Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54429
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiology, New Jersey Medical School, Rutgers University

Abstract

הבנת יחסי גומלין heterotypic מוקדם בין תאים סרטניים ואת stroma שאינו סרטני שמסביב חשובה הבהיר את האירועים שהובילו הפעלת סטרומה והקמת microenvironment הגידול (TME). כמה במבחנה במודלים vivo של TME פותחו; עם זאת, באופן כללי מודלים אלה אינם מאפשרים בידוד בקלות של אוכלוסיות תאים בודדות, בתנאים שאינם מביך, למחקר נוסף. כדי לעקוף את הקושי הזה, יש לנו עבד מודל TME במבחנה באמצעות מצע צמיחת תאים מורכבים להכניס קרום microporous חדיר המאפשר דור פשוט של אוכלוסיות תאים מועשרות גדל באופן אינטימי, עדיין בנפרד, משני צדי הממברנה של הכנס על שיתוף המורחבת פעמים -culture. באמצעות שימוש במודל זה, אנו מסוגלים לייצר פיברובלסטים סרטן קשור מועשרים מאוד (CAF) אוכלוסיות פיברובלסטים אדם דיפלואידי נורמלים הבאותשיתוף תרבות (120 שעות) עם תאי סרטן שד אנושיים גרורתי מאוד, ללא שימוש תיוג ניאון ו / או מיון התא. בנוסף, על ידי הוויסות הנקבובית בגודל של הכנס, אנחנו יכולים לשלוט על המצב של תקשורת בין תאית (למשל, תקשורת צומת-פער, גורמים מופרשים) בין שתי אוכלוסיות תאי heterotypic, המתיר חקירת המנגנונים העומדים בבסיס הפיתוח של TME, כולל התפקיד של חדירות צומת-הפער. מודל זה משמש כלי רב ערך לשיפור הבנתנו את האירועים הראשוניים שהובילו ייזום הסרטן-stroma, תחילת האבולוציה של TME, ואת אפקט הכיוונון של stroma על התגובות של תאים סרטניים לסוכנים טיפוליים.

Introduction

במיקרו-סביבה של הגידול (TME) הוא מערכת מורכבת מאוד מורכבת תאי קרצינומה כי להתקיים ולהתפתח לצד stroma המארח. רכיב סטרומה זה בדרך כלל מורכב פיברובלסטים, myofibroblasts, לתאי אנדותל, רכיבי חיסון שונים, כמו גם תאי מטריקס 1. מרכיב משמעותי, לעתים קרובות רוב stroma זה, הם פיברובלסטים מופעלים, מכונים לעתים קרובות כמו פיברובלסטים סרטן קשור או פיברובלסטים הקשורים קרצינומה (CAF) 2,3. בניגוד נורמלי, פיברובלסטים שאינם מופעל, cafs לתרום התחלה של גידול, התקדמות, אנגיוגנזה, פלישה, גרורות, והישנות 4-11 במגוון רחב של גידולים סרטניים, כולל סרטן שד, ערמונית, ריאות, לבלב, עור, מעי גס, ושט, השחלה 5,6,12-17. עם זאת, על טבעם המדויק של תרומת cafs ברחבי בפתוגנזה הסרטן נשאר מוגדר היטב. יתר על כן, עדות קלינית הוכיחה ערך פרוגנוסטי של cafs, התאמת נוכחותם ממאירות בדרגה גבוהה, כישלון הטיפול, 10,18,19 פרוגנוזה גרועה הכוללת.

ברור, שיפור הבנתנו את האירועים ליזום בפיתוח CAF, כמו גם התקשורת בין התאית בתיווך תפקידם בתוך TME, עשוי לספק מטרות טיפוליות חדשות ומלהיבות ואסטרטגיות משופרות שיכולים לשפר את תוצאות מטופל. כדי להשיג מטרה זו, כמה in vivo ו במודלים חוץ גופית פותחו. בעוד גישות in vivo הן מהורהרות יותר של 'TME החולה, יש להם מגבלות, כולל את המורכבות העצומות ואת ההטרוגניות הן בתוך ובין גידולים. יתר על כן, דגימות גידולים מ בבני אדם לעתים קרובות מאוד מייצגות שפותחו TME ואינן מאפשרות הבנה של האירועים ליזום TME. מחקרים בבעלי חיים ניסוייים מציעים כמה יתרונות, אולם הכללה של נתונים בעלי חיים לבני אדם צריך להיעשות בזהירות בשל הבדלי physiology בין בני אדם ובעלי חיים כמו מכרסמים (למשל, כימיה תיאול 20, קצב חילוף החומרים 21, סובלנות להדגיש 22, וכו '). יתר על כן, בניגוד לאוכלוסיה האנושית, שהיא גנטית הטרוגנית בטבע, בחיות מעבדה בדרך כלל הם התרבו הומוגניות. כמו כן, הוא לעתים קרובות קשה לבחון וריאציות פיסיולוגיות חולפות ושינויי התא פנוטיפ, כמו גם לשלוט על פרמטרים ספציפיים ניסוי באמצעות בעלי חיים כמו מכרסמים. לפיכך, במבחנה 2 ו 3 ממדים (2D and 3D) מודלים בתרבית רקמה מנוצלים לעתים קרובות כדי לקדם את ההבנה הבסיסית של פיתוח TME. למרות חוסר של תיאור מדויק של המורכבות של מערכות in vivo, מודלים אלה מציעים יתרונות המאפשרים חקירות מכניסטית מאוד. חוץ גופית מודלים לאפשר פשוטה יותר, ממוקד, יעיל וחסכוני ניתוח TME, לפיה מובהקות סטטיסטית ניתן להפיק נתוניםתאים ללא וריאציות מערכתיות המתעוררות אצל בעלי חיים.

