer-DPH समाधान और बार सरगर्मी के साथ डबल आसुत जल का 10 मिलीलीटर dropwise जोड़ें। समाधान तो सख्ती अंधेरे में 48 घंटे के लिए नाइट्रोजन की एक धारा के तहत THF की धीमी गति से वाष्पीकरण अनुमति देने के लिए उभारा जाना चाहिए। प्रत्येक समाधान में DPH के अंतिम एकाग्रता 0.232 मिलीग्राम / एल है।
      4. उपाय 430 एनएम (λ पूर्व = 350 एनएम) पर नमूने एक दोहरे स्कैनिंग microplate spectrofluorometer और साजिश प्रतिदीप्ति का उपयोग करने का प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बनाम लॉग ऑन [बहुलक]। दो रैखिक ढलानों के बीच अवरोधन copolymer के लिए सीएमसी मूल्य प्रदान करता है।

    6. BCMs में डॉक्सोरूबिसिन लोड करने के लिए प्रक्रिया

    1. ऐस के 1 मिलीलीटर में DOX के 12 मिलीग्राम भंगtonitrile, 2 घंटे के लिए अंधेरे में triethylamine के 10 μl जोड़ें और समाधान हलचल करते हैं।
    2. THF के 1 मिलीलीटर में copolymer (45 मिलीग्राम) को भंग करने और समय की इसी अवधि के लिए हलचल। DOX समाधान के लिए copolymer समाधान जोड़ें और THF के एक अतिरिक्त मात्रा (0.5 एमएल) के साथ अवशिष्ट copolymer युक्त शीशी कुल्ला।
    3. copolymer दवा मिश्रण (2.5 मिलीलीटर) dropwise एक शीशी (20 एमएल) सरगर्मी के साथ खारा के 15 मिलीलीटर 0.9% (NaCl) युक्त करने के लिए जोड़ें।
    4. एक डायलिसिस बैग (3.5 केडीए काट) का हल स्थानांतरण और खारा के खिलाफ dialyze 0.9% (500 मिलीलीटर)।
      नोट: 6 घंटे के बाद बाहरी खारा बदलें और डायलिसिस आरटी पर अंधेरे में सरगर्मी के साथ 24 घंटे के लिए जारी रखते हैं।
    5. 15 मिनट के लिए 5000 XG पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए अपोहित स्थानांतरण।
    6. एक ultrafiltration प्रणाली (एक 10 मिलीलीटर क्षमता के साथ) के लिए सतह पर तैरनेवाला कि एक डायलिसिस झिल्ली (10 केडीए काट) शामिल स्थानांतरण। ultrafiltration प्रणाली में सरगर्मी एडाप्टर रखो, ढक्कन बंद करें और के रूप में करने के लिए खुलानाइट्रोजन की tream।
    7. 4 मिलीलीटर की एक मात्रा को बीसीएम समाधान ध्यान केंद्रित करने और नए सिरे से खारा के 6 मिलीलीटर जोड़ने और प्रक्रिया में दो बार दोहराएँ।
    8. 4 मिलीलीटर बीसीएम समाधान ध्यान लगाओ, खारा के 0.5 मिलीलीटर के साथ चैम्बर कुल्ला और समाधान करने के लिए जोड़ें। अंधेरे से पहले आगे उपयोग में आरटी पर भूरे रंग शीशियों में स्टोर।

    7. DOX-BCMs में डॉक्सोरूबिसिन लोड हो रहा है का मूल्यांकन

    1. micelles को बाधित और (900 μl एचसीएल 0.1 एन में 100 μl) एचसीएल जलीय घोल (0.1 एन) के मूल्यांकन के लिए पूर्व में कमजोर करने के लिए (400 μl में 100 μl) dimethylformamide में DOX-बीसीएम भंग।
    2. 490 एनएम पर दवा लोडिंग उपाय के एक benchtop microplate spectrophotometric प्रणाली का उपयोग कर। दवा लदान क्षमता (डीएलसी) और नशीली दवाओं के लदान क्षमता (DLE) निर्धारित करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      डीएलसी (wt%) = (दवा का वजन लोड / BCMs के कुल वजन) x 100%
      DLE (%) = (दवा का वजन लोड फ़ीड में दवा की / वजन) x 100%

