Abstract
Forståelse af de tidlige heterotypiske interaktioner mellem kræftceller og det omgivende ikke-kræft stroma er vigtigt at belyse de begivenheder, der fører til stromale aktivering og etablering af tumor mikromiljø (TME). Adskillige in vitro- og in vivo modeller af TME er blevet udviklet; dog generelt disse modeller ikke let tillader isolering af individuelle cellepopulationer, under ikke-forstyrrende betingelser, til yderligere undersøgelse. For at omgå denne vanskelighed har vi ansat en in vitro TME model ved hjælp af en celle vækstsubstrat bestående af en permeabel mikroporøs membran insert, der tillader simpel generation af højt berigede cellepopulationer vokset intimt, men hver for sig på hver side af indsatsens membran for udvidet samarbejde -Kultur gange. Gennem brug af denne model, er vi i stand til at frembringe stærkt beriget cancerassocieret fibroblast (CAF) populationer fra normale diploide humane fibroblaster efterco-kultur (120 timer) med meget metastatiske humane brystcarcinomaceller, uden anvendelse af fluorescerende tagging og / eller cellesortering. Derudover ved at modulere porestørrelse af indsatsen, kan vi kontrollere for den tilstand af intercellulær kommunikation (f.eks gap junction-kommunikation, secernerede faktorer) mellem de to heterotypiske cellepopulationer, der tillader undersøgelse af mekanismerne bag udviklingen af TME, herunder betydningen af gap-junction permeabilitet. Denne model tjener som et værdifuldt redskab i at øge vores forståelse af de indledende begivenheder, der fører til kræft-stroma indvielse, den tidlige udvikling af TME, og den modulerende effekt af stroma på svarene fra kræftceller til terapeutiske midler.
Introduction
Tumoren mikromiljø (TME) er et meget komplekst system bestående af carcinomaceller, der sameksisterer og udvikle sig sammen med vært stroma. Denne stromale komponent består typisk af fibroblaster, myofibroblaster, endotelceller forskellige immun komponenter, samt en ekstracellulær matrix 1. En væsentlig bestanddel, ofte størstedelen af denne stroma, aktiveres fibroblaster, ofte omtalt som cancerassocierede fibroblaster eller carcinoma-associerede fibroblaster (CAF) 2,3. Modsætning til normale, ikke-aktiverede fibroblaster, CAF bidrager til tumorinitiering, progression, angiogenese, invasion, metastase, og fornyet 4-11 i en lang række carcinomer, herunder bryst-, prostata-, lunge-, pancreas, hud, colon, spiserør, og ovarie 5,6,12-17. Alligevel forbliver den nøjagtige karakter af bidraget fra CAF hele kræft patogenese dårligt defineret. Endvidere har klinisk evidens påvist en prognostisk værdi af CAF, Korrelere deres tilstedeværelse til high-grade maligniteter, svigt terapi og samlet dårlig prognose 10,18,19.
Det er klart, at øge vores forståelse af de initierende hændelser i CAF udvikling, samt de intercellulære kommunikation medierende deres rolle i TME, kan give spændende nye terapeutiske mål og forbedrede strategier, der kunne forbedre patienternes resultater. Mod dette mål, har flere in vivo og in vitro-modeller blevet udviklet. Mens in vivo tilgange er mere reflekterende af patienternes TME, de besidder begrænsninger, herunder den enorme kompleksitet og heterogenitet både inden for og mellem tumorer. Desuden tumor prøver fra mennesker ofte repræsenterer højt udviklet TME og tillader ikke en forståelse af de TME initierende hændelser. Eksperimentelle dyrestudier tilbyde nogle fordele, men generalisering af data fra dyreforsøg til mennesker skal gøres med forsigtighed på grund af forskelle i physiologi mellem mennesker og dyr, såsom gnavere (fx til thiolkemi 20, stofskifte 21, tolerance understrege 22, etc.). Yderligere, i modsætning til menneskelige befolkning, som er genetisk heterogent og laboratoriedyr er typisk avlet til homogenitet. Det er også ofte vanskeligt at undersøge transiente fysiologiske variationer og cellefænotype ændringer, såvel som til at styre specifikke eksperimentelle parametre ved hjælp dyr såsom gnavere. Således in vitro 2- og 3-dimensionelle (2D og 3D) vævskulturplader modeller er ofte anvendt til at fremme den grundlæggende forståelse af TME udvikling. På trods af deres mangel på en præcis skildring af kompleksiteten af in vivo systemer, disse modeller giver fordele, som i høj grad letter mekanistiske undersøgelser. In vitro-modeller giver mulighed for en mere forenklet, fokuseret, og omkostningseffektiv analyse af TME, hvorved statistisk signifikant data kan genereres iceller fri af systemiske variationer, der opstår i dyr.
Der er flere varianter af in vitro systemer. De to mest almindeligt anvendte TME in vitro-modeller består af blandet monolag eller sfæroide cellekulturer. Begge dyrkningsmetoder er fordelagtige for de grundlæggende undersøgelser af intercellulære interaktioner (f.eks normale celler med tumorceller) og til analyse af forskellige TME specifikke cellefænotype ændringer (f.eks, fremkomsten af cancerassocierede fibroblaster fra normale fibroblaster). Derudover sfæroiderne kan skabe en mere reflekterende vævslignende struktur af TME, og kan være repræsentativ for tumor heterogenitet 23. Men sphæroider producerer ofte meget varierende ilt spænding gradienter tværs lag, som kan komplicere eksperimentelle konklusioner 24. Desværre er begge modeller yderst begrænset i deres evne til at isolere rene cellepopulationer til yderligere karakterisering og undersøgelse efter samarbejdekultur. At gøre dette ville kræve mindst én celletype at være fluorescens-mærket eller mærket med en identificering maker, og derefter udsætte den blandede co-kultur til omfattende forarbejdning og cellesortering at adskille cellepopulationer. Mens en cellesorterer er i stand til at isolere en temmelig ren cellepopulation, må man være bekendt med cellulært stress og potentiel mikrobiel kontaminering risici 25.
For at lette forståelsen af intercellulære kommunikation, er blevet viet en stor indsats i retning af at udvikle og optimere in vitro-systemer, der nøje efterligner in vivo miljø, mens tillader en forenklet tilgang. Et sådant værktøj er den permeable mikroporøse insert, en membran substrat, som først blev udviklet i 1953 26 og derefter tilpasset til forskellige formål og undersøgelser (f.eks cellepolaritet 27, endocytose 28, lægemiddeltransport 29, tissue modellering 30, fertilization 31, tilskuer-virkning 32,33, etc.). Dette system tillader vækst af celler med in vivo-lignende anatomisk og funktionel differentiering, såvel som ekspression af mange in vivo markører 34,35, som ikke observeres ved dyrkning på uigennemtrængeligt plasticware. Endvidere den ekstremt tynde porøse membran (10 um tyk) tillader hurtig diffusion af molekyler og ækvilibreringstider, som simulerer in vivo miljø og tillader uafhængig cellulær funktion på både apikale og basolaterale celle domæner. En yderligere fordel ved indsatsens nytte som et TME-system er dets fysiske adskillelse af to heterotypiske cellepopulationer dyrket på hver side af membranen i de samme miljømæssige betingelser, samtidig med at forskellige former for intercellulær kommunikation gennem membranen porer. Selvom fysisk adskilt, er de to cellepopulationer metabolisk koblet via udskilte elementer og, som debeskrevet her, også gennem gap-forbindelsesepitop kanaler. Derudover, ved at opretholde inserterne på in vivo delvis oxygenspænding (PO 2), modellen reducerer komplikationer af oxygen- og kemiske gradienter observeret i andre systemer. Snarere, det øger forståelsen af naturlige mekanismer, der styrer TME. Især kan de to cellepopulationer let isoleres med høj renhed, uden fluorescerende tagging og / eller cellesortering efter længere perioder co-kultur.
Her beskriver vi et in vitro TME-protokol bestående af humane brystcarcinomaceller og humane fibroblaster dyrket henholdsvis på hver side af en permeabel mikroporøs membran insert, men alligevel i kontinuerlig tovejskommunikation gennem membranporerne. Vi viser, at ved hjælp af membraner med forskellige porestørrelser, bidraget af en bestemt type af intercellulære kommunikation (f.eks udskilles faktorer versus gap junctions) til udviklingaf TME kan undersøges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af Kultur Medier og celler
- Forbered 500 ml Eagles minimum essentielt medium suppleret med 12,5% (vol / vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamin og 100 enheder penicillin og 100 ug streptomycin pr ml.
BEMÆRK: vækstmedium og tillæg (er) kan let udskiftes med væksten kravene i andre celle stammer eller cellelinier. - Forbered 70 pi cellekulturmedium for hver indsats (6-brønds format insert): Eagles minimum essentielt medium suppleret med 50% (vol / vol) varmeinaktiveret FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamin og 100 enheder penicillin og 100 ug streptomycin pr ml.
BEMÆRK: Mediet suppleret med 50% FBS for at lette cellebinding til undersiden (dvs. undersiden) af indsatsen. Vækstmediet og tillæg (er) kan let udskiftes med væksten kravene i andre celle stammer eller cellelinier. - Der fremstilles en cellesuspension af cellerne bestemt til at blive udpladet på undersiden af indsatsen.
BEMÆRK: Her blev resultaterne opnået under anvendelse af AG1522 normale humane fibroblaster dyrket i 75 cm 2 celledyrkningskolber, og disse celler vil derfor være i fokus i beskrivelsen af cellesuspensionen forberedelse. - At indsamle celler, fjerne vækstmediet og vask cellemonolaget 2x med 5 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS).