ישנם כמה סוגים של מערכות במבחנה. שני הנפוץ ביותר TME במבחנה מודלים מורכבים בשכבה מעורבת או בתרביות תאים אליפטית. שתי השיטות התרבות הם יתרון לימודי יסוד של אינטראקציות בין תאית (למשל, תאים נורמליים עם תאים סרטניים) ו לניתוח שינויים פנוטיפ תאים שונים TME ספציפיים (למשל, הופעתה של פיברובלסטים סרטן הקשורים מן fibroblasts נורמלי). בנוסף, spheroids מסוגל ליצור מבנה מרקמה דמוית מהורהר יותר של TME, והוא יכול להיות נציג של ההטרוגניות גידול 23. עם זאת spheroids לעתים קרובות לייצר הדרגתי מתח חמצן מגוון הרחב של נפחים פני שכבות, אשר עלול לסבך מסקנות ניסוי 24. למרבה הצער, שני הדגמים מוגבלים מאוד ביכולתם לבודדת אוכלוסיות תאים טהורות עבור אפיון נוסף והלימוד הבא שיתוףתַרְבּוּת. לשם כך ידרוש לפחות סוג תא אחד להיות fluorescently-tagged או מתויג עם יצרנית זיהוי, ולאחר מכן חשיפת המעורבות ושיתוף תרבות מיון עיבוד התא נרחב להפריד בין אוכלוסיות תאים. בעוד סדרן תא הוא מסוגל לבודד אוכלוסיית תא טהורה למדי, אחד חייב להיות מודע של מתח הסלולר זיהום מיקרוביאלי פוטנציאל סיכוני 25.

כדי להקל על ההבנה של תקשורת בין תאית, מאמצים רבים הוקדשו לקראת פיתוח ואופטימיזציה במערכות חוץ גופית כי מקרוב לחקות את הסביבה vivo, תוך התרת גישה פשוטה. כלי אחד כזה הוא להכניס microporous חדיר, מצע קרום אשר פותחה הראשון בשנת 1953 26 ובהמשך מותאם ליישומים ומחקרים מגוונים (למשל, הקוטביות בתא 27, אנדוציטוזה 28, תחבורה התרופה 29, דוגמנות רקמת 30, FERTilization 31, עובר אורח אפקט 32,33, וכו '). מערכת זו מאפשרת את הצמיחה של תאים עם אנטומיים in vivo-כמו והבחנה פונקציונלית, כמו גם ביטוי של רבי in vivo סמני 34,35 שאינם נצפו כאשר בתרבית על plasticware בלתי חדיר. יתר על כן, הקרום הנקבובי מאוד דק (10 מיקרומטר העבה) מתיר דיפוזיה מהירה של מולקולות ושעות איזון, המדמה את סביבת vivo ומאפשרת תפקוד הסלולר עצמאי בשני תחומי תא apical ו basolateral. יתרון נוסף של השירות של הכנס כמערכת TME הוא ההפרדה הפיסית של שתי אוכלוסיות תאי heterotypic גדלו משני צדי הממברנה באותם תנאים סביבתיים, תוך שמירה על מצבים שונים של תקשורת בין תאית הדרך הנקבובית הממברנה. למרות מופרדים פיסיים, שתי אוכלוסיות התאים הם מצמידים מטבולית באמצעות אלמנטים המופרשים על ידם, כמו דהscribed כאן, גם בערוצים-junctional הפער. בנוסף, על ידי שמירה על ההכנסות ב in vivo מתח חמצן חלקי (PO 2), המודל מפחית את הסיבוכים של הדרגתיים חמצן כימיים שנצפו מערכות אחרות. במקום זאת, היא מגדילה את ההבנה של מנגנונים טבעיים שליטה על TME. יש לציין, כי שתי אוכלוסיות התאים יכולות להיות מבודדות בקלות עם טוהר גבוה, ללא תיוג ניאון ו / או מיון התא הבא פרקי שיתוף התרבות.

כאן אנו מתארים פרוטוקול במבחנת TME מורכב תאים אנושיים שד קרצינומה ו fibroblasts האנושי גדל, בהתאמה, משני הצדים להכניס קרום microporous חדיר, אבל עדיין בתקשורת מתמדת דו-כיוונית הדרך הנקבובית הממברנה. אנו מראים כי באמצעות ממברנות עם גדלים נקבוביים שונים, תרומת סוג מסוים של תקשורת בין תאית (למשל, גורמים המופרשים לעומת צומת פער) לפיתוחיכול להיחקר של TME.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מדיה התרבות תאים

  1. הכן 500 מ"ל של מדיום חיוני מינימום של הנשר בתוספת 12.5% ​​(כרך / כרך) בסרום שור העובר חום מומת (FBS), 2 מ"מ L- alanyl-L- גלוטמין, ו -100 יחידות של פניצילין 100 מיקרוגרם של סטרפטומיצין לכל מיליליטר.
    הערה: מדיום גידול התוספת (ים) ניתן להחליף בקלות לדרישות הצמיחה של זני תאים אחרים או שורות תאים.
  2. כן 70 μl של מדיום תרבית תאים עבור כל כנס (להוסיף פורמט 6-גם): המדיום החיוני המינימום של הנשר בתוספת 50% (כרך / כרך) FBS חום מומת, 2 מ"מ L- alanyl-L- גלוטמין, ו -100 יחידות של פניצילין 100 מיקרוגרם של סטרפטומיצין לכל מיליליטר.
    הערה: המדיום הוא השלים עם 50% FBS כדי להקל תא מצורף אל הצד התחתון (כלומר, התחתון) של הכנס. מדיום צמיחת התוספת (ים) ניתן להחליף בקלות לדרישות הצמיחה של זני תאים אחרים או שורות תאים.
  3. כן השעית תא של התאים עתידים להיות מצופים בצד התחתון של הכנס.
    הערה: כאן, התוצאות התקבלו באמצעות AG1522 פיברובלסטים אדם נורמלי גדל ב -75 ס"מ תא 2 צלוחיות תרבות, ותאים אלה ולכן יהיה מוקד של תיאור של הכנת תרחיף תאים.
  4. כדי לאסוף תאים, להסיר את מדיום הגידול ולשטוף את 2x monolayer תא עם 5 מ"ל 1x בופר פוספט (PBS).
  5. הסר את PBS ולהתפשט 1 מ"ל של 0.25% (כרך / כרך) טריפסין עם 2.21 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), מחומם מראש לטמפרטורת החדר (RT) על התאים למשך 2 דקות ב RT (בטמפרטורת החדר).
  6. להרוות את פעילות טריפסין עם 9 מ"ל של מדיום הגידול להשלים (מוכן בשלב 1.1) ולאסוף התאים על ידי pipetting ההשעיה התא בעדינות על פני השטח של הבקבוק 10x.
  7. קבע את ריכוז התא באמצעות hemocytometer או נגד אלקטרוני פיפטה נפח השעית תא אשר providדואר 250,000 תאים לכל הכנס לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל סטרילי.
  8. גלולת השעית התא על ידי צנטריפוגה (800 XG, 2 דקות). להשעות את התא גלול עם מדיום גידול (מוכן בשלב 1.2) כדי ליצור ריכוז של 250,000 תאים לכל 70 μl.
    הערה: ככל תרבות תאים מוסיף קרום microporous החדיר מבוססת על מצעי 2D, זריעת תאים מתבצעת באופן דומה, למעט התאים צריכים להיות בתחילה מושעה במדיום המכיל 50% (כרך / כרך) FBS כדי להקל מצורף.