    8. मूल्यांकनके DOX-BCMs से DOX की इन विट्रो रिलीज में

    1. 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, 7.4 पीएच) पीबीएस पीएच के खिलाफ में 37 डिग्री सेल्सियस पर BCMs से DOX की रिहाई की जांच 7.4 युक्त 0.1% (w / v) के बीच 80, BCMs + बीएसए (50 मिलीग्राम / एमएल) पीबीएस के खिलाफ पीएच 7.4 और पीएच 0.1 एम एसीटेट बफर = 5.5। 20,21
    2. चुने गए बफर (2.3 मिलीलीटर) में बीसीएम DOX सूत्रीकरण (700 μl) पतला डायलिसिस बैग में DOX की ≈ 0.6-0.7 मिलीग्राम की कुल राशि में परिणाम के लिए।
    3. डायलिसिस बैग में समाधान की जगह क्लिप के साथ सील करने और संबंधित विदेशी मीडिया की 200 मिलीलीटर में बैग विसर्जित कर दिया।
    4. पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर डायलिसिस बैग के बाहर समाधान के 2 मिलीलीटर निकालें और ताजा बफर के समान मात्रा के साथ बदलें।
    5. यूवी विज़ Spectrophotometry द्वारा विश्लेषण करने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर हटाया aliquots (पेट 490 एनएम) की दुकान। दवा का संचयी प्रतिशत जारी की (ई आर) निम्न समीकरण का उपयोग गणना की जा सकती है:
      "Equation1" नोट: जहां एम DOX BCMs में DOX की राशि का प्रतिनिधित्व करता है, वी 0 रिहाई मीडिया (200 मिलीलीटर) की कुल मात्रा है, वी टी की जगह मीडिया की मात्रा (वी टी = 2 मिलीलीटर) है, सीआइ एकाग्रता है सुधार के पहले, और सी एन नमूने में DOX की एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है।

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Representative Results

चित्र तीन
डॉक्सोरूबिसिन के लदान के लिए ब्लॉक copolymer micelles की तैयारी के लिए (PheGE) 15 योजनाबद्ध नेफ़थलीन पोटेशियम का उपयोग कर एमपीईजी के हाइड्रॉक्सिल समूह की deprotonation दिखाता है - चित्रा 3. एमपीईजी macroinitiator पर फिनाइल glycidyl आकाश की anionic polymerization के चित्रण एमपीईजी ख का उत्पादन। एक कट्टरपंथी-आयनों, फिनाइल glycidyl ईथर (PheGE) मोनोमर के polymerization के द्वारा पीछा के रूप में। BCMs uranyl एसीटेट (1% w / v) और micelles के रूप में गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) द्वारा निर्धारित के आकार के वितरण के साथ दाग के प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि (मंदिर)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3 चित्र में दिखाया, एमपीईजी macroinitiator पर फिनाइल glycidyl आकाश की anionic polymerization ब्लॉक copolymer micelles (तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था DOX-एमपीईजी बी - (PhGE) 15 की फंसाने के लिए डॉक्सोरूबिसिन एमपीईजी बी के लिए एक संकीर्ण आणविक वजन वितरण -। (PhGE) 15 copolymer जीपीसी (PDI = 1.03) द्वारा पुष्टि की गई और polymerization की डिग्री 1 एच एनएमआर विश्लेषण (चित्रा 4) [σ = 7.2 पीपीएम (एम द्वारा निर्धारित किया गया था , 2H मेटा, फिनाइल 2 (= CH -)), σ = 6.8 पीपीएम (घ, 3H, 2 ऑर्थो और 1 पैरा (- CH -), σ = 3.95 पीपीएम (एम, 2H, हे सीएच 2 -CH-) ] एक संदर्भ शिखर (σ = 3.22 पीपीएम (एस, 3H) के रूप में इस्तेमाल किया एमपीईजी की मिथाइल अंत समूह के साथ।

चित्रा 4
चित्रा 4. विशेषता और विश्लेषण। ए) एमपीईजी की जीपीसी विश्लेषण और THF। बी में copolymer) 1 एचMPEG5K (ऊपरी स्पेक्ट्रम) और एमपीईजी बी के एनएमआर स्पेक्ट्रा -। डी 6 -DMSO में (PheGE) 15 (कम स्पेक्ट्रम) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1 copolymer के लक्षण।

