Abstract
Comprendre les interactions hétérotypiques précoces entre les cellules cancéreuses et le stroma non-cancéreuse environnante est important pour élucider les événements qui ont conduit à l'activation du stroma et l'établissement du microenvironnement de la tumeur (TME). Plusieurs in vitro et dans des modèles in vivo de TME ont été développés; cependant, en général, ces modèles ne permettent pas facilement l'isolement des populations de cellules individuelles, dans des conditions non-perturbation, pour une étude plus approfondie. Pour contourner cette difficulté, nous avons utilisé un modèle in vitro de TME en utilisant un substrat de croissance cellulaire consistant en un insert de membrane microporeuse perméable qui permet la génération simple de populations de cellules hautement enrichis cultivés intimement, mais séparément, de part et d' autre de la membrane de l'insert de coopération élargie -Culture fois. Grâce à l'utilisation de ce modèle, nous sommes capables de générer des fibroblastes associés au cancer grandement enrichi (CAF) populations de fibroblastes humains diploïdes normaux suivanteco-culture (120 h) avec des cellules fortement métastatiques de cancer du sein humain, sans l'utilisation d'un marquage fluorescent et / ou le tri cellulaire. En outre, en modulant la taille des pores de la pièce, on peut contrôler le mode de communication intercellulaire (par exemple, la communication de l' écart-jonction, les facteurs sécrétés) entre les deux populations de cellules hétérotypiques, ce qui permet d' étudier les mécanismes sous - jacents au développement du TME, y compris le rôle de l'écart-perméabilité de la jonction. Ce modèle est un outil précieux pour améliorer notre compréhension des événements initiaux conduisant au cancer-stroma initiation, l'évolution rapide de la TME, et l'effet de modulation du stroma sur les réponses des cellules cancéreuses à des agents thérapeutiques.
Introduction
Le microenvironnement de la tumeur (TME) est un système très complexe composé de cellules de carcinome qui co-exister et d'évoluer aux côtés de stroma hôte. Ce composant de stroma est typiquement constitué de fibroblastes, les myofibroblastes, les cellules endothéliales, les divers composants du système immunitaire, ainsi qu'une matrice extracellulaire 1. Un constituant important, souvent la majorité de ce stroma, sont des fibroblastes activés, souvent appelé fibroblastes associés au cancer ou des fibroblastes de carcinome associées (CAF) 2,3. A la différence, les fibroblastes normaux non activés, CAFs contribuent à l' initiation d' une tumeur, la progression, l' angiogénèse, l' invasion, la métastase et la récurrence 4-11 dans une grande variété de cancers, y compris du sein, de la prostate, du poumon, du pancréas, de la peau, du côlon, de l' œsophage, et ovaire 5,6,12-17. Pourtant, la nature exacte de la contribution de la CAF à travers la pathogenèse du cancer reste mal défini. En outre, la preuve clinique a démontré une valeur pronostique de CAFs, Corréler leur présence à des tumeurs malignes de haut grade, échec thérapeutique, et la mauvaise 10,18,19 globale de pronostic.
De toute évidence, l'amélioration de notre compréhension des événements initiateurs dans le développement de la CAF, ainsi que les communications intercellulaires médiatrices leur rôle au sein de la TME, peuvent fournir de nouvelles cibles thérapeutiques intéressantes et des stratégies améliorées qui pourraient améliorer les résultats des patients. Pour atteindre cet objectif, plusieurs in vivo et in vitro , des modèles ont été développés. Alors que les approches in vivo sont plus représentatives de la TME de patients, ils possèdent des limitations, y compris l'immense complexité et l' hétérogénéité à l'intérieur et entre les tumeurs. En outre, des échantillons de tumeurs provenant de sujets humains représentent souvent très développés TME et ne permettent pas une bonne compréhension des événements initiateurs TME. Des études expérimentales chez l'animal offrent certains avantages, mais la généralisation des données animales aux humains doit être fait avec prudence en raison des différences de phylogie entre les humains et les animaux tels que les rongeurs (par exemple, la chimie thiol 20, le taux métabolique 21, la tolérance au stress 22, etc.). En outre, contrairement à la population humaine, qui est génétiquement hétérogène dans la nature, les animaux de laboratoire sont généralement élevés jusqu'à homogénéité. En outre, il est souvent difficile d'examiner les variations physiologiques transitoires et des modifications du phénotype des cellules, ainsi que pour contrôler les paramètres expérimentaux spécifiques en utilisant des animaux tels que les rongeurs. Ainsi, in vitro 2 et 3 dimensions (2D et 3D) des modèles de culture de tissus sont fréquemment utilisés pour faire avancer la compréhension de base du développement TME. En dépit de leur manque d'une représentation exacte de la complexité des systèmes in vivo, ces modèles offrent des avantages qui facilitent grandement les enquêtes mécanistes. In vitro modèles permettent une analyse plus simplifiée, ciblée et rentable de la TME, de sorte que statistiquement significative les données peuvent être généréescellules libres des variations systémiques qui surviennent chez les animaux.