2. הכנת ההוספה

הערה: כדי להבטיח בתנאים סטריליים, עבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית זרימה למינרית המוקדש לתרבות התא.

  1. מוסיף בחר עם גודל נקבובי הממברנה של 0.4 מיקרומטר, 1 מיקרומטר, או 3 מיקרומטר (הנקבע על ידי עניין ניסיוני (ים), כמו הגודל הנקבובי ניתן להשתמש כדי לחקור את התפקיד של מצבים שונים של תקשורת בין תאית).
    הערה: 0.4 מיקרומטר הנקבוביות הוא small מספיק כדי להגביל היווצרות של צומת פער תפקודיים בין תאים משני צדי הממברנה להכניס וניתן להשתמש בו כדי ללמוד תקשורת בין תאית על ידי גורמים מופרשים. והואיל, 1 מיקרומטר ו -3 מיקרומטר הנקבוביים הם גדולים מספיק כדי לאפשר היווצרות של צומת פער פונקציונליים יכול לשמש כדי לחקור תקשורת בין תאית על ידי שני צומת פער וגורם מופרשים.
  2. הסר מוסיף בודדים מהאריזה והמקום לתוך צלחת רבה גם שווה בגודלן.
    הערה: הוספת זמינים בעלי שטח פן הממברנה שונה כדי שיתאימו לצרכי יישום ספציפיים (למשל, 6-היטב, 12-היטב, 24 גם מוסיף.). הנה, התוצאות התקבלו באמצעות הוספת 6-היטב, ולכן יהיה המוקד של תיאור המודל.
  3. מכסה את הצלחת, המכיל מחדיר עם מכסת הצלחת. החזקת צלחת רב גם עם שתי הידיים, בעדינות להפוך את המנה כך תחתית להוסיף (כלומר, התחתון) נמצאים כעת כלפי מעלה.
  4. הסר הבתחתית הדואר של המנה רב גם, חושף את הצד התחתון של מוסיף. עבודה עם הכנס אחד בכל פעם, להשתמש זוג סטרילית של מלקחיים בעדינות להחזיק את הכנס במקום. עם היד החופשית, להשתמש פיפטה עם קצה רחב פה לצייר 70 μl של השעית התא (מוכן צעדים 1.3-1.8), המכיל 250,000 תאים.
  5. כדי צלחת התאים, הניחו את קצה פיפטה בעדינות על מרכז הממברנה של הכנס, ולאט לאט פיפטה 70 μl של ההשעיה תא תוך כדי תנועה את קצה פיפטה לאט סביב המשטח של הממברנה. היזהר שלא להאריך את קצה פיפטה השעית תא לקצה של הכנס.
    הערה: נגיעה בקצה הכנס יכולה לגרום לאובדן של מתח נימים של השעית תא מוביל התאים מההתייבשות במהלך התקשרות.
  6. חזור על פעולה עבור מוסיף נותרים, בזהירות מופעלת לא לעבוד ישירות על המחדיר החשוף כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי פוטנציאלי.
  7. בעדינות להחזיר את היטב הרביםבתחתית צלחת לכסות מוסיפה. שמירה על הצלחת עם מוסיף ההפוך, דגירה באווירת אוויר humidified של 5% (כרך / כרך) CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30-45 דקות.
    הערה: אם השעית התא על הקשר הכנס את תחתית הבאר, רמה בזהירות לתחתית הצלחת ולתת לו לנוח על הקצה העליון הצלחת, כך שהוא יוצר זווית קלה ויוצר הפרדה גדולה יותר בין השטח של המנה בצד התחתון של מוסיף (שבו תאים הם זורעים). פעולה זו תמנע את התאים מצירוף אל פני השטח של בארות במקום להכניס את.
  8. בעקבות זמן הדגירה 30-45 דקות, להסיר בעדינות את המנה המכיל את מוסיף ומניחים אותו בתוך ארון בטיחות ביולוגית זרימה למינרית.
  9. עם שתי ידות ושמירה על מכסת הצלחת חזקה, בעדינות מחדש להפוך את הצלחת כזו שהצד התחתון של המוסיף המכיל את התאים המחוברים עכשיו יפנה כלפי מטה.
  10. לאט ובזהירות מוסיפים 2 מ"ל (1 מ"ל עבור 3 מיקרומטר הנקבוביות מוסיף להימנע migratiעל תאי הדרך הנקבוביות הכנס) של מדיום מלא מחומם מראש (ראה שלב 1.1) זה טוב, כך התחתון של הכנס הוא שקועה.
  11. לאחר הוספת מדיום גידול בכל הבארות המכילות מוסיף, במקום צלחת בחזרה לתוך חממת humidified.
  12. אפשר מחדיר להישאר ללא הפרעה בחממה במשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, להאכיל את התאים על ידי aspirating 2 מ"ל של מדיום מתחתית הבאר והוספת 2 מ"ל של מדיום הגידול טריים.
  13. לאחר הוספת בינוני טרי לתחתית הבאר, זרע 1 מ"ל של ההשעיה האוכלוסייה התא השני (~ 250,000 תאים / מ"ל) על הצד העליון של הכנס, אשר כבר כוללת את האוכלוסייה התא הראשון גדל בצד התחתון (עבור אלה ניסויים, AG1522 (שליטה) תאים או סרטן (ניסיוני) תאים מצופים על החלק העליון של הוסיף, אשר כבר יש תאי AG1522, עתידה להיות cafs, גדל בצד התחתון של המוסיף). מניח את הצלחת בחזרה לתוך חממת humidified.
    הערה: אם העבודהing עם תאים שאינם תואמים היטב לתחתית של הכנס, תאים אלה ניתן לגדל לחילופין בצד העליון של הכנס.
  14. שינוי המדיום ב 24, 72, ו -96 שעות לאחר זריעת האוכלוסייה השנייה של תאים בצד העליון של הכנס על ידי aspirating המדיום מלמעלה של הכנס ואת לתחתית הבאר. בעדינות להוסיף 1 מ"ל של מדיום חדש על הצד העליון של הכנס ו -2 מ"ל לתחתית הבאר. אפשר שתי אוכלוסיות התאים להישאר שיתוף תרבות משני צדי הממברנה להכניס microporous החדירה עבור 120 שעות.