जलीय मीडिया में, इस तरह एमपीईजी ख के रूप में amphiphilic copolymers ब्लॉक - (PheGE) 15 micelles कि एक हाइड्रोफिलिक खोल से घिरा हुआ एक हाइड्रोफोबिक कोर से मिलकर फार्म के लिए इकट्ठा। copolymer की सीएमसी एक स्थापित प्रतिदीप्ति पद्धति का उपयोग करके मापा गया था। एमपीईजी बी के सीएमसी - (PheGE) 15 ~ 9 माइक्रोग्राम / एमएल (चित्रा 5 ए इनसेट) होने के लिए निर्धारित किया गया था। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी copolymer समुच्चय है और इस तरह गतिशील के लिए एक गोलाकार आकृति विज्ञान की पुष्टि कीप्रकाश बिखरने (चित्रा 3 और तालिका 2) hydrodynamic व्यास (डी एच ~ 25 एनएम) का आकलन करने के लिए नियुक्त किया गया था। जैसा कि चित्र 6-ए में दिखाया गया है, L929 माउस fibroblast कोशिकाओं एमपीईजी ख से अवगत कराया गया - (PhGE) 15 BCMs और कोई cytotoxicity 24 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद मनाया गया।

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिदीप्ति तीव्रता और सीएमसी विशेषता। (पीएचई) 15 ब्लॉक copolymer - ए) एमपीईजी ख की एकाग्रता के एक समारोह के रूप में DPH के प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्लॉट। इनसेट 0.1-10 माइक्रोग्राम / एमएल। बी) के कोर के गठन ब्लॉक पर लटकन फिनाइल समूहों के साथ copolymers की एक श्रृंखला के लिए साहित्य से प्राप्त सीएमसी मूल्यों का प्लॉट पर ब्लॉक copolymer के एकत्रीकरण के प्रारंभिक चरण से पता चलता है। लाल चौकों चूहों की गिब्स ऊर्जा के लिए गणना मूल्यों का प्रतिनिधित्वइसी copolymers की llization (± 0.5 केजे / मोल)। 22,25-28 यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

सारणी 2
तालिका 2 डायलिसिस विधि द्वारा तैयार BCMs की विशेषता।

BCMs में दवा की solubilization दवा के जलीय घुलनशीलता के साथ ही दवा और खुद को और / या micelles की कोर के गठन ब्लॉक के बीच बातचीत के लिए प्रवृत्ति से प्रभावित है। अपने नमक रूप में, DOX अपेक्षाकृत घुलनशील है (~ 10 मिलीग्राम / एमएल) पानी में। इस प्रकार BCMs में लोड करने के लिए, DOX acetonitrile में भंग कर दिया और मुक्त आधार प्राप्त करने के लिए चाय के साथ निष्प्रभावी किया गया था (3 EQ।)। 8.5 की एक pKa के साथ, DOX stabili साथ BCMs में encapsulation ड्राइविंग बुनियादी शर्तों के तहत अपेक्षाकृत अघुलनशील हो जाता हैπ-π स्टैकिंग बातचीत से zation (एमपीईजी बी - (PhGE) 15)। साहित्य में वर्णित है, में DOX-एमपीईजी ख DOX के लिए इसी तरह की लोडिंग क्षमता -। (PhGE) 15 14% की एक औसत मूल्य के साथ सूचित किया गया है (डब्ल्यू / डब्ल्यू) 21-24 ultrafiltration के बाद, यह पाया गया कि copolymer सांद्रता के रूप में कम के रूप में 10 मिलीग्राम / सफलतापूर्वक 1.6 मिलीग्राम DOX / मिलीलीटर तक solubilized मिलीलीटर। (PhGE) 15 BCMs (तालिका 2) - दवा लदान क्षमता एमपीईजी बी के लिए 52% (/ डब्ल्यू डब्ल्यू) तक गया था। रिहाई विभिन्न मीडिया में BCMs से DOX के प्रोफाइल की जांच की गई (चित्रा 6C)।