Il existe plusieurs variétés de systèmes in vitro. Les deux TME modèles les plus couramment utilisés in vitro consistent en monocouche mixte ou des cultures de cellules sphéroïdes. Les deux méthodes de culture sont avantageux pour les études de base des interactions intercellulaires (par exemple, les cellules normales avec des cellules tumorales) et pour l'analyse des divers changements de phénotype cellulaire spécifiques TME (par exemple, l' apparition de fibroblastes associés au cancer de fibroblastes normaux). En outre, les sphéroïdes sont capables de créer une structure de TME tissu ressemblant plus réfléchi, et peuvent être représentatifs de l' hétérogénéité tumorale 23. Cependant sphéroïdes produisent souvent très différents gradients de tension d'oxygène à travers les couches, ce qui peut compliquer les conclusions expérimentales 24. Malheureusement, les deux modèles sont extrêmement limitées dans leur capacité à isoler des populations cellulaires pures pour une caractérisation plus poussée et l'étude suivante coopérationCulture. Pour ce faire, il faudrait au moins un type de cellule à être marqués par fluorescence ou marqué avec un fabricant identifiant, puis en soumettant le mélange co-culture extensive de traitement et de tri cellulaire pour séparer les populations de cellules. Alors un trieur de cellules est capable d'isoler une population de cellules plutôt pure, il faut être conscient du stress cellulaire et la contamination microbienne risques potentiels 25.
Pour faciliter la compréhension de la communication intercellulaire, de grands efforts ont été consacrés au développement et l' optimisation des systèmes in vitro qui imitent étroitement l'environnement in vivo, tout en permettant une approche simplifiée. Un tel outil est l'insert microporeux perméable, un substrat de membrane qui a été développé en 1953 26 et ensuite adapté pour des applications diverses et des études (par exemple, la polarité cellulaire 27, endocytose 28, le transport de la drogue 29, la modélisation des tissus 30, FERTilization 31, effet bystander 32,33, etc.). Ce système permet la croissance des cellules in vivo avec anatomique -like et la différenciation fonctionnelle, ainsi que l' expression d' un grand nombre in vivo , les marqueurs 34,35 qui ne sont pas observées lorsqu'il est cultivé sur plasticware imperméable. En outre, la membrane poreuse extrêmement mince (10 um d' épaisseur) permet la diffusion rapide des molécules et des temps d'équilibrage, qui simule l'environnement in vivo et permet le fonctionnement cellulaire indépendante à la fois les domaines de la cellule apicale et basolatérale. Un avantage supplémentaire de l'utilité de l'insert comme un système TME est la séparation physique des deux populations de cellules cultivées hétérotypiques de part et d'autre de la membrane dans les mêmes conditions environnementales, tout en maintenant les différents modes de communication intercellulaire à travers les pores de la membrane. Bien qu'ils soient séparés physiquement, les deux populations de cellules sont métaboliquement couplés par l'intermédiaire d'éléments sécrétées et, dedécrit ici, aussi, par la voie de l'écart-jonctionnel. En outre, en maintenant les plaquettes in vivo à la pression d'oxygène partielle (PO 2), le modèle réduit les complications des gradients d'oxygène et chimiques observés dans d' autres systèmes. Au contraire, elle augmente la compréhension des mécanismes naturels de contrôle TME. En particulier, les deux populations de cellules peuvent être facilement isolées avec une pureté élevée, sans marquage fluorescent et / ou le tri cellulaire après une longue période de co-culture.
Nous décrivons ici un protocole de TME in vitro comprenant des cellules de carcinome du sein humain et des fibroblastes humains cultivés, respectivement, de part et d' autre d'un insert de membrane microporeuse perméable, mais encore dans une communication bidirectionnelle continue à travers les pores de la membrane. Nous montrons que l'utilisation de membranes avec différentes tailles de pores, la contribution d'un type spécifique de la communication intercellulaire (par exemple, des facteurs sécrétés par rapport à jonctions gap) pour le développementdu TME peut être étudiée.
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Protocol
1. Préparation de milieux de culture et les cellules
- Préparer 500 ml de milieu essentiel minimum d'Eagle additionné de 12,5% (vol / vol) de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 2 mM de L-alanyl-L-glutamine et de 100 unités de pénicilline et 100 ug de streptomycine par ml.
NOTE: Le milieu de croissance et le supplément (s) peut facilement être échangé pour les besoins d'autres souches de cellules ou de lignées cellulaires croissance. - Préparer 70 pi de milieu de culture cellulaire pour chaque pièce d'insertion (6 puits forme insertion): le milieu essentiel minimum d'Eagle additionné de 50% (vol / vol) de 2 mM de L-alanyl-L-glutamine inactivé par la chaleur de FBS, et 100 unités de la pénicilline et 100 ug de streptomycine par ml.
NOTE: Le milieu est supplémenté avec 50% de FBS pour faciliter la fixation des cellules sur le côté inférieur ( à savoir, inférieure) de l'insert. Le milieu de croissance et le supplément (s) peuvent être facilement échangés pour les besoins d'autres souches de cellules ou de lignées cellulaires croissance. - Préparer une suspension cellulaire des cellules destinées à être plaquées sur la face inférieure de l'insert.
REMARQUE: Ici, les résultats ont été obtenus en utilisant AG1522 des fibroblastes humains normaux cultivés dans des flacons de 75 cm2 de culture cellulaire, et ces cellules vont donc être l'objet de la description de la préparation de la suspension cellulaire. - Pour recueillir les cellules, éliminer le milieu de croissance et laver les 2x monocouches de cellules avec 5 ml 1x tampon phosphate salin (PBS).