3. איסוף תאים הכנס ידי trypsinization

הערה: בנוסף קלויות קבלת אוכלוסיות תאים מועשרים, מודל TME להוסיף גם מאפשרת טיפולים ניסיוניים דומים (למשל, דגירה עם כימיקלים, חשיפה לתנאי חמצן כי הם מעל או מתחת אווירת סביבה, טיפול בקרינה מייננת, וכו ') כמו אחר במבחנה (למשל, בגילוי-חיסוני באתרו, סופג מערבי) או מופץ לניסויים הבאים 36.

  1. כדי לאסוף תאים, להסיר את המכסה מן מדיום הגידול ולמקם אותו לתוך צלחת תרבית תאים 35 מ"מ המכיל 1 מ"ל PBS. שטפו את תחתית ודפנות העליון של 1x הכנס עם 1 מ"ל PBS.
  2. הסר את PBS ולהוסיף 200 μl של 0.25% (כרך / כרך) טריפסין עם 2.21 mM EDTA, מחומם מראש ל RT.
    1. אם איסוף תאים שגודלו על הצד התחתון של הכנס, למקם את פתרון טריפסין לתוך צלחת 35 מ"מ ומניחים בעדינות את החלק התחתון של להכניס לתוך הפתרון טריפסין במשך 2 דקות ב RT.
    2. אם איסוף התאזה גדל בצד העליון של הכנס, למקם את הכנס לתוך צלחת 35 מ"מ ולהוסיף פתרון טריפסין לחלק העליון של כנס דגירה במשך 2 דקות ב RT.
  3. להרוות את פעילות טריפסין על ידי הוספת 800 μl של מדיום הגידול להשלים.
    1. אם איסוף תאים שגודלו על הקרקעית של הכנס, מוסיפים את מדיום הגידול ל -35 המנה מ"מ ולאסוף את התאים על ידי pipetting בעדינות 1 מ"ל של תרחיף תאים על פני השטח של הכנס 10x, עם הוספה מוחזק בכל קלה זווית, כך השעית התא אוספת לתוך הצלחת.
    2. אם איסוף התאים מהצד העליון של הכנס, מוסיפים את מדיום הגידול בצד העליון בעדינות פיפטה 1 מ"ל של תרחיף תאים על פני השטח של הכנס 10x.

אפיון 4. של טוהר התא על ידי זרימת cytometry

הערה: כדי לאפיין את היכולת של מוסיף קרום microporous החדיר כדי לשמור על טוהר tהוא שתי אוכלוסיות תאים (כלומר, עליונות ותחתונות) בהיקף של עד 120 שעות, סעיפי 1-3 בוצעו, עם החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -tagged מד"א- MB-231 תאים להיות מצופים בצד העליון של הכנס, וכן הלא-tagged GFP תאי AG1522 להיות מצופים בצד התחתון של 0.4 μm-, 1 μm-, או 3 מיקרומטר מוסיף נקבובי.

  1. ברגע שהתאים מהצד התחתון של להכניס נאספו (הליך מתואר בסעיף 3), גלולת השעית התא על ידי צנטריפוגה (500 גרם, 30 שניות).
  2. הסר את supernatant להשעות את התא גלולה ב 400 μl של תמיסת מלח מאוזן "הנקס (HBSS) השלימו עם 1% (כרך / כרך) FBS.
  3. ביצוע ניתוח cytometric על תזרים מצויד cytometer עם לייזר 488 ננומטר לרגש GFP ומסנן bandpass של 530/30 כדי לזהות פליטת GFP פוטון 37.
  4. למטרות זיהוי התא, השתמש אוכלוסיות תאים בלתי מבוקרת AG1522 להתאים קדימה ומתחים פיזור צד על cytometer את הזרימה. לְהַתְאִיםהמתח ערוץ GFP כדי לקבוע את הערך autofluorescence הסלולר כמו סף זיהוי נמוך יותר עבור אות ה- GFP.
  5. לקבוע gating סף באמצעות תאי שליטה. הערכה טוהרת של כל אוכלוסיית תאים בהתבסס על נוכחותם של תאי GFP חיובי לעומת שליטה.
    הערה: אוכלוסייה טהורה תהיה רעיונית של לא תאי GPF חיוביים המזוהים.