चित्रा 6
चित्रा 6 cytotoxicity और मादक पदार्थों की रिहाई कैनेटीक्स। ए) evaluaएमपीईजी बी के L929 माउस fibroblast कोशिकाओं में cytotoxicity की tion -। के रूप में एक 24 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद एमटीएस परख का उपयोग निर्धारित (PheGE) 15 copolymer micelles (एन = 3 अलग-अलग प्रयोगों, एसडी <10%) बी) सामान्यीकृत उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के मुक्त DOX और 10 माइक्रोग्राम / एमएल DOX एकाग्रता में पीबीएस, 7.4 पीएच में DOX से भरी हुई micelles। उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 480 एनएम है और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ब्लॉक एमपीईजी बी से DOX की 500-700 एनएम सी) रिलीज प्रोफाइल से एकत्र किया जाता है - पीबीएस में (PhGE) 15 copolymer micelles (वर्ग) 0.1 एम 7.4 पीएच, (हलकों)। एसीटेट ना + बफर 0.1 एम पीएच 5.5 में 0.1 एम पीबीएस पीएच 7.4 बीएसए 50 मिलीग्राम / एमएल (बैग में) युक्त और (त्रिकोण) और (त्रिकोण नीचे) पीबीएस पीएच 7.4 में मुक्त DOX (एन = 2)। (हर हालत के लिए, एन = 3 अलग-अलग प्रयोगों, एसडी <10%)। यहाँ इस figur का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करेंई।

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Discussion

अच्छा नियंत्रण है कि ऋणात्मक polymerization आणविक वजन से अधिक प्रदान करता है के कारण यह oxirane मोनोमर (खूंटी और PPG) के आधार पर पॉलिमर की तैयारी के लिए उद्योग में सबसे एप्लाइड प्रक्रियाओं में से एक है। इष्टतम और कठोर परिस्थितियों के लिए सफल polymerization प्राप्त किया जा करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। सभी अभिकर्मकों और उचित तंत्र के कठोर शुद्धि संश्लेषण के रहने वाले किरदार के लिए आवश्यक हैं। मौजूदा सेटअप की सीमाएं ज्यादातर हस्तांतरण तकनीक है कि केन्युलेशन पर निर्भर करता है के साथ जुड़े रहे हैं। उचित दबाव का प्रयोग, केन्युलेशन शैक्षिक सेटिंग के लिए एक सुरक्षित प्रयोगशाला पैमाने तकनीक है। इन सावधानियों को लागू करने polymerization की प्रक्रिया (कम PDI) के दौरान बेहतर reproducibility और नियंत्रण प्रदान करेगा। इसके अलावा, इन हस्तांतरण और शुद्धि प्रक्रियाओं, ऐसे एमपीईजी ख -PCL, एमपीईजी ख -PLLA, और एमपीईजी ख -PAGE रूप copolymers की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 19,29 हालांकि इस सुविधाजनक procedure कुछ monomers है कि और अधिक कठोर परिस्थितियों में (जैसे, styrene) की आवश्यकता के polymerization के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता। वैकल्पिक रूप से, तोड़-सील तकनीक को आम तौर पर anionic polymerization के लिए पसंद किया जाता है। 30 उद्योग में इन चरणों को नियंत्रित करने के लिए, इसी तरह की प्रणाली (स्टेनलेस / ग्लास) भली भांति बंद वाल्व के माध्यम से एक दूसरे से जुड़े हुए हैं।