- Retirer le PBS et s'étendre 1 ml de 0,25% (volume / volume) de trypsine à 2,21 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), préchauffée à la température ambiante (RT) sur les cellules pendant 2 min à TA (température ambiante).
- Étancher l'activité de la trypsine avec 9 ml de milieu de croissance complet (préparé à l'étape 1.1) et recueillir les cellules par pipetage doucement la suspension de cellules sur la surface du flacon 10x.
- Déterminer la concentration des cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur électronique et le volume de la pipette la suspension de cellules qui Provid'Aire 250.000 cellules par insert dans un tube de 15 ml de centrifugeuse stérile.
- Sédimenter la suspension cellulaire par centrifugation (800 x g, 2 minutes). Suspendre le culot cellulaire avec un milieu de croissance (préparé à l'étape 1.2) pour créer une concentration de 250.000 cellules par 70 ul.
REMARQUE: la culture de cellules dans des inserts perméables de la membrane microporeuse est basée sur des substrats 2D, l'ensemencement des cellules est effectuée de manière similaire, excepté les cellules doivent d'abord être mises en suspension dans un milieu contenant 50% (volume / volume) de FBS pour faciliter la fixation.
2. Préparation des inserts
NOTE: Afin d'assurer des conditions stériles, le travail dans une enceinte de sécurité biologique à flux laminaire dédié à la culture cellulaire.
- Sélectionnez inserts avec une taille de pores de la membrane de 0,4 pm, 1 pm, ou 3 pm (déterminé par l'intérêt (s) expérimentale, comme la taille des pores peuvent être utilisés pour explorer le rôle des différents modes de communication intercellulaire).
NOTE: Le 0,4 um pore est small suffit pour limiter la formation des jonctions communicantes entre les cellules fonctionnelles de part et d'autre de la membrane d'insert et peut être utilisée pour étudier la communication intercellulaire par des facteurs sécrétés. Considérant que, les 1 pm et 3 pm pores sont suffisamment grands pour permettre la formation de jonctions lacunaires fonctionnelles et peuvent être utilisés pour étudier la communication intercellulaire par les deux jonctions lacunaires et les facteurs sécrétés. - Retirer les inserts individuels de l'emballage et la placer dans un plat multi-puits de taille égale.
NOTE: Les inserts sont disponibles avec différentes zones de surface de la membrane pour répondre aux besoins spécifiques de l' application (par exemple, 6 puits, inserts 12 puits et 24 puits.). Ici, les résultats ont été obtenus en utilisant l'insert de 6 puits, et seront donc l'objet de la description du modèle. - Couvrir le plat contenant les inserts avec le couvercle plat. Tenir le plat multi-puits avec les deux mains, retourner doucement le plat de telle sorte que les fonds d'insertion (c. - dessous) sont maintenant tournés vers le haut.
- Retirer ee fond de la boîte à puits multiples, exposant ainsi la face inférieure des inserts. Travailler avec un insert à la fois, utiliser une paire de pinces stériles et tenir doucement l'insert en place. Avec la main libre, utiliser une pipette avec une pointe à large ouverture pour attirer 70 ul de la suspension cellulaire (préparé dans les étapes 1,3-1,8), contenant 250.000 cellules.
- Pour plaquer les cellules, placez la pointe de la pipette doucement sur le centre de la membrane de l'insert, et pipette lentement les 70 pi de suspension cellulaire tout en se déplaçant lentement la pointe de la pipette autour de la surface de la membrane. Veillez à ne pas étendre la pointe de la pipette et la suspension cellulaire au bord de l'insert.
REMARQUE: toucher le bord de l'insert pourrait entraîner une perte de tension capillaire de la suspension cellulaire conduisant à des cellules de séchage pendant la fixation. - Répétez l'opération pour inserts restants, avec soin exercé de ne pas travailler directement sur les inserts exposés pour éviter toute contamination microbienne.
- revenir doucement le multi-puitsfond plat pour couvrir les inserts. Garder le plat avec inserts inversé, incuber dans une atmosphère d'air humidifié de 5% (volume / volume) de CO 2 à 37 ° C pendant 30-45 min.
NOTE: Si la suspension de cellules sur les contacts d'insertion Le fond du puits, soulevez soigneusement le fond plat et reposer sur le bord de la partie supérieure de plat, de sorte qu'il forme un léger angle et crée une plus grande séparation entre la surface du plat et la face inférieure des inserts (où les cellules sont ensemencées). Cela va empêcher les cellules de se fixer à la surface des puits à la place de l'insert. - Après le temps d'incubation de 30-45 min, retirez délicatement le plat contenant les inserts et le placer dans l'enceinte de sécurité biologique à flux laminaire.
- Avec les deux mains et en gardant le couvercle plat serré, légèrement ré-inverser le plat de telle sorte que la face inférieure des inserts contenant les cellules attachées maintenant vers le bas.
- Lentement et soigneusement ajouter 2 ml (1 ml pour 3 um pore inserts pour éviter migratisur des cellules à travers les pores d'insertion) de milieu complet préchauffé (voir étape 1.1) à chaque puits, de sorte que le fond de l'insert est immergé.