אפיון 5. של תאים על ידי באתרו Immunofluorescence

  1. בעקבות trypsinization של תאים מן הכנס (ראה סעיף 3), לאסוף תאים, צלחת 5 x 10 4 תאים 250 מדיום הגידול μl (ראה שלב 1.1) על coverslips זכוכית סטרילית, ולאפשר לצרף במשך שעה 1 באווירה אוויר humidified של 5% (כרך / כרך) CO 2 ב 37 ° C חממה.
  2. בסוף הדגירה, בעדינות להסיר את צלחת המכילה את coverslip ולמקם אותו בתוך ארון בטיחות ביולוגית זרימה למינרית.
  3. בזהירות להוסיף 2 מיליליטר של מדיום מלא מחומם מראש (ראה שלב1.1) על כל מנה, כך coverslip הוא שקוע.
  4. לאחר הוספת מדיום גידול לכל במאכלים המכילים coverslips, להחזיר את המנות לאווירת אוויר humidified של 5% (כרך / כרך) CO 2 ב 37 ° C באינקובטור במשך 48 שעות.
  5. לאחר דגירה 48 שעות, לשטוף את 3x המדגם עם PBS ולתקן עם 4% (wt / כרך) הפורמלין PBS במשך 10 דקות ב RT.
  6. לשטוף 5x עם טריס בופר (TBS: 50 מ"מ טריס-Cl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl) ולאחר מכן permeabilize עם 0.25% (כרך / כרך) טריטון X-100, 0.1% (wt / כרך) saponin במשך 5 דקות ב RT.
  7. חסום הלא ספציפית אתרי הקישור עם 2% (כרך / כרך) בסרום עז נורמלי (NGS), 1% (wt / כרך) אלבומין בסרום שור (BSA), 0.1% (כרך / כרך) טריטון X-100 ב TBS (חסימה פתרון) במשך שעה 1 ב RT.
  8. דגירה עם (אנטי-Caveolin 1 (CAV1), 1: 1,000) נוגדן ראשוני חסימת פתרון ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. לשטוף נוגדנים ראשוניים מאוגדים (3x, 5 דקות / לשטוף) עם 0.2% NGS (כרך / כרך), 1% (wt / כרך) BSA, 0.1% (VOl / כרך) טריטון X-100 ב TBS (פתרון לשטוף).
  10. דגירה עם נוגדנים משני ב RT עבור שעה 1 בחסימת פתרון (ראה סעיף 5.4).
  11. לשטוף נוגדנים משני מאוגד (3x, 5 דקות / לשטוף) עם פתרון לשטוף (ראה שלב 5.6).
  12. Coverslips הר בשקופית עם הרכבה בינונית אנטי לדעוך המכיל 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ואת החותם עם לק.
  13. שימו לב תאים באמצעות מטרה גדלה שמן 63X על מיקרוסקופ הפוכה מצויד במקור אור חיצוני עבור עירור קרינה, ו ללכוד תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית מחוברת לניתוח שלאחר מכן.

אפיון 6. של תאים על ידי המערב כתם

הערה: ההליך כתם המערבי מתואר במקומות אחרים 38. בקצרה מתואר כאן:

  1. בעקבות ניתוק של תאים מן הכנס ידי trypsinization (ראה סעיף 3), גלולת השעית התא על ידי צנטריפוגה (500 גרם, 30 שניות).
  2. הסר supernatant להשעות את 2x התא גלולה עם 100 μl PBS.
  3. הסרת תאים supernatant ו lyse ב 50 μl של assay radioimmunoprecipitation שונה (Ripa) חיץ (טריס pH 7.5 50 מ"מ, NaCl 150 מ"מ, NP40 1% (כרך / כרך), monohydrate deoxycholate נתרן (DOC) 0.5% (כרך / כרך), סולפט dodecyl נתרן (SDS) 0.1% (כרך / כרך)), המכיל פרוטאז מעכב phosphatase קוקטייל.
  4. דגירה במשך 20 דקות על קרח צנטריפוגות ב 19,000 גרם במשך 15 דקות ב 4 °.
  5. קביעת ריכוז של חלבונים supernatant באמצעות assay צפיפות חלבון אופטי, עולה בקנה אחד עם דטרגנטים למאגר ריפה.
  6. חלבונים נפרדים על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE) ו electroblot על קרום nitrocellulose 0.2 מיקרומטר.
  7. דגירה ממברנות ב TBS המכיל 0.1% (כרך / כרך) Tween-20 (TBST) ו -4% (wt / כרך) חלב דל שומן (פתרון חסימה) למשך 60 דקות ומגיבים עם נוגדן ראשוני על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (אנטיCAV1, 1: 1,000).
  8. לשטוף 3x הממברנה עם TBST ב RT (5 דקות / לשטוף).
  9. דגירה ממברנות למשך 30 דקות בתמיסה המכילה חוסם נוגדן משני אנטי עכבר מצומדות עם peroxidase חזרת (HRP) (1: 5,000).
  10. לשטוף 3x הממברנה עם TBST ב RT (5 דקות / לשטוף).
  11. דמיינו תוצרי תגובה ידי chemiluminescence באמצעות מערכת זיהוי מערבית סופגת.

.7 אפיון של אינטר תקשורת על ידי cytometry זרימה

הערה: כדי לאפיין את כושר ההסתגלות של קרום microporous החדיר מוסיפה לבחון מצבים שונים של תקשורת בין תאית (למשל, גורמים מופרשים, צומת פער). סעיפים 1-2.12 בוצעו עם תאי AG1522 ללא ניאון להיות מצופים בצד התחתון של 0.4 μm-, 1 μm-, או 3 מוסיף מיקרומטר נקבובי.