oxirane monomers के लिए, सामान्य तंत्र oxirane अंगूठी पर oxyanion (मुक्त आयन या आयन जोड़ी), जो अंगूठी खोलने polymerization की ओर जाता है की एक न्युक्लेओफ़िलिक हमला है। हालांकि, प्रतिस्थापित oxirane monomers की प्रकृति पर निर्भर करता है, कुछ monomers भाजन नहीं कर सकते हैं या वे उच्च आणविक वजन करने के लिए polymerized नहीं किया जा सकता है। polymerization के इस प्रकार के मोनोमर खुद विलायक या अन्य प्रजातियों कि समाप्ति प्रतिक्रियाओं और / या माध्यम से श्रृंखला स्थानांतरण (प्रतिक्रिया के नियंत्रण के नुकसान) के लिए नेतृत्व सहित, अम्लीय या बुनियादी घटकों, बर्दाश्त नहीं करता है। एक PEGylated ब्लॉक copolymer असर फिनाइल का उत्पादन करने के लिएanionic polymerization द्वारा समूहों, फिनाइल glycidyl ईथर मोनोमर के लिए विकल्प पाया जा सकता है: styrene, styrene ऑक्साइड या एलिल glycidyl ईथर लोबान mercaptan के एक कट्टरपंथी माइकल प्रतिक्रिया के बाद विकल्प हैं। एमपीईजी एथिलीन ऑक्साइड मोनोमर के संघनन से तैयार किया जा सकता है और फिर एक ही परिस्थितियों में polymerized इस पत्र में वर्णित के रूप में, एक hydroxylated सर्जक (जैसे, मेथनॉल) का उपयोग। हालांकि, कम PDI के साथ आणविक भार बदलती के एमपीईजी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है।

पानी अवशेषों से बचने के लिए, macroinitiator (जैसे, एमपीईजी OH) में अच्छी तरह से एक ओवन में पूर्व सुखाने, गर्मी बंदूक सुखाने प्रक्रिया के बाद से सूखे की जरूरत है। प्रतिक्रियाओं ध्रुवीय aprotic सॉल्वैंट्स में किया जा सकता है, या थोक में सॉल्वैंट्स समन्वय। polymerization इस तरह के उच्च तापमान के रूप में विशिष्ट परिस्थितियों, आवश्यकता है, THF तुलना में एक मजबूत polarity के साथ सॉल्वैंट्स ऐसे DMSO, diglyme या HMPA के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल में वर्णित है (धारा 4 पर 2) की आवश्यकता है। DMSO हीड्रोस्कोपिक है और अगर आसवन अच्छी तरह से आयोजित नहीं है, पानी के निशान सक्रिय प्रजातियों को निष्क्रिय कर सकता है। अन्य सॉल्वैंट्स इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन DMSO anions के लिए फैटायनों के लिए एक उच्च solvating क्षमता, कम solvating की क्षमता है और उच्च तापमान polymerization। 31,32 DMSO के आधार के लिए एक उत्कृष्ट विलायक मजबूत इलेक्ट्रॉन वापस लेने substituents साथ epoxides और olefins के polymerization उत्प्रेरित है की अनुमति देता है। Polymerization की शुरूआत पोटेशियम नेफ़थलीन का एक पतला समाधान के साथ एमपीईजी-ओह के अनुमापन के माध्यम से पोटेशियम alkoxide initiators के सीटू पीढ़ी में द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। 33 यह महत्वपूर्ण है ध्यान से पोटेशियम नेफ़थलीन का समाधान तैयार करने के लिए और पूर्व के लिए एसिड के साथ समाधान करने के लिए titrate इसके प्रयोग। वास्तव में, यदि पोटेशियम नेफ़थलीन की एकाग्रता के तहत या overestimated है, macroinitiator समुच्चय के रूप में हो या असफल पूरी तरह से सक्रिय करने के लिए कर सकते हैंसर्जक और बदले में polymerization समझौता किया जा सकता है। जब पोटेशियम नेफ़थलीन dropwise जोड़ा जाता है, रंग की धीमी गति से लापता होने के सर्जक द्वारा आधार की खपत अधिक दृश्य नियंत्रण प्रदान करता है। इन शर्तों के तहत, हाइड्रॉक्सिल समूह (निष्क्रिय) और alkoxides (सक्रिय) के बीच तेजी से प्रोटॉन विनिमय मोनोमर की एक नियंत्रित polymerization सुनिश्चित करता है। 13