- Après avoir ajouté un milieu de croissance dans tous les puits contenant des inserts, placez le plat de nouveau dans l'incubateur humidifié.
- Laisser les inserts de rester intact dans l'incubateur pendant 48 heures. Au bout de 48 h, alimenter les cellules en aspirant les 2 ml de milieu à partir du fond du puits et en ajoutant 2 ml de milieu de croissance frais.
- Après avoir ajouté du milieu frais au fond du puits, semences 1 ml de la seconde suspension de population cellulaire (~ 250.000 cellules / ml) sur la face supérieure de l'insert, qui a déjà la première population de cellules en croissance sur le côté inférieur (pour ceux-ci expériences, AG1522 (contrôle) de cellules ou de cellules cancéreuses (expérimental) sont plaquées sur le dessus des inserts, qui ont déjà cellules AG1522, destiné à devenir CAFs, poussant sur le côté inférieur des plaquettes). Placer le plat de nouveau dans l'incubateur humidifié.
NOTE: Si le travailtion avec des cellules qui ne se conforment pas bien au fond de l'insert, ces cellules peuvent être cultivées en variante sur la face supérieure de l'insert. - Changer le milieu à 24, 72 et 96 heures après l'ensemencement de la seconde population de cellules sur le côté supérieur de la plaquette par aspiration du milieu de la partie supérieure de l'insert et le fond du puits. ajouter doucement 1 ml de milieu frais à la partie supérieure de l'insert et 2 ml au fond du puits. Laisser les deux populations cellulaires restent dans la co-culture de part et d'autre de la membrane microporeuse perméable à l'insert pendant 120 heures.
3. La collecte de cellules à partir d'insertion par trypsinisation
NOTE: En plus de la facilité d'obtention de populations cellulaires enrichies, le modèle de TME d'insertion permet également de traitements expérimentaux similaires (par exemple, l' incubation avec des produits chimiques, l' exposition à des conditions d'oxygène qui sont au- dessus ou au- dessous de l' atmosphère ambiante, un traitement par ionisation, etc.) comme autres in vitro (par exemple, in situ immunodétection, Western Blot in) ou propagées par des expériences ultérieures 36.
- Pour recueillir les cellules, retirez le cache du milieu de croissance et le placer dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm contenant 1 ml de PBS. Laver le fond et les côtés supérieurs des 1x insert avec 1 ml de PBS.
- Retirer le PBS et on ajoute 200 ul de 0,25% (volume / volume) de trypsine avec de l'EDTA 2,21 mM, préchauffée à la température ambiante.
- Si la collecte des cellules cultivées sur le côté inférieur de l'insert, placer la solution de trypsine dans la cuvette de 35 mm et placer délicatement le fond de l'insert dans la solution de trypsine pendant 2 minutes à la température ambiante.
- Si la collecte de la cellules cultivées sur le côté supérieur de l'insert, placer l'insert dans une boîte de 35 mm et d'ajouter la solution de trypsine à la partie supérieure de l'insert et incuber pendant 2 minutes à température ambiante.
- Étancher l'activité de la trypsine par addition de 800 ul de milieu de croissance complet.
- Si la collecte des cellules cultivées sur le fond de l'insert, d'ajouter au milieu de croissance au mm plat 35 et de recueillir les cellules par pipetage de 1 ml de suspension cellulaire sur la surface de l'insert de 10x, à l'insert étant maintenu à une légère l'angle, de telle sorte que la suspension de cellules à recueillir dans le récipient.
- Si la collecte des cellules à partir de la face supérieure de l'insert, d'ajouter au milieu de croissance sur la face supérieure et la pipette doucement les 1 ml de suspension cellulaire sur la surface de l'insert de 10x.
4. Caractérisation des cellules Pureté par cytométrie de flux
NOTE: Pour caractériser la capacité des inserts perméables à membrane microporeuse pour maintenir la pureté de til deux populations cellulaires (ie, haut et bas) pour un maximum de 120 heures, les sections 1-3 ont été réalisées, avec la protéine fluorescente verte (GFP) -tagged MDA-MB-231 cellules étant plaqué sur la face supérieure de l'insert, et AG1522 cellules non étiquetées GFP étant plaquées sur la face inférieure de 0,4 μm- 1 μm- ou 3 um inserts de pores.
- Une fois que les cellules provenant du côté inférieur de l'insert ont été collectés (procédure décrite dans la section 3), un culot de la suspension cellulaire par centrifugation (500 g, 30 s).
- Eliminer le surnageant et mettre en suspension le culot cellulaire dans 400 pi de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) additionnée de 1% (volume / volume) de FBS.
- Effectuer une analyse cytométrique sur un cytomètre de flux équipé d'un laser à 488 nm pour exciter la GFP et un filtre passe - bande de 530/30 à détecter l' émission de photons 37 GFP.
- Pour des fins d'identification de cellule, utiliser des populations de cellules de contrôle AG1522 pour ajuster l'avant et des tensions de dispersion latérale sur la cytométrie de flux. Réglerla tension de la chaîne de GFP pour définir la valeur d'autofluorescence cellulaire comme le seuil de détection plus faible pour le signal de la GFP.
- Déterminer gating seuil en utilisant des cellules de contrôle. Évaluer la pureté de chaque population de cellules basée sur la présence de cellules GFP-positives par rapport au témoin.
NOTE: Une population pure serait le reflet de pas de cellules GPF-positifs détectés.
5. Caractérisation des cellules par In Situ immunofluorescence
- Après trypsinisation des cellules de l'insert (voir la section 3), recueillir des cellules, plaque 5 x 10 4 cellules dans 250 ul de milieu de croissance (voir l' étape 1.1) sur des lamelles de verre stériles, et permettre de fixer pendant 1 h dans une atmosphère d'air humidifiée 5% (volume / volume) de CO 2 à 37 ° C incubateur.
- A la fin de l'incubation, retirez délicatement le plat contenant la lamelle et la placer dans l'enceinte de sécurité biologique à flux laminaire.
- Ajouter avec précaution 2 ml de milieu complet préchauffé (voir étape1.1) à chaque boîte, de sorte que la lamelle couvre-objet est immergé.
- Après avoir ajouté un milieu de croissance pour tous les plats contenant des lamelles, retourner les plats à une atmosphère d'air humidifiée de 5% (volume / volume) de CO 2 à 37 ° C dans un incubateur pendant 48 heures.
- Après l'incubation de 48 heures, laver les échantillons 3x avec PBS et fixer avec 4% (poids / volume) de formaldéhyde dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
- Rinçage 5x avec du tampon Tris Buffered Saline (TBS: 50 mM de Tris-Cl, pH 7,5, NaCl 150 mM), puis perméabiliser avec 0,25% (volume / volume) de Triton X-100, 0,1% (poids / volume) de saponine pendant 5 min à TA.
- Bloquer non spécifique des sites de liaison à 2% (vol / vol) de sérum de chèvre normal (NGS), 1% (poids / volume) de sérum-albumine bovine (BSA), 0,1% (volume / volume) de Triton X-100 dans du TBS (blocage solution) pendant 1 heure à température ambiante.
- Laisser incuber avec l'anticorps primaire (anti-cavéoline 1 (CAV1), 1: 1000) dans une solution de blocage à 4 ° C jusqu'au lendemain.
- Laver les anticorps primaires non liés (3x, 5 min / lavage) avec 0,2% NGS (vol / vol), 1% (poids / volume) de BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 dans du TBS (solution de lavage).
- Incuber avec l'anticorps secondaire à température ambiante pendant 1 h dans une solution de blocage (voir section 5.4).
- Laver l'anticorps secondaire non lié (3x, 5 min / lavage) avec une solution de lavage (voir étape 5.6).
- Mont lamelles de sur une lame avec un milieu de montage anti-fade contenant 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), et sceller avec du vernis à ongles.
- Observer les cellules en utilisant un objectif de grossissement d'huile 63X sur un microscope inversé équipé d'une source de lumière externe pour l'excitation de fluorescence et de capturer des images à l'aide d'un appareil photo numérique associée pour une analyse ultérieure.
6. Caractérisation des cellules par Western Blot
REMARQUE: La procédure de Western blot est décrit ailleurs 38. Un bref aperçu est décrit ici:
- Après le détachement des cellules de l'insert par trypsinisation (voir section 3), sédimenter la suspension cellulaire par centrifugation (500 g, 30 sec).
- Retirer le surnageant et suspendre les 2x à granulés de cellules avec 100 ul de PBS.
- Éliminer les cellules du surnageant et lysent dans 50 pl d'essai de radioimmunoprécipitation modifié (RIPA) tampon (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 à 1% (volume / volume), le désoxycholate de sodium monohydraté (DOC) à 0,5% (volume / volume), dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,1% (volume / volume)) contenant de la protéase et un inhibiteur de la phosphatase cocktail.
- Incuber pendant 20 min sur la glace et centrifuger à 19000 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Déterminer la concentration de protéines dans le surnageant en utilisant un dosage de la densité optique de la protéine, compatible avec les détergents dans le tampon RIPA.
- les protéines séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et de dodécyle de sodium (SDS-PAGE) et électroblot sur une membrane de 0,2 um de nitrocellulose.
- Incuber les membranes dans du TBS contenant 0,1% (vol / vol) de Tween-20 (TBST) et 4% (poids / volume) de lait écrémé (solution de blocage) pendant 60 minutes et réagir avec l'anticorps primaire à 4 ° C pendant une nuit (anti-CAV1, 1: 1000).
- Laver 3x membranaires avec TBST à température ambiante (5 min / lavage).
- Incuber les membranes pendant 30 min dans une solution de blocage contenant un anticorps secondaire anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (1: 5000).
- Laver 3x membranaires avec TBST à température ambiante (5 min / lavage).
- Visualisez les produits de réaction par chimiluminescence en utilisant un système de détection Western blot.
7. Caractérisation de la communication intercellulaire par cytométrie de flux
NOTE: Pour caractériser la capacité d' adaptation de la membrane microporeuse perméable insère pour examiner différents modes de communication intercellulaire (par exemple, des facteurs sécrétés, jonctions gap). 1-2.12 sections ont été réalisées avec des cellules non fluorescentes AG1522 étant plaquées sur la face inférieure de 0,4 μm- 1 μm- ou inserts 3 um pores.
- Culture non-étiquetés cellules AG1522 dans un plat de 35 mm à 90% de confluence en utilisant du milieu décrit dans la section 1.1.
- RInse cellules 1x avec 1 ml de HBSS.
- Les cellules de charge avec calcéine AM par incubation des cellules dans HBSS contenant 30 uM de calcéine AM.
- Incuber pendant 15 min dans une atmosphère d'air humidifiée à 5% (vol / vol) de CO2 à 37 ° C.
- On lave les cellules 2 fois avec 1 ml de HBSS.
- Trypsiniser les cellules en ajoutant une solution de 200 ul de 0,25% (volume / volume) de trypsine avec de l'EDTA 2,21 mM, pendant 2 minutes à la température ambiante.
- Étancher l'activité de la trypsine par addition de 800 ul de milieu complet contenant 12,5% (volume / volume) de FBS.
- Amener les cellules en suspension par pipetage répété.
- Déterminer la concentration des cellules en utilisant un hémocytomètre ou un compteur électronique et la plaque de 250.000 cellules chargées de calcéine AM à la face supérieure d'inserts qui ont déjà AG1522 cellules qui poussent sur le côté inférieur.
- Incuber les inserts dans une atmosphère d'air humidifiée à 5% de CO2 à 37 ° C , pendant 6 heures.
- Après 6 heures, recueillir les cellules à partir de la face inférieure des inserts, tels que décritsdans la section 3.
- Sédimenter la suspension cellulaire par centrifugation (500 g, 30 s).
- Eliminer le surnageant et mettre en suspension le culot cellulaire dans 400 pi de HBSS additionné de 1% (volume / volume) de FBS.
- Analyser les cellules sur un cytomètre équipé d'un laser et le filtre capable d'exciter et détecter l'émission de calcéine (496 nm et 516 nm, respectivement), selon le protocole du fabricant.
- Pour des fins d'identification de cellule, utiliser une population de cellules de contrôle unstained AG1522 pour ajuster l'avant et des tensions de dispersion latérale sur la cytométrie de flux. Régler la tension de canal calcéine pour définir la valeur d'autofluorescence cellulaire comme le seuil de détection plus faible pour le signal calcéine.
- Déterminer la limite supérieure de seuil en utilisant des cellules de contrôle calcéine-chargés. Évaluer la communication pour chaque insertion de cellules basée sur la présence de cellules calcéine positives par rapport au témoin.
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Representative Results
Ici , nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable à mettre au point un système cellulaire hétérotypique co-culture in vitro qui imite le microenvironnement de tumeur in vivo (figure 1). Ce système permet de deux populations de cellules différentes pour être cultivées sur chaque côté de la membrane poreuse de l'insert pendant des périodes de temps prolongées (jusqu'à 120 h, dans l'utilisation). Il est important que le système est capable de maintenir la pureté des populations de cellules, tel que déterminé par étalement MDA MB-231 cellules GFP-étiqueté sur le côté supérieur de 0,4-, 1- ou 3 inserts m-pores et leur permettant de se développer dans co-culture avec des cellules en croissance AG1522 sur la face inférieure de l'insert, pendant 120 heures. Après ce temps, les cellules ont été collectées à partir du côté inférieur de l'insert et analysées par cytométrie de flux pour identifier la présence de cellules MDA-MB-231 cellules GFP-positives, ce qui indiquerait une perte de pureté de la population cellulaire. L'analyse a révélé 99,9% et 99,8% PUre populations de 0,4 et 1 inserts um-pores, respectivement; cependant, l'insert de 3 um pores était incapable de maintenir la séparation des populations cellulaires, comme les pores sont suffisamment grands pour permettre un grand nombre de cellules GFP-positives MDA-MB-231 à migrer à travers la membrane (Figure 2) .
Il est important, par immunofluorescence in situ et de l' analyse par transfert de Western, nous avons été en mesure de démontrer la capacité de ce système afin de générer efficacement des fibroblastes associés au cancer de diploïdes humaines normales de fibroblastes AG1522 Après co-culture avec des cellules MDA-MB-231 cellules de cancer du sein, tel que déterminé par l' expression réduite de Caveolin-1, un bien établie CAF biomarqueur 39-42 (Figure 3). CAV1 est une protéine d'échafaudage qui forme la cavéoles dans le domaine lipidique radeau de la membrane plasmatique, qui est impliqué dans plusieurs processus cellulaires 43. Dans le Western BlotDeux bandes distinctes ont été observées, correspondant aux isoformes a et ß de 44 CAV1. Malheureusement, on sait peu sur la différence (s) entre les isoformes, en particulier leur rôle en tant que biomarqueurs de la CAF.
Nous avons également montré l'aptitude du système de co-culture insert pour moduler la communication intercellulaire entre les deux populations de cellules hétérotypique (Figure 4). Non marquée, l'écart-AG1522 jonction des fibroblastes diploïdes humains compétentes ont été cultivées jusqu'à confluence sur la face inférieure de l'insert. Une deuxième série de cellules AG1522 a été chargé avec calcéine AM, un fluorescent gap-junction colorant perméable vert, et plaqué sur la face supérieure de l'insert. Les deux populations cellulaires ont été autorisés à communiquer pendant 6 heures, puis les cellules sur le côté inférieur de l'insert ont été isolées et analysées par cytométrie en flux. cellules calcéine positives de la partie inférieure de l'insert serait le reflet de cellules qui esbli couplage gap-jonctions à travers les pores d'insertion. La taille des pores de 0,4 um insert fonctionnel formation de jonction lacunaire entre des cellules en croissance limitée de chaque côté de l'insert, ce qui limite ainsi la communication à des facteurs sécrétés (par exemple des facteurs de croissance, des microvésicules, etc.). En variante, la taille de la 1 um et 3 um pores sont apparemment assez grande pour permettre le couplage fonctionnel des cellules à travers des jonctions communicantes. Par conséquent, en modulant la taille des pores, on peut commencer à comprendre le rôle diversifié (s) que les différents modes de communication intercellulaire peuvent avoir sur le développement et l'évolution TME.
Figure 1:. Perméable membrane microporeuse Insert Model Scheme (a) des fibroblastes diploïdes humains normaux Apparemment AG1522 (cellules à faible passage) destinés à devenir CAFs sont ensemencées sur inversédes inserts microporeuses perméables constituées d'une membrane en polyester d'une épaisseur de 10 um à 0,4 um, 1 pm, ou 3 um pores. Après la fixation, les inserts sont inversés et placés dans les puits de plaques et cultivées jusqu'à confluence. (B) les cellules cancéreuses et les fibroblastes témoins sont cultivés séparément dans des flacons avant d'être ensemencé sur le côté supérieur des inserts avec des fibroblastes en croissance intimement sur le côté inférieur. (C) Les cellules co-cultivées sont nourris tous les jours et maintenus pendant la durée souhaitée. (D) aux moments respectifs après co-culture et / ou des traitements expérimentaux, les CAF (côté inférieur des plaquettes) et / ou les cellules cancéreuses (face supérieure de l'insert) sont soigneusement isolés par traitement à la trypsine, ce qui donne des populations de cellules très pures, qui peut être utilisé pour l' analyse des paramètres ou propagée pour des études ultérieures. S'il vous plaît , cliquez icipour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Génération des populations de cellules hautement enrichi flux représentatif cytométrie résultats démontrent la capacité de l'insert pour maintenir hautement enrichi des populations de cellules, encore indépendantes hétérotypiques suivantes 120 heures de co-culture. (A) des cellules AG1522 récoltées à partir du côté inférieur de 0,4 um pores insert montrent 99,9% de la population est exempt de cellules MDA-MB-231 cellules GFP marquées en croissance sur la face supérieure de l'insert (quadrant inférieur gauche). (B) des cellules récoltées à partir AG1522 la face inférieure de la plaquette 1 um pores montrent également population enrichie 99,8% (quadrant inférieur gauche). (C) les cellules récoltées à partir AG1522 du côté inférieur de la plaquette 3 um pores révèlent que seulement 68,5% de la population est exempte de cellules GFP-marqué (quadrant inférieur gauche), Indiquant qu'un grand nombre de cellules GFP-positives MDA-MB-231 ont été en mesure de migrer à travers les 3 um pores. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Génération de fibroblastes associés au cancer expression réduite de CAV1 est un biomarqueur CAF cohérente et fiable. (A) des images microscopiques de immunofluorescence in situ (barre d' échelle = 20 um), et (b) L'analyse par Western blot de CAV1 dans les cellules AG1522 qui avait été en co-culture avec des cellules AG1522 (contrôle) ( à gauche), ou avec MDA des cellules de cancer du sein MB-231 (à droite) pendant 120 h. Coloration avec Ponceau S Rouge a été utilisé pour le contrôle de chargement et de déterminer facteur de changement de Western blots. Les résultats sont représentatifs detrois expériences distinctes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Modulation de intercellulaire Communication Insérer Pore-Taille du flux des analyses cytométrie démontrant l'adaptabilité du modèle perméable TME d'insertion de membrane microporeuse pour sélectionner les différents modes de communication intercellulaire entre calcéine AM chargé cellules AG1522 de plus en plus sur le dessus de l'insert et le contrôle AG1522 les cellules en croissance sur sa face inférieure. (A) Les cellules récoltées à partir de la face inférieure de 0,4 um inserts de pores montrent de très faibles niveaux de cellules calcéine positif (0,57%), ce qui indique la communication gap jonction limitée à travers les pores d'insertion. (B) des cellules récoltées à partir de la face inférieure de 1 um inserts de pores montrent hniveaux de cellules calcéine ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR positif (9,98%), ce qui indique la formation de jonctions lacunaires fonctionnels. (C) Les cellules récoltées à partir de la face inférieure de 3 um inserts de pores montrent des niveaux élevés de cellules calcéine positives (87,8%), ce qui indique une communication étendue de l' écart-jonctionnel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ici est un simple, adaptable au mode opératoire in vitro (figure 1) qui utilise un insert de membrane microporeuse perméable pour générer des populations de cellules individuelles hautement enrichis à partir d' une co-culture de cellules hétérotypiques. De manière significative, le modèle est adapté pour étudier les différents modes de communication intercellulaire. Les étapes critiques comprennent la sélection de l'insert de taille de pore appropriée pour un intérêt expérimental spécifique (s) d'ensemencement de la première population de cellules sur la face inférieure de l'insert dans un milieu supplémenté avec 50% de FBS, l'ensemencement de la seconde population cellulaire sur le côté supérieur de la insérer, et la co-culture des deux populations cellulaires distinctes pendant une durée de temps appropriée. Nous montrons que ce système est capable de mimer diverses caractéristiques in vivo, offrant ainsi une plus grande possibilité de comprendre le moléculaire, phénotypique, et les changements latents survenant au début de l' évolution TME, qui répond à un ré majeurisadvantage de nombreux modèles établis TME in vitro (Figure 2).
Le modèle peut être facilement modifié pour permettre l' examen des divers aspects des interactions cellulaires dans le développement du cancer-stroma et TME évolution (Figure 4). Tandis que les pores 0,4 um insert permet un couplage étroit entre les deux populations de cellules 45, il limite considérablement la formation des jonctions lacunaires fonctionnelles entre les cellules cultivées de part et d' autre de la membrane d'insert (figure 4). Par conséquent, ce qui facilite la recherche du rôle des facteurs diffusibles (par exemple, facteurs de croissance) et / ou des vésicules extracellulaires (par exemple, exosomes), qui interviennent dans le développement CAF 46-48. Alternativement, les 1 pm et 3 pm pores sont suffisamment grands pour permettre la formation de jonctions lacunaires fonctionnels, permettant ainsi l'étude des deux couplage métabolique directe via des canaux de jonction et de la communication indirecte par le biaisLes facteurs diffusibles sécrétées. Cependant, comme le 3 um pore insert permet la migration des cellules à travers les pores (voir la figure 2), il ne conserve pas la pureté de deux populations de cellules hétérotypiques séparées pendant de longues heures de co-culture (par exemple., 120 h). Considérant que le présent modèle permet l'étude de plusieurs aspects de la TME, elle est limitée dans sa capacité à rendre compte de la plupart des interactions physiologiques complexes qui se produisent au sein d' une in vivo TME (par exemple, les échanges fluides vasculaires, etc.).
La compréhension des événements précoces de l'activation cancer du stroma et le développement du TME est important dans l'élucidation des étapes impliquées dans l'initiation primaire et la progression tumorale, ainsi que des métastases. Il est maintenant largement admis que le stroma du cancer, en particulier CAFs, possèdent un rôle essentiel dans le soutien carcinogenèse (revue dans 49). Cela a conduit au développement d' un grand nombre de tests in vitro des modèles 2D et 3D, objectifed des stratégies d'éclairage pour cibler les premiers mécanismes contribuant à stroma-activation et la progression tumorale. Malheureusement, bon nombre de ces modèles sont limités par leur incapacité à permettre l'isolement des populations de cellules individuelles, sans temps et le traitement stressant, pour une étude plus approfondie. Ainsi , ce protocole prévoit un ajout important dans le domaine de la recherche TME, car il combine in vivo des propriétés similaires avec la possibilité d'obtenir facilement et rapidement des populations de cellules hautement enrichis ou purs pour analyse immédiate ou de propagation pour des études ultérieures.
Une fois que la technique est maîtrisée, le modèle de TME d'insertion peut être utilisée pour étudier diverses interactions bidirectionnelles TME (par exemple, le cancer endothéliales, le cancer aux cellules immunitaires, etc.). En outre, la complexité de la co-culture peut être améliorée en plaçant une population mixte de cellules sur un côté de l'insert et une seule population sur le côté alternatif, obtenir ainsiing un plus in vivo comme TME complexité de la population de cellules. Cependant, il faut être prudent dans le choix d' un insert avec le pore de taille appropriée si l'on utilise des cellules de particulier de petit diamètre (par exemple, des lymphocytes humains avec un diamètre de ~ 7 um 50), car ils peuvent être capables de migrer à travers les pores plus petits ( par exemple, 0,4 um ou 1 um). Avant de co-culture, les expériences de migration (figure 2) peuvent être justifiées pour assurer le maintien des populations de cellules pures à travers étendues des expériences de co-culture.
Ce modèle est également prête pour étudier les effets de divers problèmes thérapeutiques (par exemple les rayonnements ionisants, des agents chimiothérapeutiques, l' hyperthermie) et des altérations physiologiques (par exemple, l' hypoxie, l' hyperoxie, des inhibiteurs biologiques) dans des populations de cellules mixtes , qui sont couplées à travers l'insert de membrane microporeuse perméable. Le modèle a démontré sa capacité à générer avec succès CAFs, identified par un biomarqueur largement acceptée CAF (c. -à- régulation à la baisse de CAV1) 39-42 (figure 3), qui a ensuite été réduite de 55% lorsque le système d'insertion a été maintenu à in vivo comme PO 2 (7 mm de mercure; 0,5% O 2) 51, mettant en évidence la capacité d'adaptation du modèle pour différents modèles expérimentaux et les conditions (données non présentées). En somme, ce modèle fournit une approche simplifiée et la possibilité de moduler les facteurs temporels et externes afin d'obtenir une compréhension plus profonde dans l'activation cancer stroma, l'évolution rapide de la TME, et les réponses cellulaires à des agents thérapeutiques ou environnementaux.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts ou contradictoires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence - 1:2,000 |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
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