  1. תרבות שאינה שכותרתו תאי AG1522 בצלחת 35 מ"מ עד 90% confluency באמצעות מדיום בסעיף 1.1.
  2. Rתאים inse 1X עם 1 מ"ל של HBSS.
  3. תאי עומס עם Calcein PM על ידי דוגרי תאי HBSS המכילים 30 מיקרומטר של Calcein AM.
  4. דגירה במשך 15 דקות באווירת אוויר humidified של 5% (כרך / כרך) CO 2 על 37 מעלות צלזיוס.
  5. לשטוף את התאים 2X עם 1 מ"ל של HBSS.
  6. Trypsinize תאים על ידי הוספת פתרון 200 μl של 0.25% (כרך / כרך) טריפסין עם 2.21 mM EDTA למשך 2 דקות ב RT.
  7. להרוות את פעילות טריפסין על ידי הוספת 800 μl של בינוני מלא המכיל 12.5% ​​(כרך / כרך) FBS.
  8. תביאו תאים לתוך ההשעיה על ידי pipetting חזר.
  9. קביעת ריכוז תא באמצעות hemocytometer או נגד אלקטרוני צלחת 250,000 תאים עמוסים Calcein AM אל הצד העליון של מוסיף כי כבר יש תאי AG1522 גדלו בצד התחתון.
  10. דגירה מוסיפה באווירת אוויר humidified של 5% CO 2 ב 37 ° C במשך 6 שעות.
  11. לאחר 6 שעות, לאסוף תאים מהצד התחתון של מוסיף, כמתוארבסעיף 3.
  12. גלולת השעית התא על ידי צנטריפוגה (500 גרם, 30 שניות).
  13. הסר את supernatant להשעות את התא גלולה ב 400 μl של HBSS בתוספת 1% (כרך / כרך) FBS.
  14. נתח את התאים על cytometer מצויד לייזר ולסנן מסוגל מרגש גילוי פליטת Calcein (496 ננומטר 516 ננומטר, בהתאמה), לכל פרוטוקול היצרן.
  15. למטרות זיהוי תא, השתמש אוכלוסיית תאי שליטה בלא כתם AG1522 להתאים קדימה ומתחי פיזור צד על cytometer את הזרימה. התאם את מתח ערוץ Calcein כדי לקבוע את הערך autofluorescence הסלולר כמו סף זיהוי נמוך יותר עבור האות Calcein.
  16. קבע את מגבלת הסף העליונה באמצעות תאי שליטה טעונות Calcein. להעריך תקשורת לכל להכניס תא המבוססת על נוכחות של תאים Calcein חיובי לעומת שליטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן התאמנו להכניס קרום microporous חדיר לפתח תאים במבחנה heterotypic מערכת שיתוף תרבות המחקה את microenvironment הגידול vivo (איור 1). מערכת זו מאפשרת שתי אוכלוסיות תאים שונות כדי להיות מבוגרות משני הצדים הנקבובי-הקרום של הכנס לפרקי זמן (עד 120 שעות, בשימוש שלנו). חשוב במערכת הוא מסוגלת לשמור על טוהר אוכלוסיות תאים, כפי שנקבע על ידי תאי ציפוי GFP-tagged מד"א- MB-231 בצד העליון של 0.4-, 1-, או 3 מ-נקבובי מוסיף ומאפשר להם לגדול שיתוף תרבות עם תאי AG1522 גדלו בצד התחתון של הכנס, עבור 120 שעות. לאחר פרק זמן זה, התאים נאספו מהצד התחתון של להכניס ונותחו על ידי cytometry הזרימה לזהות נוכחות של כל התאים GFP חיובי מד"א- MB-231, דבר המצביע על הפסד של טוהר האוכלוסייה התא. ניתוח חשף 99.9% ו 99.8% puמחדש אוכלוסיות מ 0.4 ו -1 מיקרומטר נקבוביות מוסיף, בהתאמה; עם זאת, להכניס את עם 3 מיקרומטר נקבוביים היה מסוגל לשמור על הפרדה בין אוכלוסיות תאים, כמו הנקבוביים היו גדולים מספיק כדי לאפשר למספר משמעותי של תאי GFP החיובי מד"א- MB-231 להגר דרך הממברנה (איור 2) .

חשוב לציין, באמצעות ב immunofluorescence באתרו וניתוח כתם המערבי הצלחנו להדגים את היכולת של מערכת זו כדי ליצור ביעילות פיברובלסטים סרטן הקשורים מן דיפלואידי אדם נורמלי פיברובלסטים AG1522 הבאים שיתוף תרבות עם מד"א- MB-231 סרטן השד התא, כפי שנקבע על ידי ביטוי מופחת של Caveolin-1, ומבוסס CAF סמן ביולוגי 39-42 (איור 3). CAV1 הוא חלבון פיגומים המהווה caveolae בתחום שומני הרפסודה של קרום הפלזמה, אשר מעורב בתהליכים תאיים רבים 43. ב הכתם המערבי, שתי להקות שונות נצפו, מתאים isoforms α ו β של CAV1 44. למרבה הצער, מעט מאוד ידוע על ההבדל (ים) בין isoforms, במיוחד תפקידם לשמש כסמנים ביולוגיים CAF.

גם הראינו המיומנות של מערכת שיתוף התרבות הכנס לווסת תקשורת בין תאית בין שתי אוכלוסיות תאי heterotypic (איור 4). ללא שכותרתו, פיברובלסטים AG1522 דיפלואידי אדם מוכשר-צומת הפער היו בתרבית כדי confluency בצד התחתון של הכנס. קבוצה שנייה של תאים AG1522 היו עמוסות AM Calcein, צבע חדיר-צומת הפער ירוק ניאון, מצופה בצד העליון של הכנס. שתי אוכלוסיות התאים הורשו לתקשר במשך 6 שעות, ולאחר מכן את התאים על הצד התחתון של להכניס הבודדים ונותחו על ידי cytometry זרימה. תאי Calcein חיובי מהצד התחתון של הכנס יהיו רעיוניים של תאי established צימוד-junctional הפער דרך נקבוביות הכנס. גודלו של הנקבוביות 0.4 מיקרומטר להכניס היווצרות צומת פער תפקודית מוגבלת בין התאים גדלים משני הצדים של הכנס, ובכך מגביל את תקשורת לגורמים מופרשים (למשל, גורמי גדילה, microvesicles, וכו '). לחלופין, את גודל 1 מיקרומטר ו -3 מיקרומטר הנקבוביות הם כנראה מספיק גדול כדי לאפשר צימוד תפקודי של התאים דרך צמתים הפער. לכן, על ידי ויסות הגודל הנקבובי, אפשר להתחיל להבין את התפקיד המגוון (ים) כי מצבים שונים של תקשורת בין תאית עשויים להיות על פיתוח אבולוצית TME.