के लिए (PhGE) 15 1 से 10 माइक्रोग्राम से लेकर सूचना सीएमसी मूल्यों के साथ कई समूहों द्वारा जांच की गई है / एमएल 25,27,28,34-36 सीएमसी मूल्यों - बी -। एमपीईजी 122 के लिए इसी तरह की संरचना की copolymers ब्लॉक के एकत्रीकरण व्यवहार एक विशिष्ट copolymer विशिष्ट विधि निर्धारण के लिए कार्यरत आधार पर भिन्न हो सकते हैं। इस अध्ययन में, एक प्रतिदीप्ति आधारित पद्धति जांच के रूप में चुना DPH के साथ नियोजित किया गया था यह देखते हुए कि यह केवल एक प्रतिदीप्ति एक बार (चित्रा 5 ए इनसेट) BCMs में शामिल संकेत में यह परिणाम है। चित्रा 5 बलटकन फिनाइल समूहों के साथ विभिन्न copolymers ब्लॉक के लिए प्राप्त सीएमसी मूल्यों भी शामिल है। दिखाया गया है, copolymers की सीएमसी मूल्यों बहुलक रीढ़ की हड्डी असर फिनाइल समूहों और polymerization की डिग्री की प्रकृति पर निर्भर करता है। 25,27,28,34-36 micelles और बीच copolymer चेन के आदान प्रदान के बाहरी माध्यम पर निर्भर करता है मिसेल कोर के राज्य के रूप में अच्छी तरह के रूप में दो ब्लॉक और विलायक के बीच फ्लोरी-Huggins बातचीत पैरामीटर। कांच संक्रमण तापमान थोक PPheGE homopolymer की (टी जी) के थोक पी एस की तुलना में कम हो जाता है। 37 पीएस के polymerization के एक उच्च डिग्री के साथ पी एस, copolymers की बेजान प्रकृति के कारण (एन> 35) एक शीशे के समान कोर के अधिकारी आरटी पर (टी जी ~ 80 डिग्री सेल्सियस)। 38

Thermodynamically, दो मुख्य दृष्टिकोण आगे रखा गया है micellization प्रक्रिया, अर्थात्, चरण जुदाई मॉडल (सीएमसी में चरण जुदाई), और बड़े पैमाने पर कार्रवाई मॉडल (गधा वर्णन करने के लिएसंघ-हदबंदी संतुलन मिसेल / unimers)। 39 दोनों दृष्टिकोणों के अनुसार, मानक गिब्स ऊर्जा परिवर्तन (ΔG ◦) micellar चरण के लिए समाधान से amphiphile के 1 मोल के हस्तांतरण के लिए electrostatic बातचीत के अभाव में (ΔG micellization से मुक्त ऊर्जा ◦),। ΔG ◦ = आरटी एल.एन. (सीएमसी) 39 द्वारा दिया जाता है के रूप में दिखाया (PhGE) - चित्रा 5 ब में, सीएमसी और ΔG ◦ के लिए मूल्यों copolymers कि संरचना में समान ख एमपीईजी करने के लिए (कुल copolymer एम डब्ल्यू और हाइड्रोफिलिक ब्लॉक की लंबाई को हाइड्रोफोबिक के अनुपात के मामले में) कर रहे हैं के लिए प्राप्त मूल्यों के साथ समझौता कर रहे हैं 15. जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, एमपीईजी बी के डीएससी विश्लेषण - (PhGE) 15 copolymer थोक सामग्री 51 डिग्री सेल्सियस पर एक भी टी एम जो हाइड्रोफिलिक ब्लॉक करने के लिए जिम्मेदार ठहराया और उदास रिश्तेदार है इस बात की पुष्टिएमपीईजी लड़का (60 डिग्री सेल्सियस)। समाधान में, यह माना जाता है कि एमपीईजी ख की कोर copolymer micelles -PS, एमपीईजी में PhGE के समान लंबाई की polystyrene ब्लॉक के साथ बी - (PhGE) 15, शारीरिक तापमान (यानी, 37 डिग्री पर मोबाइल बनने के लिए शुरू सी।) 38,40 इसलिए, एमपीईजी बी - (PhGE) 15 BCMs संभावना एक अपेक्षाकृत मोबाइल कोर जो कमरे और शारीरिक तापमान पर स्थानीय आंदोलन में सक्षम बनाता है के पास है।

इस अध्ययन डायलिसिस और ultrafiltration में नि: शुल्क दवा को दूर करने के लिए और इन विवो अनुप्रयोगों में बाद के लिए दवा / copolymer की एकाग्रता बढ़ाने के लिए एक सुविधाजनक साधन के रूप में इस्तेमाल किया गया। वैकल्पिक रूप से, फ्रीज सुखाने निर्माण ध्यान केंद्रित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, हालांकि, इस स्टेबलाइजर्स के संभावित अलावा (जैसे, खूंटी, डेक्सट्रोज) पुनर्गठन के लिए wettability में सुधार करने सहित अनुकूलन की आवश्यकता है। जिसके परिणामस्वरूप DOX-एमपीईजी बी - (PhGE) 15 BCMs समान ओं से पता चलाustained रिहाई प्रोफाइल (पीबीएस 7.4) 7.4 पीएच पर Kataoka और सहकर्मियों। 21 पीबीएस में द्वारा विकसित बीसीएम प्रणालियों के लिए, कुल दवा के 10% से कम छह घंटे के भीतर जारी किया गया था, जबकि मुक्त DOX के 95% से अधिक डायलिसिस से जारी है समय की है कि इसी अवधि के भीतर बैग। तटस्थ पीएच पर निरंतर जारी चार दिन की अवधि में तैयार करने का अच्छा स्थिरता इंगित करता है।

मानव रक्त सीरम लगभग 7% प्रोटीन, एल्बुमिन है, जिनमें से दो तिहाई के शामिल है। 41 इसलिए, ताकि इन विवो शर्तों दवा रिहाई अनुकरण करने में आमतौर पर बफर इस प्रोटीन की physiologically प्रासंगिक सांद्रता वाले समाधान में मूल्यांकन किया है। वर्तमान अध्ययन में, बीएसए 50 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में डायलिसिस बैग में शामिल किया गया था। एल्बुमिन की उपस्थिति में, BCMs से DOX की रिहाई 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 4 दिनों के बाद के बारे में 30% की वृद्धि हुई। पीएच 5.5 से बफर में BCMs से DOX की रिहाई की पुष्टि की है कि protonat72 घंटे के बाद दवा रिहाई में वृद्धि में इन शर्तों के तहत परिणाम DOX के आयन और यह 4 दिनों के बाद 60% तक बढ़ जाती है। कुल मिलाकर, जिसके परिणामस्वरूप DOX-BCMs विट्रो, समान या DOX के अन्य योगों बीसीएम साहित्य में प्रस्तुत करने के लिए बराबर में आशाजनक परिणाम से पता चला है, और इस तरह विवो में अतिरिक्त मूल्यांकन प्रोत्साहित करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/HAMF12 Gibco, Life Technologies 12500 Supplemented with 10% FBS. Warm in 37 °C water bath.
Trypsin-EDTA (0.25%) Sigma-Aldrich T4049 Warm in 37 °C water bath
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051 Canada origin
MDA-MB-468 cell line ATCC HTB-132
MTS tetrazolium reagent PROMEGA G111B
Phenazine ethosulfate (PES) Sigma-Aldrich P4544 >95%
mPEG5K (Mn 5,400 g/mol) Sigma-Aldrich 81323 PDI=1.02
Dimethylsolfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540 >99.5%
Naphthalene Sigma-Aldrich 147141 >99%
Phenyl glycidyl ether Sigma-Aldrich A32608 >85%
Benzophenone Sigma-Aldrich 427551 >99%
Potassium Sigma-Aldrich 451096 >98%
Tetrahydrofuran Caledon Laboratory Chemicals 8900 1 ACS
Hexane Caledon Laboratory Chemicals 5500 1 ACS
Calcium hydride (CaH2) ACP C-0460 >99.5%
Diethyl Ether Caledon Laboratory Chemicals 1/10/4800 ACS
Microplate reader BioTek Instruments
Differential scanning calorimetry (DSC) TA Instruments Inc DSC Q100
Gel permeation chromatography (GPC) Waters 2695 separation moldule / 2414 detector  2 Columns: Agilent Plgel 5 µm Mixed-D
NMR spectroscopy Varian Mercury 400MHz
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151858 99.96%
DMSO-d Sigma-Aldrich 156914 99.96%
Vaccum pump Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc. Ultimate pressure 1x10-4 torr
Drierit with indicator, 8 mesh Sigma-Aldrich 238988 Regenerated at 230 °C for 2 hr

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References

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Le Dévédec, F., Houdaihed, L., Allen, C. Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by π-π Stacking Interactions. J. Vis. Exp. (116), e54422, doi:10.3791/54422 (2016).

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