- Fjern PBS og spredt 1 ml 0,25% (vol / vol) trypsin med 2,21 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), opvarmet til stuetemperatur (RT) i løbet af cellerne i 2 minutter ved stuetemperatur (stuetemperatur).
- Stands trypsinaktivitet med 9 ml komplet vækstmedium (fremstillet i trin 1.1) og indsamle celler ved forsigtigt at pipettere cellesuspensionen over overfladen af kolben 10x.
- Bestemme koncentrationen celle ved anvendelse af et hæmocytometer eller elektronisk tæller og pipette volumen cellesuspensionen, der vil provide 250.000 celler pr insert i en steril 15 ml centrifugerør.
- Pelletere cellesuspensionen ved centrifugering (800 x g, 2 minutter). Suspender cellepelleten med vækstmedium (fremstillet i trin 1.2) at skabe en koncentration på 250.000 celler pr 70 pi.
BEMÆRK: Som cellekultur i permeable mikroporøse membran skær er baseret på 2D substrater, er cellepodning udføres på lignende måde, bortset cellerne bør indledningsvis suspenderet i medium indeholdende 50% (vol / vol) FBS at lette fastgørelsen.
2. Udarbejdelse af Inserts
BEMÆRK: For at sikre sterile forhold, arbejde i en LAF kabinet dedikeret til cellekultur.
- Vælg skær med en membran porestørrelse på 0,4 um, 1 um, eller 3 um (bestemt ved eksperimentelle interesse (er), som porestørrelsen kan anvendes til at undersøge den rolle, som forskellige måder intercellulær kommunikation).
BEMÆRK: 0,4 um pore er small nok til at begrænse dannelsen af funktionelle gap junctions mellem celler på begge sider af insertet membranen og kan bruges til at studere intercellulær kommunikation af udskilte faktorer. Henviser, de 1 um og 3 um porer er store nok til at tillade dannelse af funktionelle gap junctions og kan bruges til at studere intercellulær kommunikation af både gap junctions og secernerede faktorer. - Fjern individuelle indsatser ud af emballagen og anbringes i en lige så store multi-godt fad.
BEMÆRK: Indsætter fås med forskellige membran areal til at passe specifikke anvendelsesområder behov (f.eks, 6-godt, 12-godt, og 24-brønds skær.). Her blev de opnåede resultater ved brug af 6-godt indsætte, og vil derfor være i fokus i den model beskrivelsen. - Dæk fadet, som indeholder de indsatser med parabol låg. Hold multi-brønd fad med begge hænder, vend forsigtigt fadet sådan at indsatsen bunde (dvs. undersiden) er nu opad vendende.
- Fjern the bunden af multi-brønd skål, udsætter undersiden af indsatserne. Arbejde med en indsats på et tidspunkt, skal du bruge en steril tang, og hold forsigtigt indsatsen på plads. Med den frie hånd, brug en pipette med en bred mund tip til at trække 70 pi af cellesuspensionen (udarbejdet i trin 1,3-1,8), der indeholder 250.000 celler.
- Til pladen cellerne, placere pipettespidsen forsigtigt på midten af indsatsens membran, og langsomt pipette 70 pi cellesuspension mens langsomt bevæger pipettespidsen rundt om overfladen af membranen. Pas på ikke at forlænge pipettespidsen og cellesuspensionen til kanten af indsatsen.
BEMÆRK: Berøring kanten af indlægget kan resultere i tab af kapillær spænding af cellesuspensionen fører til cellerne udtørring under fastgørelse. - Gentag for de resterende indsatser, med omhu udøves ikke at arbejde direkte over de udsatte indsatser for at undgå potentiel mikrobiel kontaminering.
- Forsigtigt returnere multi-brøndskål bund til dækning indsatserne. Holde skålen med indsatse inverteret, inkuber i et befugtet luft atmosfære af 5% (vol / vol) CO2 ved 37 ° C i 30-45 min.
BEMÆRK: Hvis cellesuspensionen på indsatsen kontakter bunden af brønden, løft forsigtigt fadet bunden og lad den hvile på kanten af fadet toppen, så det danner en lille vinkel og skaber større adskillelse mellem overfladen af skålen og undersiden af indsatserne (hvor cellerne podes). Dette vil forhindre cellerne i at binde sig til overfladen af brøndene i stedet for indsatsen. - Efter 30-45 min inkubationstid, forsigtigt fjerne skål indeholdende indsatserne og placere den i LAF kabinet.
- Med to hænder og holde skålen låg stramme, forsigtigt igen vendes skålen, således at undersiden af indsatserne indeholdende de vedhæftede celler nu vender nedad.
- Langsomt og forsigtigt tilsættes 2 ml (1 ml til 3 um pore indsætter at undgå migratipå celler gennem indsatsen porer) af forvarmet komplet medium (se trin 1.1) til hver brønd, så bunden af indsatsen er nedsænket.
- Efter tilsætning vækstmedium i alle brøndene indeholdende inserter, placere skålen tilbage i fugtig inkubator.
- Tillad indsatsene at forblive uforstyrret i inkubatoren i 48 timer. Efter 48 timer fodre cellerne ved sugning de 2 ml medium fra bunden af brønden og tilsætning af 2 ml frisk vækstmedium.
- Efter tilsætning af frisk medium til bunden af brønden, frø 1 ml af den anden cellepopulation suspension (~ 250.000 celler / ml) på oversiden af indsatsen, som allerede har den første cellepopulation vokser på undersiden (for disse eksperimenter, er AG1522 (kontrol) celler eller cancerceller (eksperimentel) celler udpladet på toppen af skær, som allerede har AG1522-celler, bestemt til at blive CAF, vokser på undersiden af indsatsene). Skålen tilbage i fugtig inkubator.
BEMÆRK: Hvis arbejdetArbejde med celler, der ikke klæber godt til bunden af indsatsen, kan disse celler alternativt dyrkes på oversiden af indsatsen. - Skift medium ved 24, 72 og 96 timer efter podning den anden population af celler på oversiden af indsatsen ved sugning mediet fra toppen af indsatsen og bunden af brønden. Forsigtigt tilsættes 1 ml frisk medium til oversiden af indsatsen og 2 ml til bunden af brønden. Så de to cellepopulationer til at forblive i co-kultur på hver side af den permeable mikroporøse insert membran til 120 timer.
3. Indsamling Celler fra Insert ved trypsinbehandling
BEMÆRK: Ud over den lette opnåelse berigede cellepopulationer, insertet TME model giver også mulighed for lignende eksperimentelle behandlinger (f.eks, inkubering med kemikalier, udsættelse for oxygen forhold, der er over eller under den omgivende atmosfære, ioniserende strålebehandling m.fl.) som andre in vitro (dvs. in situ immuno-detektion, Western blotting) eller opformeret til efterfølgende eksperimenter 36.
- At indsamle celler, fjerne indsatsen fra vækstmediet og anbringe det i en 35 mm cellekultur skål indeholdende 1 ml PBS. Vask nederste og øverste sider af insertet 1x med 1 ml PBS.
- Fjern PBS og tilsættes 200 pi 0,25% (vol / vol) trypsin med 2,21 mM EDTA, forvarmet til stuetemperatur.
- Hvis indsamling af celler dyrket på undersiden af indsatsen, placere trypsin opløsningen i 35 mm skål og anbring forsigtigt bunden af indsatsen ind i trypsin opløsning i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Hvis opsamling cellens dyrket på oversiden af indsatsen, placere indsatsen i en 35 mm skål og tilsæt trypsin opløsning til toppen af indsatsen og inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Stands trypsinaktivitet ved tilsætning 800 pi komplet vækstmedium.
- Hvis indsamling af celler dyrket på bunden af indsatsen, tilføje vækstmediet til mm skål 35 og opsamle cellerne ved forsigtigt at pipettere 1 ml cellesuspension over overfladen af indsatsen 10x, med indsatsen bliver holdt på en svag vinkel, således at cellesuspensionen indsamler i fadet.
- Hvis opsamling af cellerne fra oversiden af indsatsen, tilføje vækstmediet til oversiden og forsigtigt pipetteres af 1 ml cellesuspension over overfladen af indsatsen 10x.
4. Karakterisering af Cell Renhed ved flowcytometri
BEMÆRK: For at karakterisere evnen af permeable mikroporøse membran skær til at opretholde renheden af the to cellepopulationer (dvs. top og bund) i op til 120 timer, §§ 1-3 blev udført, med grønt fluorescerende protein (GFP) -mærket MDA-MB-231-celler, der udpladet på oversiden af indsatsen, og ikke-GFP-mærkede AG1522 celler bliver udpladet på undersiden af 0,4 μm-, 1 μm-, eller 3 um pore skær.
- Når cellerne fra den nederste side af indsatsen blev opsamlet (procedure beskrevet i afsnit 3), pelletere cellesuspensionen ved centrifugering (500 g, 30 sek).
- Fjern supernatanten og suspenderer cellepelleten i 400 pi Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) suppleret med 1% (vol / vol) FBS.
- Udfør cytometrisk analyse på et flowcytometer udstyret med en 488 nm laser til at excitere GFP og et båndpasfilter af 530/30 til påvisning GFP fotonemission 37.
- Til identifikation celle øjemed, anvendelse AG1522 kontrol cellepopulationer at justere frem og side scatter spændinger på flowcytometeret. JustereGFP kanal spænding for at indstille den cellulære autofluorescens værdi som den nedre detektionsgrænse for GFP signal.
- Bestem gating tærskel hjælp kontrol celler. Vurdere renheden af hver celle population baseret på tilstedeværelsen af GFP-positive celler versus kontrol.
BEMÆRK: En ren population ville være reflekterende af ingen GPF-positive celler detekteret.
5. Karakterisering af celler ved in situ Immunofluorescens
- Efter trypsinisering af celler fra indsatsen (se afsnit 3), indsamle cellerne, pladen 5 x 10 4 celler i 250 pi vækstmedium (se trin 1.1) på sterile dækglas, og tillade at vedhæfte i 1 time i en fugtig luftatmosfære af 5% (vol / vol) CO2 ved 37 ° C inkubator.
- Ved slutningen af inkubationen forsigtigt fjerne skål indeholdende dækglasset og placere den i LAF kabinet.
- tilsættes forsigtigt 2 ml forvarmet komplet medium (se trin1.1) til hver skål, således at dækglasset er nedsænket.
- Efter tilsætning vækstmedium til alle retter indeholdende dækglas, returnere retter til en befugtet luft atmosfære af 5% (vol / vol) CO2 ved 37 ° C i en inkubator i 48 timer.
- Efter 48 timers inkubation vaskes prøven 3x med PBS og fastgøres med 4% (vægt / volumen) formaldehyd i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl 5x med Tris saltvand (TBS: 50 mM Tris-CI, pH 7,5, 150 mM NaCl) og derefter permeabilisere med 0,25% (vol / vol) Triton X-100, 0,1% (vægt / volumen) saponin i 5 minutter ved RT.
- Blokere ikke-specifikke bindingssteder med 2% (vol / vol) normalt gedeserum (NGS), 1% (vægt / volumen) bovint serumalbumin (BSA), 0,1% (vol / vol) Triton X-100 i TBS (blokering opløsning) i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber med primært antistof (anti-caveolin 1 (CAV1), 1: 1.000) i blokerende opløsning ved 4 ° C natten over.
- Vaske ubundne primære antistoffer (3x, 5 min / vask) med 0,2% NGS (vol / vol), 1% (vægt / volumen) BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 i TBS (vaskeopløsning).
- Inkuber med sekundært antistof ved stuetemperatur i 1 time i blokerende opløsning (se afsnit 5.4).
- Vask ubundet sekundært antistof (3x, 5 min / vask) med vaskeopløsning (se trin 5.6).
- Mount Dækglas på et objektglas med et anti-fade montering medium, der indeholder 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), og forsegle med neglelak.
- Observere celler under anvendelse af en 63X olie forstørrelse mål på et omvendt mikroskop forsynet med en ekstern lyskilde til fluorescens excitation, og tage billeder vedhæftes digitalkamera til efterfølgende analyse.
6. Karakterisering af celler ved Western blot
BEMÆRK: Western blot procedure er beskrevet andetsteds 38. En kort beskrivelse beskrives her:
- Efter frigørelse af cellerne fra indsatsen ved trypsinisering (se afsnit 3), pelletere cellesuspensionen ved centrifugering (500 g, 30 sek).
- Fjern supernatanten og suspendere cellepelleten 2x med 100 pi PBS.
- Fjern supernatanten og lysere celler i 50 pi modificeret radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer (Tris pH 7,5 50 mM, NaCI 150 mM, NP40 1% (vol / vol), natriumdeoxycholat monohydrat (DOC) 0,5% (vol / vol), natriumdodecylsulfat (SDS) 0,1% (vol / vol)), der indeholder protease og phosphatase inhibitor cocktail.
- Der inkuberes i 20 minutter på is og centrifugeres ved 19.000 g i 15 minutter ved 4 ° C.
- Bestem koncentrationen af proteiner i supernatanten under anvendelse af en protein optisk densitet assay forenelige med detergenter i RIPA-buffer.
- Separate proteiner ved natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) og elektroblot onto et 0,2 um nitrocellulosemembran.
- Inkuber membraner i TBS indeholdende 0,1% (vol / vol) Tween-20 (TBST) og 4% (vægt / volumen) skummetmælk (blokerende opløsning) i 60 minutter og reagere med primært antistof ved 4 ° C natten over (antiCAV1, 1: 1000).
- Vask membran 3 x med TBST ved stuetemperatur (5 min / vask).
- Inkuber membraner i 30 minutter i blokeringsopløsning indeholdende et anti-muse-sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP) (1: 5.000).
- Vask membran 3 x med TBST ved stuetemperatur (5 min / vask).
- Visualisere reaktionsprodukter ved kemiluminescens under anvendelse af en Western blotting detektionssystem.
7. Karakterisering af intercellulær kommunikation ved flowcytometri
BEMÆRK: For at karakterisere tilpasningsevne permeable mikroporøs membran indsætter at undersøge forskellige måder intercellulære kommunikation (f.eks udskilles faktorer, gap junctions). Sektioner 1-2.12 blev udført med ikke-fluorescerende AG1522 celler bliver udpladet på undersiden af 0,4 μm-, 1 μm-, eller 3 um pore skær.
- Kultur ikke-mærket AG1522-celler i en 35 mm skål til 90% sammenflydning under anvendelse medium beskrevet i afsnit 1.1.
- RInse celler 1x med 1 ml HBSS.
- Vejeceller med Calcein AM ved inkubation celler i HBSS indeholdende 30 pM af calcein AM.
- Inkuber i 15 minutter i en fugtig luft atmosfære af 5% (vol / vol) CO2 ved 37 ° C.
- Vask cellerne 2 gange med 1 ml HBSS.
- Trypsinisér celler ved tilsætning af 200 pi opløsning af 0,25% (vol / vol) trypsin med 2,21 mM EDTA i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Stands trypsinaktivitet ved tilsætning 800 pi komplet medium indeholdende 12,5% (vol / vol) FBS.
- Bringe celler i suspension ved gentagen pipettering.
- Bestem cellekoncentration ved anvendelse af et hæmocytometer eller elektronisk tæller og pladen 250.000 celler fyldt med Calcein AM til oversiden af indsatse, der allerede har AG1522 celler, der vokser på undersiden.
- Inkubér indsatserne i en fugtig luft atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C i 6 timer.
- Efter 6 timer, indsamle celler fra undersiden af indsatserne, som beskreveti afsnit 3.
- Pelletere cellesuspensionen ved centrifugering (500 g, 30 sek).
- Fjern supernatanten og suspenderer cellepelleten i 400 pi HBSS suppleret med 1% (vol / vol) FBS.
- Analyser cellerne på en cytometer udstyret med en laser og filter stand til at excitere og detektere emissionen af Calcein (496 nm og 516 nm), ifølge producentens protokol.
- Til identifikation celle formål bruge en uplettet AG1522 kontrolcellepopulationen at justere frem og side scatter spændinger på flowcytometeret. Juster Calcein kanal spænding for at indstille den cellulære autofluorescens værdi som den nedre detektionsgrænse for Calcein signal.
- Bestem den øvre grænse ved hjælp Calcein-loaded kontrol celler. Vurdere kommunikation for hver celle insert baseret på tilstedeværelsen af calcein-positive celler versus kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her tilpasses vi en permeabel mikroporøs membran insert at udvikle et in vitro heterotypisk celle co-kultursystem, som efterligner in vivo tumormikromiljøet (figur 1). Dette system giver mulighed for to forskellige cellepopulationer, der skal dyrkes på hver side af indsatsens porøse membran i længere tid (op til 120 timer, i vores brug). Vigtigere er systemet i stand til at opretholde renheden af cellepopulationerne, som bestemt ved udpladning GFP-mærkede MDA-MB-231-celler på oversiden af 0,4-, 1- eller 3 m-pore skær og lade dem vokse i samdyrkning med AG1522 celler vokser på undersiden af indsatsen, i 120 timer. Efter denne tid blev cellerne opsamlet fra bunden af indlægget og analyseret ved flowcytometri for at identificere tilstedeværelse af eventuelle GFP-positive MDA-MB-231-celler, hvilket indicerer et tab af cellepopulation renhed. Analyse afslørede 99,9% og 99,8% pure befolkninger mod 0,4 og 1 um-pore skær, henholdsvis; imidlertid indsatsen med 3 um porer var ude af stand til at opretholde adskillelsen af cellepopulationer, som porerne var store nok til at tillade et betydeligt antal af de GFP-positive MDA-MB-231-celler til at migrere over membranen (figur 2) .
Vigtigere er det, gennem in situ immunofluorescens og Western blot-analyse var vi i stand til at påvise, at de i dette system til effektivt at generere cancer-associerede fibroblaster fra normale menneskelige diploide AG1522 fibroblaster efter co-kultur med MDA-MB-231 brystkræft celle, bestemt ved reduceret ekspression af caveolin-1, en veletableret CAF biomarkør 39-42 (figur 3). CAV1 er et stillads protein, der danner caveolae i lipidklump domæne af plasmamembranen, som er involveret i flere cellulære processer 43. I Western blotBlev der observeret to distinkte bånd, svarende til a- og p-isoformer af CAV1 44. Desværre, lidt om forskellen (e) mellem isoformer, især deres rolle som CAF biomarkører.
Vi har også vist færdighedsniveauet indsatsen co-dyrkningssystem til at modulere intercellulær kommunikation mellem de to heterotypiske cellepopulationer (figur 4). Ikke-mærket, gap junction kompetente humane diploide fibroblaster AG1522 blev dyrket til konfluens på undersiden af indsatsen. Et andet sæt AG1522-celler blev ladet med Calcein AM, et grønt fluorescerende gap junction permeable farvestof, og udpladet på oversiden af indsatsen. De to cellepopulationer fik lov til at kommunikere i 6 timer, og derefter blev cellerne på undersiden af indsatsen blev isoleret og analyseret ved flowcytometri. Calceinholdige positive celler fra undersiden af indsatsen ville være reflekterende af celler, esleret gap junktion kobling gennem indsatsen porer. Størrelsen på 0,4 um pore indsætte begrænset funktionelle gap junction dannelse mellem celler, der vokser på begge sider af indsatsen, hvilket begrænser kommunikation til udskilte faktorer (fx vækstfaktorer mikrovesikler, etc.). Alternativt størrelse 1 um og 3 um porer er tilsyneladende stort nok til at tillade funktionel kobling af celler gennem gap junctions. Derfor, ved at modulere porestørrelsen, kan man begynde at forstå mange roller (r) at forskellige former for intercellulær kommunikation kan have på TME udvikling og evolution.
Figur 1:. Gennemtrængelige mikroporøs membran Indsæt Model Scheme (a) Tilsyneladende normale humane diploide AG1522 fibroblaster (lav passage celler) bestemt til at blive CAF udsås på omvendtpermeable mikroporøse indsatse består af en 10 um tyk polyester membran med 0,4 um, 1 um, eller 3 um porer. Efter fastgørelse bliver indsatserne vendes om og anbringes i brøndene på plader og dyrket til konfluens. (B) cancerceller og kontrol-fibroblaster dyrkes separat i kolber før de podet på oversiden af indsatsene med fibroblaster vokser intimt på undersiden. (C) Det co-dyrkede celler fodres hver anden dag og opretholdt i den ønskede tid. (D) ved de respektive tidspunkter efter co-kultur og / eller eksperimentelle behandlinger, er CAF (undersiden af indsætter) og / eller cancerceller (oversiden af insertet) grundigt isoleret ved trypsinisering til opnåelse af højrene cellepopulationer, som kan anvendes til analyse af endpoints eller opformeret til efterfølgende undersøgelser. klik herfor at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Frembringelse af højt beriget cellepopulationer repræsentant flowcytometri resultater viser evnen af indsatsen for at opretholde højt beriget og alligevel uafhængige heterotypiske cellepopulationer efter 120 timers co-dyrkning. (A) AG1522 celler høstet fra undersiden af 0,4 um pore insert viser 99,9% af befolkningen at være fri af GFP-mærket MDA-MB-231 celler, der vokser på oversiden af indsatsen (nederste venstre kvadrant). (B) AG1522 celler høstet fra undersiden af 1 um pore insert viser også 99,8% beriget population (nederste venstre kvadrant). (C) AG1522 celler høstet fra undersiden af 3 um pore insert afslører, at kun 68,5% af befolkningen er fri af GFP-mærkede celler (nederste venstre kvadrant), Hvilket indikerer, at et stort antal af GFP-positive MDA-MB-231 celler var i stand til at vandre gennem de 3 um porer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Generation of Cancer-associerede fibroblaster Reduceret udtryk for CAV1 er en konsekvent og pålidelig CAF biomarkør. (A) Mikroskopiske billeder af in situ immunofluorescens (skala bar = 20 um), og (b) Western blot analyse af CAV1 i AG1522 celler, der havde været i co-kultur med AG1522-celler (kontrol) (venstre), eller med MDA- MB-231 brystkræftceller (til højre) for 120 timer. Farvning med Ponceau S Red blev anvendt til lastning kontrol og for at bestemme gange ændring i Western blots. Resultaterne er repræsentative fortre separate eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Modulering af intercellulær kommunikation ved Insert porestørrelse Flowcytometri analyser, der påviser tilpasningsevne den permeable mikroporøse membran insert TME model til at selektere for forskellige former for intercellulær kommunikation mellem Calcein AM loaded AG1522 celler vokser på toppen af indsatsen og AG1522 kontrol celler, der vokser på sin underside. (A) Celler høstet fra undersiden på 0,4 um pore skær viser meget lave niveauer af calcein-positive celler (0,57%), hvilket indikerer begrænset gap junction-kommunikation gennem indsatsen porer. (B) Celler høstet fra undersiden af 1 um pore skær viser higher niveauer af calcein-positive celler (9,98%), hvilket indikerer dannelsen af funktionelle gap junctions. (C) Celler høstet fra undersiden af 3 um pore indsatser viser høje niveauer af calcein-positive celler (87.8%), hvilket indikerer omfattende hul-junktionkommunikation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her er en enkel, smidig in vitro procedure (figur 1), der udnytter en permeabel mikroporøs membran insert for at skabe højt beriget individuelle cellepopulationer fra en co-kultur af heterotypiske celler. Betydeligt, modellen er velegnet til at undersøge forskellige former for intercellulære kommunikation. De kritiske trin omfatter vælge den passende porestørrelse indsats til specifik eksperimentel interesse (s), podning første cellepopulation på undersiden af insertet i medium suppleret med 50% FBS, podning den anden cellepopulation på oversiden af indsætte, og co-dyrkning af to forskellige cellepopulationer i en passende varighed af tid. Vi viser, at dette system er i stand til at efterligne forskellige in vivo egenskaber, hvilket således tilvejebringer en større mulighed for at forstå den molekylære, fænotypiske og latente ændringer forekommer under tidlig TME evolution, som omhandler en væsentlig disadvantage af mange etablerede TME in vitro-modeller (figur 2).
Modellen kan let modificeres til at tillade undersøgelse af forskellige aspekter af celle-celle interaktioner i cancer-stroma udvikling og TME evolution (figur 4). Mens 0,4 um pore insert tillader intim kobling mellem de to cellepopulationer 45, det i høj grad begrænser dannelsen af funktionelle gap junctions mellem celler dyrket på hver side af indsatsen membran (figur 4). Derfor, så lette undersøgelse af den rolle, diffusible faktorer (f.eks vækstfaktorer) og / eller ekstracellulære vesikler (f.eks exosomer), som medierer CAF udvikling 46-48. Alternativt kan 1 um og 3 um porer er store nok til at tillade dannelse af funktionelle gap junctions, hvilket således tillader studiet af både direkte metabolisk kobling via forbindelsesepitoper kanaler og indirekte kommunikation gennemdiffunderbare udskilte faktorer. Men som 3 um pore insert tillader cellemigrering gennem porerne (se figur 2), det vedligeholder ikke renheden af to separate heterotypiske cellepopulationer under længere co-kultur gange (f.eks., 120 timer). Mens den foreliggende model muliggør studiet af flere aspekter af TME, er det begrænset i sin evne til at redegøre for mange af de komplekse fysiologiske samspil, der opstår inden for en in vivo TME (f.eks vaskulære væske udvekslinger, etc.).
Forståelse af de tidlige begivenheder af cancer-stroma aktivering og udviklingen af TME er vigtig til at belyse de trin impliceret i primær tumor initiering og progression, samt metastase. Det er nu almindeligt accepteret, at kræft stroma, især CAF, har en afgørende rolle i at støtte carcinogenese (revideret i 49). Dette har ført til udviklingen af mange in vitro 2D og 3D-modeller, måled ved lysende strategier til at målrette de tidlige mekanismer, der bidrager til stromal-aktivering og tumorprogression. Desværre er mange af disse modeller er begrænset af deres manglende evne til at muliggøre isolering af individuelle cellepopulationer, uden tidskrævende og stressende behandling, til yderligere undersøgelse. Denne protokol tilvejebringer således en væsentlig tilføjelse til området for TME forskning, da det kombinerer in vivo lignende egenskaber med evnen til let og hurtigt opnå særdeles berigede eller rene cellepopulationer til øjeblikkelig analyse eller formering til efterfølgende undersøgelser.
Når teknikken er styr på den, kan indsatsen TME model anvendes til undersøgelse diverse TME tovejs interaktioner (fx kræft til endotel, kræft til immunceller, etc.). Derudover kan kompleksiteten af co-kultur forøges ved at anbringe en blandet cellepopulation på en side af indsatsen og en enkelt population på den alternative side, således opnåing en mere in vivo som TME cellepopulation kompleksitet. Dog bør der udvises forsigtighed ved valg en indsats med den rigtige pore-størrelse, hvis du bruger celler særligt lille diameter (f.eks humane lymfocytter med en diameter på ~ 7 um 50), da de kan være i stand til at migrere gennem de mindre porer ( fx 0,4 um eller 1 um). Forud for co-dyrkning, kan migrationseksperimenter (figur 2) være berettiget at sikre vedligeholdelse af rene cellepopulationer hele udvidede co-kultur eksperimenter.
Denne model er også modtagelig for at undersøge effekten af forskellige terapeutiske udfordringer (f.eks ioniserende stråling, kemoterapeutiske midler, hypertermi) og fysiologiske ændringer (f.eks hypoxi, hyperoxia, biologiske inhibitorer) i blandede cellepopulationer, der er koblet på tværs af permeable mikroporøse membran insert. Modellen har demonstreret sin evne til at generere CAF, identified af en bredt accepteret CAF biomarkør (dvs. nedregulering af CAV1) 39-42 (figur 3), som blev yderligere reduceret med 55% når indsatsen systemet blev holdt ved in vivo ligesom PO 2 (7 mm Hg; 0,5% O 2) 51, fremhæver modellens tilpasningsevne til forskellige eksperimentelle designs og betingelser (data ikke vist). I summen, denne model giver en forenklet tilgang og en mulighed for at modulere tidsmæssige og eksterne faktorer for at opnå dybere indsigt i kræft-stroma aktivering, den tidlige udvikling af TME, og cellulære reaktioner til terapeutiske eller miljømæssige agenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende eller modstridende interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence - 1:2,000 |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
- Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
- Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59 (19), 5002-5011 (1999).
- Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
- Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
- Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
- Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
- Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
- Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
- De Wever, O., Nguyen, Q. -D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
- Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
- Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
- Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
- Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407 (2009).
- Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638 (2013).
- Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
- Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387 (2010).
- Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
- Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540 (2011).
- Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
- Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
- Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
- Ducrest, A. -L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65 (2002).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
- Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
- Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
- Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102 (2013).
- Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
- Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
- Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
- Tyan, S. -W., Kuo, W. -H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313 (2011).
- Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
- Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310 (2013).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
- Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Research. 51 (12), 3316-3322 (1991).