איור 1
איור 1:. חדיר Microporous ממברנה הכנס דגם Scheme (א) ככל הנראה פיברובלסטים AG1522 נורמלי אדם דיפלואידי (תאי מעבר נמוך) עתידה להיות cafs הם זורעים על הפוךמוסיף microporous חדיר המורכב קרום פוליאסטר עבה 10 מיקרומטר עם 0.4 מיקרומטר, 1 מיקרומטר, או 3 מיקרומטר נקבוביים. בעקבות עיקול, המחדיר הם הפוכים והניחו לתוך הבארות של צלחות בתרבית כדי confluency. (ב) תאים סרטניים פיברובלסטים מלאים גדלים בנפרד צלוחיות בטרם זורע בצד העליון של מוסיף עם פיברובלסטים גדלו באופן אינטימי בצד התחתון. (ג) תאי השיתוף תרבותי ניזונים פעם בימים ומתוחזק בפעם הרצויה. (ד) בזמנים המתאימים הבאים שיתוף תרבות ו / או טיפולים ניסיוניים, cafs (הצד התחתון של מוסיף) ו / או תאים סרטניים (הצד העליון של הכנס) מבודדים בקפידה על ידי trypsinization, מניב אוכלוסיות תאים טהור מאוד, אשר ניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח של נקודות הקצה או מופצות ללימודי הבאים. אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. דור של אוכלוסיות תאים מועשרות תזרים נציג cytometry תוצאות מראה את היכולת של הכנס לשמור מועשר, עדיין אוכלוסיות תאי heterotypic הבלתי תלויות הבאים 120 HR-תרבות שיתוף. (א) תאים AG1522 שנקטפו מן הצד התחתון של להכניס 0.4 מיקרומטר הנקבוביות להראות 99.9% מכלל האוכלוסייה להיות חופשי של תאים GFP שכותרתו מד"א- MB-231 הגוברת בצד העליון של הכנס (ברבע השמאלי התחתון). (ב) תאי AG1522 שנקטפו מן הצד התחתון של להכניס 1 מיקרומטר הנקבובית גם להראות 99.8% באוכלוסייה מועשרת (ברבע שמאלי תחתון). (ג) תאים AG1522 שנקטפו מן הצד התחתון של להכניס נקבוביות 3 מיקרומטר עולה כי רק 68.5% מהאוכלוסייה היא ללא שכותרתו תאים GFP (ברבע השמאלי התחתון), המציין כי מספר גדול של תאים GFP חיובי מד"א- MB-231 הצליחו להעביר באמצעות 3 מיקרומטר הנקבוביות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. הדור של פיברובלסטים סרטן-Associated התבטאות מופחתת של CAV1 הוא סמן ביולוגי CAF עקבי ואמין. (א) תמונות מיקרוסקופיות של ב immunofluorescence באתרו (בסולם בר = 20 מיקרומטר), ו- (ב) ניתוח כתם המערבי של CAV1 בתאי AG1522 שהיה שיתוף תרבות עם תאי AG1522 (שליטה) (משמאל), או עם MDA- MB-231 סרטן שד תאים (מימין) עבור 120 שעות. צביעה עם Ponceau S האדום שמש טעינה מלאה ולקבוע שינוי של פי כתמים מערביים. התוצאות הן נציגשלושה ניסויים נפרדים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4:. אפנון של אינטר תקשורת ידי כנס נקבובי בגודל Cytometry זרימה ניתוחי הוכיחה את יכולת ההתאמה של מודל קרום כנס TME microporous החדיר כדי לבחור עבור מצבים שונים של תקשורת בין תאית בין Calcein AM טעון תאי AG1522 גוברים על גבי להכניס ובקרת AG1522 תאים גדלו על הצד התחתון שלה. (א) תאים שנקטפו מן הצד התחתון של 0.4 מיקרומטר מוסיף נקבובי להראות רמות נמוכות מאוד של תאי Calcein-החיובי (0.57%), המציין תקשורת-צומת פער מוגבל הדרך הנקבובית הכנס. (ב) תאים שנקטפו מן הצד התחתון של 1 מיקרומטר מוסיף נקבובי להראות hרמות igher של תאי Calcein-החיובי (9.98%), המציין היווצרות של צומת פער פונקציונליים. (ג) תאים שנקטפו מן הצד התחתון של 3 מיקרומטר מוסיף נקבובי להראות רמות גבוהות של תאי Calcein-החיובי (87.8%), המציין תקשורת פער-junctional נרחבת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, להתאמה בהליך במבחנה (איור 1) אשר מנצל להכניס קרום microporous חדיר ליצור אוכלוסיות תאים בודדות מועשר מתוך שיתוף תרבות של תאי heterotypic. באופן משמעותי, המודל מתאים חוקרת מצבים שונים של תקשורת בין תאית. השלבים הקריטיים כוללים בחירת הכנס נקבובי בגודל המתאים עניין ניסוי ספציפי (ים), זריעת אוכלוסיית התא הראשונה בצד התחתון של להכניס במדיום השלים עם 50% FBS, זריעת אוכלוסיית התא השנייה בצד העליון של הכנס, ושיתוף culturing שתי אוכלוסיות התאים הברורות עבור משך הזמן מתאים. אנו מראים כי מערכת זו מסוגלת מחק מאפייני in vivo שונים, ובכך לספק הזדמנות גדולה יותר להבין את פנוטיפי המולקולרית, ושינויים סמויים המתרחשים במהלך האבולוציה מוקדם TME, אשר מטפלת ברת מז'ורisadvantage של דגמים רבים הוקמו TME במבחנה (איור 2).

המודל ניתן לשנות בקלות על מנת לאפשר חקירה של היבטים שונים של אינטראקציות תאים תאים בהתפתחות הסרטן-stroma ואבולוציה TME (איור 4). בעוד הכנס הנקבובי 0.4 מיקרומטר מתיר צימוד אינטימי בין שתי אוכלוסיות תאי 45, זה משמעותי מגביל היווצרות של צומת פער תפקודיים בין התאים שגודלו משני צדי הממברנה להוסיף (איור 4). לכן, ובכך להקל על חקירה של התפקיד של גורמי diffusible (למשל, גורמי גדילה) ו / או שלפוחית ​​תאית (למשל, exosomes), אשר מתווכים CAF פיתוח 46-48. לחלופין, 1 מיקרומטר ו -3 מיקרומטר הנקבוביים הם גדולים מספיק כדי לאפשר היווצרות של צומת פער פונקציונליים, ובכך לאפשר המחקר של שני צימוד מטבולית הישיר דרך ערוצי junctional ותקשורת עקיפה דרךגורמים המופרשים diffusible. עם זאת, כמו להכניס את הנקבוביות 3 מיקרומטר מתיר נדידת תאי הדרך הנקבובית (ראה איור 2), זה לא לשמור על טוהר שתי אוכלוסיות תאי heterotypic נפרדות בזמני שיתוף תרבות מורחבים (למשל., 120 שעות). בעוד המודל הנוכחי מאפשר המחקר של כמה היבטים של TME, היא מוגבלת ביכולתה לתת דין וחשבון על רבים של האינטראקציות הפיזיולוגיות המורכבות המתרחשות בתוך in vivo TME (למשל, חילופי נוזלים בכלי דם, וכו ').

הבנת האירועים הראשונים של הפעלת הסרטן-stroma ופיתוח של TME חשוב הבהיר את הצעדים מעורבים בייזום והתקדמות גידול ראשוני, כמו גם גרורות. עכשיו זה מקובל כי stroma הסרטן, במיוחד cafs, להחזיק תפקיד קריטי בתמיכת הסרטן (הנסקרת ב 49). זה הוביל לפיתוח של רבים במודלי 2D and 3D במבחנה, מטרהאד ב אסטרטגיות ומאיר למקד את המנגנונים מוקדם תורם הפעלה סטרומה התקדמות הגידול. למרבה הצער, רבים של מודלים אלה מוגבלים חוסר יכולתם להתיר בידוד של אוכלוסיות תאים בודדים, ללא זמן רב ועיבוד מלחיץ, למחקר נוסף. לכן פרוטוקול זה מספק תוספת משמעותית בתחום מחקר TME, כפי שהיא משלבת in vivo כמו תכונות עם היכולת בקלות ובמהירות להשיג אוכלוסיות תאים מועשרות או טהורות מאוד לניתוח מיידי או התפשטות ללימודים הבאים.

לאחר הטכניקה שולט, המודל TME הכנס יכול להיות מנוצל על חקירת אינטראקציות TME דו כווני מגוונים (למשל, סרטן אנדותל, סרטן תאי מערכת החיסון, וכו '). בנוסף, את המורכבות של שיתוף התרבות יכולות להיות מוגברות על ידי הצבת אוכלוסיית תאים מעורבת בצד אחד של הכנס ואת מאוכלוסייה אחת בצד החלופי, ובכך להשיגing יותר in vivo כמו מורכבות אוכלוסיית תאי TME. עם זאת, יש להיזהר בבחירת אינסרט עם נקבוביות בגודל הנכון אם באמצעות תאים בעלי קוטר קטן במיוחד (למשל, לימפוציטים אדם בקוטר של ~ 7 מיקרומטר 50), ככל שיהיה מסוגל נודד הדרך הנקבובית הקטנה ( למשל, 0.4 מיקרומטר או 1 מיקרומטר). לפני שיתוף התרבות, ניסויי הגירה (איור 2) עשויים להיות מוצדקים כדי להבטיח תחזוקה של אוכלוסיות תאים טהורות ברחבי ניסויי שיתוף תרבות מורחבות.

מודל זה הוא גם נתונים עבור שבדק את ההשפעה של אתגרים טיפוליים שונים (למשל, קרינה מייננת, כימותרפיות, היפרתרמיה) ושינויים פיסיולוגיים (למשל, היפוקסיה, hyperoxia, מעכבים ביולוגיים) אוכלוסיות תאים מעורבות כי הם מצמידים ברחבי כנס קרום microporous החדיר. המודל הוכיח את יכולתה לייצר cafs בהצלחה, IDEntified ידי ביומרקר CAF מקובל (כלומר, למטה-רגולציה של CAV1) 39-42 (איור 3), אשר הופחת עוד יותר על ידי 55% כאשר המערכת הכנס נשמר in vivo כמו PO 2 (7 מ"מ כספית; 0.5% O 2) 51, המדגיש את ההסתגלות של מודל עיצובי תנאי ניסוי שונים (מידע לא מוצג). לסיכום, מודל זה מספק גישה פשוטה והזדמנות לווסת גורמים זמניים וחיצוניים על מנת לקבל תובנה עמוקות יותר הפעלת הסרטן-stroma, תחילת האבולוציה של TME, ואת תגובות הסלולר סוכנים טיפוליים או סביבתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים או סותרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast Coriell 107661 Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line PerkinElmer 119261 Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line Cell Biolabs AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM) Corning Cellgro 15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Sigma F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Corning Cellgro 25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning Cellgro 30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) Costar 3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) Greiner bio-one 657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) Costar 3452
6-well Culture Plate Greiner Bio-One Cellstar 657160-01
75 cm2 cell culture flask CellStar 658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x Corning Cellgro 21-040-CV without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x Corning Cellgro 25-053-Cl
15 ml Centrifuge Tube CellTreat 229411
35 mm x 10 mm Cell Culture Dish Greiner bio-one 627 160
Name Company Catalog Number Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1 BD Transduction Laboratories 610406 In situ Immunofluorescence - 1:5,000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific A-11029 In situ Immunofluorescence - 1:2,000
Bovine Serum Albumin - Fraction V Rockland BSA-50 Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution ThermoFisher Scientific 28908 Dilute to 4% with 1x PBS
Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) Fisher 12548B
Triton X-100 Sigma T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen S36938
Name Company Catalog Number Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM Molecular Probes C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14025-076
Name Company Catalog Number Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1 BD Transduction Laboratories 610406 Western Blot - 1:1,000
Tween-20 BioRad 170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) BioRad 162-0112
Western Lightning Plus-ECL PerkinElmer NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay BioRad 500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS) BioRad 161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) Sigma D5670
IGEPAL CA-630 (NP40) Sigma I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 BioRad 161-0158

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
  3. Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
  4. Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
  5. Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59 (19), 5002-5011 (1999).
  6. Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  7. Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
  8. Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
  9. Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  10. Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
  11. Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
  12. Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  13. Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  14. Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
  15. De Wever, O., Nguyen, Q. -D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
  16. Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
  17. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
  18. Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
  19. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
  20. Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
  21. Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
  22. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  23. Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
  24. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  25. Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
  26. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
  27. Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407 (2009).
  28. Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
  29. Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638 (2013).
  30. Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
  31. Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387 (2010).
  32. Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
  33. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540 (2011).
  34. Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
  35. Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
  36. Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
  37. Ducrest, A. -L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65 (2002).
  38. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  39. Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
  40. Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
  41. Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
  42. Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102 (2013).
  43. Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
  44. Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
  45. Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
  46. Tyan, S. -W., Kuo, W. -H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313 (2011).
  47. Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
  48. Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310 (2013).
  49. Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
  50. Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
  51. Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Research. 51 (12), 3316-3322 (1991).

Tags

Cancer Research גיליון 115 ביולוגיה סרטן גיליון microenvironment הגידול סרטן-Associated פיברובלסטים אינטר תקשורת גאפ צמתים הפרשת תאיים הכנס קרום חדיר Microporous, היפוקסיה
חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Domogauer, J. D., de Toledo, S. M.,… More

Domogauer, J. D., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication. J. Vis. Exp. (115), e54429, doi:10.3791/54429 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter