Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

وتقليد من المكروية ورم: طريقة بسيطة لتوليد بالسكان خلية المخصب والتحقيق بين الخلايا الاتصالات

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54429
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiology, New Jersey Medical School, Rutgers University

Abstract

فهم التفاعلات غيروي مبكرة بين الخلايا السرطانية والمحيطة سدى غير سرطانية المهم في توضيح الأحداث التي أدت إلى تفعيل انسجة وإنشاء المكروية الورم (TME). عدة في التجارب المختبرية والنماذج الحية من TME تم تطويرها. ومع ذلك، في عام هذه النماذج لا تسمح بسهولة عزل السكان الخلية الفردية، في ظل ظروف غير تكدير، لمزيد من الدراسة. للتحايل على هذه الصعوبة، ونحن قد استخدمت في المختبر نموذج TME باستخدام الركيزة نمو الخلايا تتكون من نفاذية إدراج غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها تسمح الجيل بسيط من السكان الخلية التخصيب نمت بشكل وثيق، ولكن بشكل منفصل، على جانبي غشاء إدراج لتعاون موسع مرات ğ ثقافة. من خلال استخدام هذا النموذج، ونحن قادرون على توليد المخصب إلى حد كبير الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF) السكان من العادية الخلايا الليفية الإنسان مضاعفا يليشارك في ثقافة (120 ساعة) مع خلايا سرطان الثدي النقيلي الإنسان إلى حد كبير، من دون استخدام العلامات الفلورية و / أو فرز الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، عن طريق تحوير حجم المسام من إدراج، يمكننا السيطرة على الوضع من الاتصالات بين الخلايا (على سبيل المثال، الاتصالات تقاطع الفجوة، والعوامل يفرز) بين اثنين من السكان الخلية مغاير، الذي يسمح التحقيق في الآليات الكامنة وراء تطور TME، بما في ذلك دور نفاذية الفجوة تقاطع. ويقدم النموذج بوصفه أداة قيمة في تعزيز فهمنا للأحداث الأولية مما أدى إلى بدء السرطان سدى، وتطور في وقت مبكر من TME، وتأثير تحوير للسدى على استجابات الخلايا السرطانية الى العوامل العلاجية.

Introduction

المكروية الورم (TME) هو نظام معقد للغاية يتكون من خلايا سرطان أن تتعايش وتتطور جنبا إلى جنب مع سدى المضيف. يتكون هذا المكون انسجة عادة من الخلايا الليفية، myofibroblasts، والخلايا البطانية، ومختلف مكونات جهاز المناعة، وكذلك المصفوفة خارج الخلية 1. والمكونة كبير، في كثير من الأحيان أن غالبية هذه سدى، والخلايا الليفية تفعيلها، وكثيرا ما يشار إلى الخلايا الليفية المرتبطة السرطان أو الخلايا الليفية المرتبطة سرطان (CAF) 2،3. على عكس الخلايا الليفية الطبيعي، وعدم تفعيلها، تساهم مقاهي لبدء الورم، التقدم، الأوعية الدموية، والغزو، ورم خبيث، وتكرار 4-11 في مجموعة واسعة من السرطانات بما فيها سرطان الصدر والبروستاتا والرئة والبنكرياس والجلد والقولون والمريء، و المبيض 5،6،12-17. ومع ذلك، فإن الطبيعة الدقيقة للمساهمة مقاهي في جميع أنحاء المرضية السرطان لا تزال محددة بشكل واضح. وعلاوة على ذلك، وقد أثبتت الأدلة السريرية قيمة النذير من مقاهي، ربط وجودهم إلى الأورام الخبيثة عالية الجودة، وفشل العلاج، وعموما الفقراء 10،18،19 التكهن.

بوضوح، وتعزيز فهمنا للأحداث الشروع في التنمية CAF، فضلا عن الاتصالات بين الخلايا الوساطة دورها داخل TME، قد توفر أهداف علاجية جديدة مثيرة والاستراتيجيات المحسنة التي يمكن أن تحسن نتائج المرضى. وتحقيقا لهذا الهدف، وقد وضعت عدة في الجسم الحي ونماذج في المختبر. في حين النهج في الجسم الحي هي أكثر تعبيرا من TME المرضى، لديهم قيود، بما في ذلك التعقيد وعدم التجانس داخل وبين الأورام على حد سواء. وعلاوة على ذلك، وعينات من الورم من المواضيع الإنسان في كثير من الأحيان تمثل درجة عالية من التطور TME، ولا تسمح فهم TME بدء الأحداث. دراسات على حيوانات التجارب توفر بعض المزايا، لكن تعميم البيانات المأخوذة من الحيوانات إلى البشر وينبغي أن يتم بحذر وذلك بسبب الاختلافات في physiology بين البشر والحيوانات مثل القوارض (على سبيل المثال، الكيمياء ثيول 20، معدل الأيض 21، وتحمل الإجهاد 22، الخ). وعلاوة على ذلك، على عكس البشر، والتي هي غير متجانسة وراثيا في الطبيعة، وعادة ما تكون ولدت حيوانات المختبر إلى التجانس. أيضا، غالبا ما يكون من الصعب دراسة التغيرات الفسيولوجية عابرة وتغيرات الخلية النمط الظاهري، وكذلك للسيطرة على المعلمات التجريبية محددة باستخدام الحيوانات مثل القوارض. وهكذا، في المختبر 2- و 3 الأبعاد (2D و 3D) نماذج زراعة الأنسجة كثيرا ما تستخدم لتعزيز فهم أساسي للتنمية TME. وعلى الرغم من عدم وجود صورة دقيقة لتعقيد النظم في الجسم الحي، وهذه النماذج تقدم المزايا التي تسهل كثيرا التحقيقات الميكانيكية. في المختبر نماذج تسمح لتحليل أكثر بساطة، وركزت، وفعالة من حيث التكلفة TME، حيث دلالة إحصائية البيانات التي يمكن أن تتولد فيخلايا خالية من الاختلافات المنهجية التي تنشأ في الحيوانات.

وهناك عدة أنواع من النظم في المختبر. تتكون الأكثر شيوعا TME في المختبر النموذجين من أحادي الطبقة المختلطة أو مزارع الخلايا كروي. كلتا الطريقتين الثقافة هي مفيدة للدراسات الأساسية من التفاعلات بين الخلايا (على سبيل المثال، الخلايا الطبيعية مع الخلايا السرطانية) ولتحليل مختلف التغيرات خلية النمط الظاهري محددة TME (على سبيل المثال، ظهور الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان من الخلايا الليفية الطبيعية). بالإضافة إلى ذلك، الكروية هي قادرة على خلق بنية تشبه النسيج أكثر تعبيرا عن TME، ويمكن أن تكون ممثلة للورم التجانس 23. ومع ذلك الكروية غالبا ما تنتج متفاوتة على نطاق واسع التدرجات توتر الأوكسجين عبر طبقات، والتي قد تعقد النتائج التجريبية 24. للأسف، وكلا النموذجين محدودا للغاية في قدرتها على عزل السكان الخلية نقية لمزيد من التوصيف والدراسة التالية المشاركثقافة. للقيام بذلك يتطلب نوع خلية واحدة على الأقل ليكون الموسومة fluorescently أو المسمى مع صانع تحديد، ومن ثم إخضاع مختلطة ثقافة مشتركة لمعالجة واسعة وخلية الفرز لفصل السكان الخلية. في حين أن فارز الخلية قادر على عزل السكان خلية النقي بدلا من ذلك، يجب على المرء أن يكون مدركا للإجهاد الخلوي والتلوث الميكروبي محتمل يهدد 25.

لتسهيل فهم الاتصالات بين الخلايا، تم بذل جهود كبيرة من أجل تطوير وتحسين نظم المختبر التي تحاكي بشكل وثيق البيئة في الجسم الحي، في حين يسمح نهج مبسطة. واحدة من هذه الأداة هو إدراج الصغيرة التي يسهل اختراقها قابلة للاختراق، وهو الركيزة الغشاء الذي تم تطويره لأول مرة في عام 1953 26 و في وقت لاحق تكييفها لتطبيقات متنوعة والدراسات (على سبيل المثال، الخلية القطبية 27، الإلتقام 28، نقل المخدرات 29، والنمذجة الأنسجة 30، فيرilization 31، وتأثير المارة 32،33، وما إلى ذلك). يسمح هذا النظام للنمو الخلايا في الجسم الحي مع تشبه التشريحية والتمايز الوظيفي، وكذلك التعبير الكثيرين في الجسم الحي علامات 34،35 التي لم يتم مراعاتها عند تربيتها على بلستيكور بردة. وعلاوة على ذلك، فإن غشاء مسامي رقيقة للغاية (10 ميكرون سميكة) يسمح الانتشار السريع للجزيئات والأوقات موازنة، والتي تحاكي البيئة في الجسم الحي ويسمح سير الخلوية مستقل في كل المجالات خلية قمية وbasolateral. ميزة إضافية لفائدة إدراج باعتباره نظام TME هو الفصل المادي اثنين من سكان الخلية مغاير نمت على جانبي الغشاء في نفس الظروف البيئية، مع الحفاظ على مختلف وسائل الاتصال بين الخلايا من خلال المسام الغشاء. على الرغم من فصل جسديا، تقترن السكان اثنين من خلية عملية الأيض عن طريق عناصر يفرز و، كما ديمكتوب هنا، أيضا من خلال قنوات الفجوة صلي. بالإضافة إلى ذلك، من خلال الحفاظ على إدراج في الجسم الحي في توتر الأوكسجين الجزئي (ص 2)، ونموذج يقلل من المضاعفات من الأوكسجين والمواد الكيميائية التدرجات التي لوحظت في الأنظمة الأخرى. بدلا من ذلك، لأنه يزيد من فهم آليات الطبيعية السيطرة على TME. والجدير بالذكر أن السكان الخلية اثنين يمكن عزلها مع نقاء عالية، من دون وضع علامات الفلورسنت و / أو فرز الخلايا بعد فترات طويلة من الثقافة المشتركة.

نحن هنا وصف في المختبر بروتوكول TME تتكون من خلايا سرطان الثدي البشرية والخلايا الليفية الإنسان نمت، على التوالي، على جانبي نفاذية غشاء إدراج الصغيرة التي يسهل اختراقها، ولكن حتى الآن في استمرار الاتصالات ثنائية الاتجاه من خلال مسام الغشاء. وتبين لنا أن باستخدام الأغشية مع أحجام المسام المختلفة، ومساهمة من نوع معين من الاتصالات بين الخلايا (على سبيل المثال، العوامل يفرز مقابل تقاطعات الفجوة) في تطويرمن TME يمكن التحقيق فيها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافة والخلايا

  1. إعداد 500 مل من الدنيا والمتوسطة النسر الضروري أن تستكمل مع 12.5٪ (المجلد / المجلد) للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-ألانيل-L-الجلوتامين، و 100 وحدة من البنسلين و 100 ميكروغرام من الستربتومايسين لكل مل.
    ملاحظة: متوسطة النمو وملحق (ق) يمكن تبادلها بسهولة لمتطلبات نمو سلالات الخلايا الأخرى أو خطوط الخلايا.
  2. إعداد 70 ميكرولتر من مستنبت خلية لكل إدراج (6 جيدا شكل إدراج): الأساسية الدنيا والمتوسطة النسر تستكمل مع 50٪ (المجلد / المجلد) FBS، الحرارة المعطل 2 مم L-ألانيل-L-الجلوتامين، و 100 وحدة من البنسلين و 100 ميكروغرام من الستربتومايسين لكل مل.
    ملاحظة: يتم تستكمل المتوسطة مع 50٪ FBS لتسهيل مرفق الخلية إلى الجانب السفلي (أي السفلي) من إدراج. وسط النمو وملحق (ق) يمكن تبادلها بسهولة لمتطلبات نمو سلالات الخلايا الأخرى أو خطوط الخلايا.
  3. إعداد تعليق خلية من الخلايا متجهة لتكون مطلية على الجانب السفلي من إدراج.
    ملاحظة: هنا، تم الحصول على النتائج باستخدام AG1522 الخلايا الليفية الإنسان العادي تزرع في 75 سم 2 قوارير زراعة الخلايا، وبالتالي فإن هذه الخلايا تكون محور وصف إعداد تعليق الخلية.
  4. لجمع الخلايا، وإزالة المتوسطة النمو وغسل 2X خلية أحادي الطبقة مع 5 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  5. إزالة برنامج تلفزيوني وتنتشر 1 مل من 0.25٪ (المجلد / المجلد) التربسين مع 2.21 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، قبل تحسنت إلى درجة حرارة الغرفة (RT) على الخلايا لمدة 2 دقيقة في RT (درجة حرارة الغرفة).
  6. إخماد نشاط التربسين مع 9 مل من متوسط ​​النمو الكامل (المعد في الخطوة 1.1) وجمع الخلايا عن طريق pipetting بلطف تعليق الخلية على سطح القارورة 10X.
  7. تحديد تركيز خلية باستخدام عدادة الكريات أو مضادة الإلكترونية وماصة حجم تعليق الخلية التي سوف يقوم بتقديمالبريد 250،000 الخلايا في إدراج إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي معقمة.
  8. بيليه تعليق خلية بواسطة الطرد المركزي (800 x ج، 2 دقيقة). تعليق بيليه الخلية مع متوسط ​​نمو (المعد في الخطوة 1.2) لإنشاء تركيز 250،000 الخلايا في 70 ميكرولتر.
    ملاحظة: كما يقوم زراعة الخلايا في إدراج غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها منفذة على ركائز 2D، يتم إجراء زرع الخلايا على نحو مماثل، باستثناء الخلايا ينبغي وقف في البداية في المتوسط ​​تحتوي على 50٪ (المجلد / المجلد) FBS لتسهيل المرفق.

2. إعداد الملاحق

ملاحظة: لضمان ظروف معقمة، والعمل في تدفق الصفحي مجلس الوزراء السلامة البيولوجية مخصصة لزراعة الخلايا.

  1. اختر إدراج مع حجم الغشاء المسام من 0.4 ميكرون، 1 ميكرون، أو 3 ميكرون (تحددها مصلحة التجريبية (ق)، وحجم المسام يمكن استخدامها لاستكشاف دور مختلف وسائط الاتصال بين الخلايا).
    ملاحظة: المسام 0.4 ميكرون هو األصغرل يكفي للحد من تشكيل تقاطعات الفجوة الوظيفية بين الخلايا على جانبي غشاء إدراج، ويمكن استخدامها لدراسة الاتصالات بين الخلايا بفعل عوامل يفرز. في حين، و1 ميكرون و 3 ميكرون المسام كبيرة بما يكفي للسماح بتشكيل تقاطعات الفجوة الوظيفية، ويمكن استخدامها لدراسة الاتصالات بين الخلايا من قبل كل من تقاطعات الفجوة والعوامل يفرز.
  2. إزالة إدراج الفردية من التعبئة والتغليف ووضع في طبق متعددة جيدا الحجم على حد سواء.
    ملاحظة: هي إدراجات المتاحة مع مختلف المناطق سطح غشاء لتتناسب مع احتياجات التطبيق محددة (على سبيل المثال، 6 جيدا، إدراج 12 بئر، و 24 أيضا.). هنا، تم الحصول على النتائج باستخدام إدراج 6-جيدا، وبالتالي سيكون التركيز من الوصف نموذج.
  3. تغطية صحن، التي تحتوي على إدراج مع غطاء الطبق. عقد طبق متعددة جيدا بكلتا يديه، عكس بلطف الطبق بحيث قيعان إدراج (أي، والسفلي) تواجه الآن صعودا.
  4. إزالة عشرالبريد قاع الطبق متعددة جيدا، وفضح الجانب السفلي من إدراج. العمل مع إدراج واحد في وقت واحد، استخدام زوج العقيمة ملقط وعقد بلطف إدراج في المكان. مع الحرية، واستخدام ماصة مع طرف واسع الفم رسم 70 ميكرولتر من تعليق خلية (المعد في خطوات 1،3-1،8)، التي تحتوي على 250،000 الخلايا.
  5. لوحة الخلايا، ضع طرف ماصة بلطف على مركز للغشاء إدراج، ووماصة ببطء 70 ميكرولتر من تعليق خلية بينما تتحرك ببطء غيض ماصة حول سطح الغشاء. يجب الحرص على عدم تمديد طرف ماصة وتعليق خلية إلى حافة إدراج.
    ملاحظة: يمكن لمس حافة إدراج يؤدي إلى فقدان التوتر الشعري لتعليق الخلية مما يؤدي إلى الخلايا الجفاف خلال المرفق.
  6. كرر لإدراج المتبقية، مع الرعاية التي تمارس على عدم العمل مباشرة على إدراج تتعرض لتجنب التلوث الميكروبي المحتملين.
  7. العودة بلطف متعددة جيداأسفل صحن لتغطية إدراج. الحفاظ على طبق مع تدرج مقلوب، واحتضان في جو الهواء ترطيب من 5٪ (المجلد / المجلد) CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة.
    ملاحظة: إذا كان التعليق الخلية على إدراج الاتصالات في قاع البئر، رفع بعناية أسفل الطبق والراحة على حافة أعلى الطبق، بحيث تشكل زاوية طفيفة ويخلق المزيد من الفصل بين سطح الطبق و على الجانب السفلي من إدراج (حيث المصنف الخلايا). هذا سوف يمنع الخلايا من الالتصاق على سطح الآبار بدلا من إدراج.
  8. بعد فترة حضانة 30-45 دقيقة، وإزالة بلطف الطبق الذي يحتوي على إدراج ووضعه في خزانة السلامة البيولوجية تدفق الصفحي.
  9. مع اثنين من اليدين والحفاظ على غطاء طبق ضيق، بلطف إعادة عكس طبق مثل هذا الجانب السفلي من إدراج تحتوي على خلايا تعلق يواجه الآن إلى أسفل.
  10. ببطء وبعناية إضافة 2 مل (1 مل لمدة 3 ميكرون المسام إدراج لتجنب migratiعلى الخلايا من خلال المسام إدراج) من المتوسط ​​كاملة استعد مسبقا (انظر الخطوة 1.1) إلى كل بئر، بحيث يتم غمر الجزء السفلي من إدراج.
  11. بعد إضافة متوسط ​​النمو في جميع الآبار التي تحتوي على إدراج، ضع الطبق مرة أخرى في حاضنة مرطب.
  12. السماح للإدراج في البقاء دون عائق في الحاضنة لمدة 48 ساعة. بعد 48 ساعة، وإطعام الخلايا عن طريق الشفط 2 مل من المتوسط ​​من قاع البئر وإضافة 2 مل من متوسط ​​النمو الطازجة.
  13. بعد إضافة متوسطة جديدة إلى قاع البئر، والبذور 1 مل من ثاني تعليق السكان الخلية (~ 250000 خلية / مل) على الجانب العلوي من إدراج، التي لديها بالفعل أول خلية السكان المتزايد على الجانب السفلي (لهذه التجارب، ومطلي AG1522 (مراقبة) الخلايا أو الخلايا السرطانية (التجريبية) على الجزء العلوي من إدراج، التي لديها بالفعل خلايا AG1522، متجهة لتصبح مقاهي، وتزايد على الجانب السفلي من إدراج). وضع الطبق مرة أخرى في حاضنة مرطب.
    ملاحظة: إذا كان العملجي مع الخلايا التي لا تلتزم بشكل جيد في الجزء السفلي من إدراج هذه الخلايا يمكن زراعتها بدلا من ذلك على الجانب العلوي من إدراج.
  14. تغيير المتوسطة في 24، 72، و 96 ساعة بعد البذر السكان الثاني من الخلايا على الجانب العلوي من إدراج بواسطة الشفط المتوسطة من أعلى إدراج وقاع البئر. إضافة بلطف 1 مل من متوسطة جديدة إلى الجانب العلوي من إدراج و2 مل إلى قاع البئر. السماح للسكان الخلية اثنين بالبقاء في ثقافة مشتركة على جانبي نفاذية غشاء إدراج الصغيرة التي يسهل اختراقها لمدة 120 ساعة.

3. جمع الخلايا من إدراج بواسطة Trypsinization

ملاحظة: بالإضافة إلى سهولة الحصول على السكان الخلية التخصيب، ونموذج TME إدراج يسمح أيضا لعلاجات تجريبية مماثلة (على سبيل المثال، الحضانة مع المواد الكيميائية، والتعرض لظروف الأكسجين التي هي أعلى أو أقل من الغلاف الجوي المحيط، المؤينة العلاج الإشعاعي، وما إلى ذلك) كما البعض في المختبر سبيل المثال، في الموقع المناعية الكشف، النشاف الغربي) أو نشر لتجارب لاحقة (36).

  1. لجمع الخلايا، وإزالة إدراج من وسط النمو ووضعه في طبق خلية ثقافة 35 ملم تحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني. غسل أسفل وأعلى جانبي 1X إدراج مع 1 مل برنامج تلفزيوني.
  2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ (المجلد / المجلد) التربسين مع 2.21 ملي EDTA، قبل تحسنت إلى RT.
    1. إذا جمع الخلايا المزروعة على الجانب السفلي من إدراج، ووضع حل التربسين في صحن 35 ملم ووضع بلطف الجزء السفلي من إدراج في حل التربسين لمدة 2 دقيقة في RT.
    2. إذا جمع الخليةق نمت على الجانب العلوي من إدراج، ضع إدراج في صحن 35 ملم وإضافة محلول التربسين إلى أعلى إدراج واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT.
  3. إخماد نشاط التربسين وذلك بإضافة 800 ميكرولتر من متوسط ​​النمو الكامل.
    1. إذا جمع الخلايا المزروعة في الجزء السفلي من إدراج، إضافة المتوسطة النمو على طبق 35 ملم وجمع الخلايا بواسطة pipetting بلطف 1 مل من تعليق الخلية على سطح إدراج 10X، مع إدراج محتجزين في طفيف زاوية، بحيث تعليق خلية يجمع في طبق.
    2. إذا جمع الخلايا من الجانب العلوي من إدراج، إضافة المتوسطة النمو إلى الجانب العلوي، وماصة بلطف 1 مل من تعليق الخلية على سطح إدراج 10X.

4. توصيف الطهارة خلية بواسطة التدفق الخلوي

ملاحظة: لتميز قدرة إدراج غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها منفذة للحفاظ على نقاء رقال اثنين من السكان الخلية (أي العلوي والسفلي) لمدة تصل إلى 120 ساعة، أقسام 1-3 أجريت، مع الأخضر بروتين فلوري (GFP) -tagged MDA-MB-231 خلايا يجري مطلي على الجانب العلوي من إدراج، و خلايا AG1522 الموسومة غير GFP التي يجري مطلي على الجانب السفلي من 0.4 μm-، 1 μm-، أو 3 ميكرون إدراج المسام.

  1. مرة واحدة وقد تم جمع الخلايا من الجانب السفلي من إدراج (إجراء وصفه في القسم 3)، بيليه تعليق خلية بواسطة الطرد المركزي (500 غرام، 30 ثانية).
  2. إزالة طاف ووقف بيليه الخلية في 400 ميكرولتر من هانكس "محلول الملح المتوازن (HBSS) تستكمل مع 1٪ (المجلد / المجلد) FBS.
  3. لتحليل cytometric على تدفق مجهزة الكريات مع ليزر 488 نانومتر لإثارة GFP وممر الموجة مرشح من 530/30 للكشف عن GFP الفوتون 37.
  4. لأغراض تحديد الهوية خلية، استخدم السكان الخلية السيطرة AG1522 لضبط الأمام والفولتية الجانب مبعثر على قياس التدفق الخلوي. ضبطالجهد قناة GFP لضبط قيمة تألق ذاتي الخلوية كما عتبة الكشف الأدنى للإشارة GFP.
  5. تحديد النابضة عتبة باستخدام الخلايا السيطرة. تقييم نقاء كل سكان الخلية على أساس وجود خلايا GFP إيجابية مقابل السيطرة.
    ملاحظة: ومن شأن السكان نقية أن يعكس أي خلايا GPF إيجابية الكشف عنها.

5. توصيف الخلايا من قبل في الموقع المناعي

  1. وبعد trypsinization الخلايا من إدراج (انظر القسم 3)، وجمع الخلايا، لوحة 5 × 10 4 خلايا في 250 المتوسطة ميكرولتر النمو (راجع الخطوة 1.1) على coverslips زجاجية معقمة، والسماح لنعلق لمدة 1 ساعة في جو الهواء مرطب لل 5٪ (المجلد / المجلد) CO 2 في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  2. في نهاية الحضانة، وإزالة بلطف الطبق الذي يحتوي على ساترة ووضعه في خزانة السلامة البيولوجية تدفق الصفحي.
  3. بعناية إضافة 2 مل من المتوسط ​​الشامل استعد مسبقا (راجع الخطوة1.1) إلى كل طبق، بحيث يتم مغمورة ساترة.
  4. بعد إضافة المتوسطة النمو لجميع الأطباق التي تحتوي على coverslips، والعودة الأطباق إلى جو الهواء مرطب من 5٪ (المجلد / المجلد) CO 2 عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 48 ساعة.
  5. بعد حضانة 48 ساعة، وغسل 3X العينة مع برنامج تلفزيوني وإصلاح مع 4٪ (وزن / المجلد) الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT.
  6. شطف 5X مع تريس مخزنة المالحة (TBS: 50 ملي تريس الكلورين، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم) ثم permeabilize مع 0.25٪ (المجلد / المجلد) تريتون X-100، 0.1٪ (وزن / المجلد) سابونين لمدة 5 دقائق في RT.
  7. منع غير محددة مواقع الربط مع 2٪ (المجلد / المجلد) الماعز العادي المصل (خ ع)، 1٪ (وزن / المجلد) زلال المصل البقري (BSA)، 0.1٪ (المجلد / المجلد) تريتون X-100 في TBS (حجب حل) لمدة 1 ساعة على RT.
  8. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (مكافحة Caveolin 1 (CAV1)، 1: 1000) في عرقلة الحل في 4 درجات مئوية خلال الليل.
  9. يغسل الأجسام المضادة الأولية غير منضم (3X، 5 دقيقة / غسيل) مع 0.2٪ خ ع (المجلد / المجلد)، 1٪ (وزن / المجلد) BSA، 0.1٪ (فول / المجلد) تريتون X-100 في TBS (محلول الغسيل).
  10. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية في RT لمدة 1 ساعة في عرقلة الحل (انظر القسم 5.4).
  11. يغسل الأجسام المضادة الثانوية غير منضم (3X، 5 دقيقة / غسيل) مع محلول الغسيل (راجع الخطوة 5.6).
  12. جبل coverslips على شريحة مع تصاعد المتوسط ​​مكافحة تتلاشى تحتوي على 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي)، وختم بطلاء الأظافر.
  13. مراقبة الخلايا باستخدام الهدف التكبير النفط 63X على مجهر مقلوب مجهزة مصدر ضوء خارجي لإثارة مضان، والتقاط الصور باستخدام الكاميرا الرقمية المرفقة لتحليلها لاحقا.

6. توصيف الخلايا عن طريق ويسترن وصمة عار

ملاحظة: يتم وصف هذا الإجراء لطخة غربية في أماكن أخرى 38. يوصف موجزا هنا:

  1. وبعد انفصال الخلايا من إدراج بواسطة trypsinization (انظر القسم 3)، بيليه تعليق خلية بواسطة الطرد المركزي (500 غرام، 30 ثانية).
  2. إزالة طاف وتعليق 2X خلية بيليه مع 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني.
  3. إزالة الخلايا طاف وليز في 50 ميكرولتر من فحص الترسيب المناعي الشعاعي المعدلة (المعهد الملكي) عازلة (تريس 7.5 درجة الحموضة 50 ملم، كلوريد الصوديوم 150 ملم، NP40 1٪ (المجلد / المجلد)، deoxycholate الصوديوم مونوهيدرات (DOC) 0.5٪ (المجلد / المجلد)، دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) 0.1٪ (المجلد / المجلد))، التي تحتوي على الأنزيم البروتيني ومثبط الفوسفاتيز كوكتيل.
  4. احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 19000 ز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. تحديد تركيز البروتينات في طاف باستخدام بروتين الكثافة البصرية الفحص، متوافق مع المنظفات في المخزن المؤقت المعهد الملكي.
  6. البروتينات منفصلة من قبل الكهربائي دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد هلام (SDS-PAGE) وelectroblot على غشاء 0.2 ميكرون النيتروسليلوز.
  7. احتضان الأغشية في TBS تحتوي على 0.1٪ (المجلد / المجلد) توين-20 (TBST) و 4٪ (وزن / المجلد) الحليب الخالي من الدسم (حل حجب) لمدة 60 دقيقة، وتتفاعل مع الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية خلال الليل (المضادةCAV1، 1: 1000).
  8. غسل 3X الغشاء مع TBST في RT (5 دقيقة / غسيل).
  9. احتضان الأغشية لمدة 30 دقيقة في عرقلة الحل يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس مترافق مع البيروكسيديز الفجل (HRP) (1: 5000).
  10. غسل 3X الغشاء مع TBST في RT (5 دقيقة / غسيل).
  11. تصور المنتجات رد فعل من التوهج باستخدام نظام الكشف عن النشاف الغربية.

7. توصيف بين الخلايا الاتصالات بواسطة التدفق الخلوي

ملاحظة: لتميز القدرة على التكيف من الغشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها نفاذية إدراج لدراسة أنماط مختلفة من الاتصالات بين الخلايا (على سبيل المثال، العوامل يفرز، تقاطعات الفجوة). أجريت أقسام 1-2،12 مع خلايا AG1522 غير الفلورية التي يجري مطلي على الجانب السفلي من 0.4 μm-، 1 μm-، أو 3 إدراج ميكرون المسام.

  1. ثقافة غير المسمى خلايا AG1522 في صحن 35 ملم إلى 90٪ confluency باستخدام المتوسطة هو موضح في القسم 1.1.
  2. Rخلايا INSE 1X مع 1 مل من HBSS.
  3. خلايا الحمل مع Calcein AM التي يحتضنها الخلايا في HBSS تحتوي على 30 ميكرومتر من Calcein AM.
  4. احتضان لمدة 15 دقيقة في جو الهواء مرطب من 5٪ (المجلد / المجلد) CO 2 عند 37 درجة مئوية.
  5. غسل الخلايا 2X مع 1 مل من HBSS.
  6. يعرض للتريبسين الخلايا عن طريق إضافة محلول 200 ميكرولتر من 0.25٪ (المجلد / المجلد) التربسين مع 2.21 ملي EDTA لمدة 2 دقيقة في RT.
  7. إخماد نشاط التربسين وذلك بإضافة 800 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة تحتوي على 12.5٪ (المجلد / المجلد) FBS.
  8. جلب الخلايا في تعليق من قبل pipetting المتكررة.
  9. تحديد تركيز خلية باستخدام عدادة الكريات أو مضادة الإلكترونية ولوحة 250،000 خلايا محملة Calcein صباحا إلى الجانب العلوي من إدراج التي لديها بالفعل خلايا AG1522 المتزايد على الجانب السفلي.
  10. احتضان تدرج في جو الهواء ترطيب من 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية ل6 ساعات.
  11. بعد 6 ساعات، وجمع الخلايا من الجانب السفلي من إدراج، كما هو موضحفي القسم 3.
  12. بيليه تعليق خلية بواسطة الطرد المركزي (500 غرام، 30 ثانية).
  13. إزالة طاف ووقف بيليه الخلية في 400 ميكرولتر من HBSS تستكمل مع 1٪ (المجلد / المجلد) FBS.
  14. تحليل الخلايا على الكريات مجهزة ليزر وتصفية قادرة على إثارة وكشف عن انبعاث Calcein (496 نانومتر و 516 نانومتر، على التوالي)، في بروتوكول الشركة المصنعة.
  15. لأغراض تحديد الهوية الخليوي، استخدام السكان الخلية سيطرة غير ملوثين AG1522 لضبط الأمام والفولتية الجانب مبعثر على قياس التدفق الخلوي. ضبط Calcein قناة الجهد لضبط قيمة تألق ذاتي الخلوية كما عتبة الكشف الأدنى للإشارة Calcein.
  16. تحديد حد العتبة العلوية باستخدام الخلايا السيطرة تحميل Calcein. تقييم الاتصالات من أجل إدراج كل خلية على أساس وجود خلايا Calcein إيجابية مقابل السيطرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن هنا تكييفها لنفاذية غشاء إدراج الصغيرة التي يسهل اختراقها لتطوير نظام خلايا شارك في ثقافة مغاير في المختبر الذي يحاكي في الجسم الحي المكروية ورم (الشكل 1). يسمح هذا النظام لاثنين من السكان مختلفة من الخلايا التي يمكن زراعتها على جانبي غشاء مسامي إدراج لفترات طويلة من الزمن (تصل إلى 120 ساعة، في استخدامنا). والأهم من هذا النظام هو قادرة على الحفاظ على نقاء السكان الخلية، على النحو الذي يحدده تصفيح GFP الموسومة MDA-MB-231 الخلايا على الجانب العلوي من 0.4-، 1-، أو 3 إدراج م المسام والسماح لها أن تنمو في شارك في الثقافة مع خلايا AG1522 المتزايد على الجانب السفلي من إدراج، لمدة 120 ساعة. بعد هذا الوقت، تم جمع الخلايا من الجانب السفلي من إدراج وتحليلها من قبل التدفق الخلوي لتحديد وجود أي MDA-MB-231 خلايا GFP إيجابية، وهو ما يدل على فقدان نقاء السكان الخلية. وكشف تحليل 99.9٪ و 99.8٪ بوإعادة السكان من 0.4 و 1 إدراج ميكرون المسام، على التوالي؛ ومع ذلك، كان إدراج مع 3 ميكرون المسام غير قادر على الحفاظ على الفصل بين سكان الخلية، حيث أن المسام كبيرة بما يكفي للسماح لعدد كبير من MDA-MB-231 خلايا GFP إيجابية للهجرة عبر الغشاء (الشكل 2) .

الأهم من ذلك، من خلال في المناعي الموقع وتحليل لطخة غربية تمكنا من إثبات قدرة هذا النظام على توليد فعالية الخلايا الليفية المرتبطة السرطان من العادي مضاعفا البشري الخلايا الليفية AG1522 التالية ثقافة مشتركة مع MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي، على النحو الذي تحدده انخفاض تعبير عن Caveolin-1، وهي راسخة الكاف العلامات البيولوجية 39-42 (الشكل 3). CAV1 هو بروتين السقالات التي تشكل caveolae في المجال الدهون مجموعة من غشاء البلازما، التي تشارك في العمليات الخلوية متعددة 43. في لطخة غربية، لوحظت شريطين متميزة، المقابلة لα و β الإسوية من CAV1 44. للأسف، لا يعرف إلا القليل عن الفرق (ق) بين الأشكال الإسوية، وخاصة دورها في المؤشرات الحيوية CAF.

لقد أظهرنا أيضا إتقان نظام المشاركة في ثقافة إدراج لتعديل الاتصالات بين الخلايا بين اثنين من السكان الخلية مغاير (الشكل 4). غير المسمى، كانت الفجوة تقاطع الليفية AG1522 مضاعفا الإنسان المختصة مثقف لconfluency على الجانب السفلي من إدراج. تم تحميل مجموعة ثانية من الخلايا AG1522 مع Calcein صباحا، أخضر فلوري الفجوة تقاطع صبغ قابلة للاختراق، ومطلي على الجانب العلوي من إدراج. وسمح للسكان الخلية اثنين على التواصل عن 6 ساعات، وبعد ذلك تم عزل الخلايا على الجانب السفلي من إدراج وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. أن الخلايا Calcein إيجابي من الجانب السفلي من إدراج يكون تعبيرا عن الخلايا التي فاقأنشئت على اقتران الفجوة صلي من خلال المسام إدراج. حجم المسام 0.4 ميكرون إدراج تشكيل فجوة تقاطع وظيفي محدود بين الخلايا تنمو على جانبي إدراج، وبالتالي تقييد الاتصالات إلى عوامل يفرز (على سبيل المثال، عوامل النمو، microvesicles، وما إلى ذلك). بدلا من ذلك، حجم 1 ميكرون و 3 ميكرون المسامات واسعة على ما يبدو بما فيه الكفاية للسماح للاقتران وظيفية من الخلايا من خلال تقاطعات الفجوة. لذلك، من خلال تحوير حجم المسام، ويمكن للمرء أن نبدأ في فهم دور متنوع (ق) التي سائط مختلفة من الاتصالات بين الخلايا قد يكون على التنمية TME والتطور.

شكل 1
الشكل 1: نافذ الصغيرة التي يسهل اختراقها غشاء الخطة النموذجية إدراج (أ) المصنف طبيعية على ما يبدو الخلايا الليفية AG1522 مضاعفا الإنسان (خلايا منخفض مرور) متجهة لتصبح مقاهي على المقلوبإدراج الصغيرة التي يسهل اختراقها نفاذية تتألف من 10 ميكرومتر غشاء البوليستر سميكة مع 0.4 ميكرون، 1 ميكرون، أو 3 ميكرون المسام. بعد التعلق، ومقلوب إدراج ووضعها في الآبار لوحات ومثقف لconfluency. (ب) وتزرع الخلايا السرطانية والخلايا الليفية السيطرة على حدة في قوارير قبل أن يتم المصنف على الجانب العلوي من إدراج مع الخلايا الليفية تزايد بشكل وثيق على الجانب السفلي. (ج) يتم تغذية الخلايا المشارك مثقف كل يوم وتواصل في الوقت المطلوب. (د) في العصر منهما التالية ثقافة مشتركة و / أو العلاجات التجريبية، وعزلت مقاهي (الجانب السفلي من إدراج) و / أو الخلايا السرطانية (الجانب العلوي من إدراج) بعناية من قبل trypsinization، مما أسفر عن السكان الخلية نقية للغاية، والتي يمكن استخدامها لتحليل نقاط النهاية أو نشر لدراسات لاحقة. الرجاء انقر هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: جيل من بالسكان خلية العالي التخصيب تدفق الممثل الخلوي النتائج تثبت قدرة إدراج بالمحافظة التخصيب، ولكن مستقل السكان الخلية مغاير بعد 120 ساعة ثقافة مشتركة. وتشير (أ) خلايا AG1522 تحصد من الجانب السفلي من 0.4 ميكرون المسام إدراج 99.9٪ من السكان أن تكون خالية من MDA-MB-231 خلايا GFP المسمى المتزايد على الجانب العلوي من إدراج (الربع السفلي الأيسر). (ب) خلايا AG1522 تحصد من الجانب السفلي من المسام إدراج 1 ميكرون تظهر أيضا السكان المخصب 99.8٪ (الربع السفلي الأيسر). (ج) خلايا AG1522 تحصد من الجانب السفلي من المسام إدراج 3 ميكرون تكشف عن أن٪ فقط 68.5 من السكان خالية من الخلايا GFP المسمى (الربع السفلي الأيسر)، مشيرا إلى أن عددا كبيرا من MDA-MB-231 خلايا GFP إيجابية كانوا قادرين على الهجرة من خلال 3 ميكرون المسام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: جيل من السرطان-أسوشيتد الخلايا الليفية التعبير المنخفض من CAV1 هو متسقة وموثوق بها الكاف العلامات البيولوجية. (أ) وصور مجهرية للفي المناعي الموقع (مقياس بار = 20 ميكرون)، و (ب) تحليل لطخة غربية من CAV1 في الخلايا AG1522 التي كانت بالتعاون مع ثقافة خلايا AG1522 (مراقبة) (إلى اليسار)، أو مع MDA- خلايا سرطان الثدي MB-231 (يمين) لمدة 120 ساعة. تلطيخ مع الشقائقية S الأحمر كانت تستخدم للسيطرة على التحميل ولتحديد التغير أضعاف في البقع الغربية. النتائج هي ممثلثلاث تجارب منفصلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: التحوير من بين الخلايا الاتصالات عن طريق إدراج مسام الحجم التدفق الخلوي التحليلات مما يدل على القدرة على التكيف من الصغيرة التي يسهل اختراقها نموذج TME إدراج نفاذية الغشاء لتحديد لأنماط مختلفة من الاتصالات بين الخلايا بين Calcein AM تحميل خلايا AG1522 تنمو على رأس إدراج والسيطرة AG1522 خلايا المتزايد على جانبها السفلي. (أ) الخلايا التي تحصد من الجانب السفلي من 0.4 ميكرون إدراج المسام تظهر مستويات منخفضة جدا من Calcein إيجابية الخلايا (0.57٪)، مما يشير إلى محدودية التواصل الفجوة تقاطع طريق المسام إدراج. (ب) الخلايا التي تحصد من الجانب السفلي من 1 ميكرون إدراج المسام تظهر ساعةمستويات igher من Calcein إيجابية الخلايا (9.98٪)، مشيرا إلى تشكيل تقاطعات الفجوة الوظيفية. (ج) خلايا تحصد من الجانب السفلي من 3 ميكرون إدراج المسام تظهر مستويات عالية من Calcein إيجابية الخلايا (87.8٪)، مشيرا إلى الاتصالات واسعة النطاق الفجوة صلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول الموصوفة هنا هي بسيطة، قابلة للتكيف في إجراء المختبر (الشكل 1) التي تستخدم منفذ الصغيرة التي يسهل اختراقها إدراج غشاء لتوليد التخصيب السكان الخلية الفردية من شارك في ثقافة من خلايا غيروي. إلى حد كبير، وهذا النموذج هو مناسبة للتحقيق في مختلف وسائل الاتصال بين الخلايا. وتشمل الخطوات الحاسمة اختيار إدراج حجم المسام المناسب لمصلحة تجريبية محددة (ق)، وبذر سكان الخلية الأولى على الجانب السفلي من إدراج في المتوسط ​​تستكمل مع 50٪ FBS، بذر سكان الخلية الثانية على الجانب العلوي من إدراج، وشارك في زراعة اثنين من سكان الخلية متميزة لمدة زمنية ممكنة. وتبين لنا أن هذا النظام قادر على محاكاة الخصائص المختلفة في الجسم الحي، مما يوفر فرصة أكبر لفهم الجزيئي، المظهرية، والتغيرات الكامنة التي تحدث أثناء تطور TME المبكر الذي يتناول د رئيسيisadvantage العديد من TME في المختبر نماذج المحددة (الشكل 2).

نموذج يمكن تعديلها بسهولة للسماح بالتحقيق في مختلف جوانب التفاعلات خلية خلية في تطور مرض السرطان-سدى وتطور TME (الشكل 4). في حين يسمح 0.4 ميكرون المسام إدراج اقتران الحميمة بين اثنين من السكان الخلية 45، فإنه يقيد إلى حد كبير تشكيل تقاطعات الفجوة الوظيفية بين الخلايا المزروعة على جانبي الغشاء إدراج (الشكل 4). لذلك، وبالتالي تسهيل التحقيق في دور العوامل إنتشاري (على سبيل المثال، عوامل النمو) و / أو الحويصلات خارج الخلية (على سبيل المثال، exosomes)، الذي توسط تنمية CAF 46-48. بدلا من ذلك، 1 ميكرون و 3 ميكرون المسام كبيرة بما يكفي للسماح بتشكيل تقاطعات الفجوة الوظيفية، مما يتيح دراسة كل من اقتران التمثيل الغذائي المباشر عبر القنوات صلي والاتصال غير المباشر من خلالالعوامل يفرز إنتشاري. لكن، وكما يسمح المسام إدراج 3 ميكرون هجرة الخلايا من خلال المسام (انظر الشكل 2)، فإنه لا الحفاظ على نقاء اثنين من سكان الخلية مغاير منفصل خلال أوقات ثقافة مشتركة طويلة (على سبيل المثال، 120 ساعة). في حين أن النموذج الحالي تمكن الدراسة من عدة جوانب TME، هي محدودة في قدرتها على حساب لكثير من التفاعلات الفسيولوجية المعقدة التي تحدث داخل الجسم الحي في TME (على سبيل المثال، تبادل السوائل الأوعية الدموية، وما إلى ذلك).

فهم الأحداث في وقت مبكر من تفعيل السرطان سدى وتطوير TME المهم في توضيح الخطوات المتورطين في بدء الأساسي الورم والتقدم، وكذلك ورم خبيث. ومن المسلم به الآن على نطاق واسع أن سدى مرض السرطان، خاصة مقاهي، تمتلك دورا حاسما في دعم التسرطن (استعرضت في 49). وقد أدى ذلك إلى وضع الكثيرين في المختبر 2D و 3D نماذج، الهدفإد في استراتيجيات إلقاء الضوء لاستهداف آليات في وقت مبكر يساهم في انسجة تفعيل وتطور الورم. لسوء الحظ، العديد من هذه النماذج محدودة بسبب عدم قدرتها على السماح عزل السكان خلية فردية، دون تستغرق وقتا طويلا وتجهيز مرهقة، لمزيد من الدراسة. وبالتالي يوفر هذا البروتوكول إضافة مهمة في مجال البحوث TME، كما أنه يجمع في الجسم الحي مثل الخصائص مع القدرة على الحصول بسهولة وبسرعة السكان الخلية التخصيب أو النقي للتحليل الفوري أو انتشار لدراسات لاحقة.

بمجرد يتقن هذه التقنية، يمكن استخدام نموذج TME إدراج التحقيق المتنوعة TME التفاعلات ثنائية الاتجاه (على سبيل المثال، والسرطان إلى البطانية، وسرطان الخلايا المناعية، وما إلى ذلك). بالإضافة إلى ذلك، تعقد ثقافة مشتركة يمكن أن تتعزز من خلال وضع سكان الخلية المختلطة على جانب واحد من إدراج وعدد سكانها واحد على الجانب بديل، وبالتالي الحصول علىجي أكثر في الجسم الحي مثل TME تعقيد السكان الخلية. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر في اختيار وإدراج مع سليم مسام الحجم إذا باستخدام خلايا من قطر لا سيما الصغيرة (على سبيل المثال، الخلايا الليمفاوية البشرية التي يبلغ قطرها = 7 ميكرون 50)، لأنها قد تكون قادرة على الهجرة من خلال المسام أصغر ( على سبيل المثال، 0.4 ميكرون أو 1 ميكرون). قبل أن تشارك في الثقافة، قد يكون له ما يبرره التجارب الهجرة (الشكل 2) لضمان الحفاظ على السكان الخلية نقية في جميع أنحاء التجارب الثقافة المشتركة الموسعة.

هذا النموذج هو أيضا قابلة للتحقيق في الآثار المترتبة على مختلف التحديات والعلاجية (على سبيل المثال، الإشعاعات المؤينة، المعالجة الكيميائية، ارتفاع الحرارة) والتعديلات الفسيولوجية (على سبيل المثال، نقص الأكسجين، وفرط التأكسج، مثبطات البيولوجية) في السكان الخلية المختلطة التي تقترن عبر منفذ إدراج غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها. وقد أثبت هذا النموذج قدرته على توليد مقاهي بنجاح، بيئة تطوير متكاملةntified من العلامات البيولوجية المقبولة على نطاق واسع CAF (أي أسفل تنظيم CAV1) 39-42 (الشكل 3)، الذي مزيد من خفض بنسبة 55٪ عندما استخدمت في المحافظة على نظام إدراج في الجسم الحي في مثل ص 2 (7 ملم زئبق؛ 0.5٪ O 2) 51، وتسليط الضوء على التكيف نموذج لمختلف التصاميم التجريبية وشروط (لا تظهر البيانات). وخلاصة القول، وهذا النموذج يوفر طريقة مبسطة وفرصة لتعديل العوامل الزمانية والخارجية من أجل الحصول على سبر اغوار تفعيل السرطان سدى، وتطور في وقت مبكر من TME، والاستجابات الخلوية إلى العوامل العلاجية أو البيئي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة أو المتصارعة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast Coriell 107661 Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line PerkinElmer 119261 Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line Cell Biolabs AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM) Corning Cellgro 15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Sigma F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Corning Cellgro 25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning Cellgro 30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) Costar 3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) Greiner bio-one 657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) Costar 3452
6-well Culture Plate Greiner Bio-One Cellstar 657160-01
75 cm2 cell culture flask CellStar 658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x Corning Cellgro 21-040-CV without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x Corning Cellgro 25-053-Cl
15 ml Centrifuge Tube CellTreat 229411
35 mm x 10 mm Cell Culture Dish Greiner bio-one 627 160
Name Company Catalog Number Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1 BD Transduction Laboratories 610406 In situ Immunofluorescence - 1:5,000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific A-11029 In situ Immunofluorescence - 1:2,000
Bovine Serum Albumin - Fraction V Rockland BSA-50 Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution ThermoFisher Scientific 28908 Dilute to 4% with 1x PBS
Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) Fisher 12548B
Triton X-100 Sigma T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen S36938
Name Company Catalog Number Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM Molecular Probes C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14025-076
Name Company Catalog Number Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1 BD Transduction Laboratories 610406 Western Blot - 1:1,000
Tween-20 BioRad 170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) BioRad 162-0112
Western Lightning Plus-ECL PerkinElmer NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay BioRad 500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS) BioRad 161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) Sigma D5670
IGEPAL CA-630 (NP40) Sigma I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 BioRad 161-0158

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
  3. Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
  4. Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
  5. Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59 (19), 5002-5011 (1999).
  6. Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  7. Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
  8. Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
  9. Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  10. Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
  11. Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
  12. Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  13. Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  14. Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
  15. De Wever, O., Nguyen, Q. -D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
  16. Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
  17. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
  18. Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
  19. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
  20. Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
  21. Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
  22. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  23. Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
  24. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  25. Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
  26. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
  27. Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407 (2009).
  28. Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
  29. Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638 (2013).
  30. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
  31. Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387 (2010).
  32. Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
  33. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540 (2011).
  34. Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
  35. Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
  36. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
  37. Ducrest, A. -L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65 (2002).
  38. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  39. Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
  40. Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
  41. Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
  42. Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102 (2013).
  43. Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
  44. Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
  45. Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
  46. Tyan, S. -W., Kuo, W. -H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313 (2011).
  47. Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
  48. Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310 (2013).
  49. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
  50. Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
  51. Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Research. 51 (12), 3316-3322 (1991).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 115، سرطان علم الأحياء، العدد، ورم المكروية، السرطان، اسوشيتد الخلايا الليفية، بين الخلايا الاتصالات، جاب المفارق، خارج الخلية إفراز، نافذ الصغيرة التي يسهل اختراقها غشاء إدراج،
وتقليد من المكروية ورم: طريقة بسيطة لتوليد بالسكان خلية المخصب والتحقيق بين الخلايا الاتصالات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Domogauer, J. D., de Toledo, S. M.,… More

Domogauer, J. D., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication. J. Vis. Exp. (115), e54429, doi:10.3791/54429 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter