Abstract
La comprensione delle prime interazioni eterotipica tra le cellule tumorali e lo stroma non cancerose circostante è importante per chiarire gli eventi che portano all'attivazione stromale e l'istituzione del microambiente tumorale (TME). Diversi in vitro e in vivo della TME sono stati sviluppati; Tuttavia, in generale, questi modelli non facilmente consentono l'isolamento di singole popolazioni cellulari, in condizioni non perturbante, per ulteriori studi. Per aggirare questa difficoltà, abbiamo impiegato un modello TME in vitro utilizzando un substrato di crescita cellulare costituito da un inserto membrana microporosa permeabile che permette semplice generazione di popolazioni cellulari altamente arricchito cresciuto intimamente e separatamente, su entrambi i lati della membrana di inserto per co estesa volte -Culture. Attraverso l'uso di questo modello, siamo in grado di generare notevolmente arricchito fibroblasti cancro-associata (CAF) popolazioni da fibroblasti umani normali diploidi seguenteco-coltura (120 hr) con cellule di carcinoma mammario umano altamente metastatico, senza l'uso di codifica fluorescenti e / o separazione delle cellule. Inoltre, modulando la dimensione dei pori dell'inserto, possiamo controllare il mezzo di comunicazione intercellulare (ad esempio, comunicazione gap-junction, fattori secreti) tra le due popolazioni cellulari eterotipica, che consente studio dei meccanismi alla base dello sviluppo del TME, compreso il ruolo della permeabilità gap-junction. Questo modello serve come un valido strumento per migliorare la nostra comprensione degli eventi iniziali che portano al cancro iniziazione-stroma, la prima evoluzione della TME, e l'effetto modulante dello stroma sulle risposte delle cellule tumorali di agenti terapeutici.
Introduction
Il microambiente tumorale (TME) è un sistema altamente complesso costituito da cellule di carcinoma che coesistono e si evolvono insieme stroma ospite. Questo componente stromale consiste tipicamente di fibroblasti, miofibroblasti, cellule endoteliali, i vari componenti del sistema immunitario, così come una matrice extracellulare 1. Un costituente significativo, spesso la maggior parte di questo stroma, sono fibroblasti attivati, spesso indicato come fibroblasti cancro-associata o fibroblasti carcinoma-associato (CAF) 2,3. A differenza dei normali fibroblasti non attivati, CAF contribuiscono iniziazione tumorale, progressione, angiogenesi, invasione, metastasi e recidive 4-11 in un'ampia varietà di carcinomi, compresi seno, prostata, polmone, pancreas, pelle, colon, esofago, e dell'ovaio 5,6,12-17. Tuttavia, l'esatta natura del contributo della CAF in tutta patogenesi del cancro rimane scarsamente definita. Inoltre, l'evidenza clinica ha dimostrato un valore prognostico della CAF, Correlando la loro presenza a tumori di alto grado, fallimento della terapia, e la scarsa 10,18,19 generale la prognosi.
Chiaramente, migliorando la nostra comprensione degli eventi che iniziano nello sviluppo CAF, così come le comunicazioni intercellulari che mediano il loro ruolo all'interno della TME, può fornire nuove interessanti bersagli terapeutici e strategie avanzate che potrebbero migliorare i risultati del paziente. A tale scopo, diversi in vivo e in vitro sono stati sviluppati. Mentre gli approcci in vivo sono più riflessivo di TME dei pazienti, che possiedono limitazioni, tra cui l'immensa complessità ed eterogeneità sia all'interno che tra i tumori. Inoltre, campioni di tumore da soggetti umani spesso rappresentano molto sviluppati TME e non consentono una comprensione degli eventi che iniziano TME. studi su animali sperimentali offrono alcuni vantaggi, tuttavia generalizzazione dei dati sugli animali agli esseri umani dovrebbe essere fatto con cautela a causa delle differenze nei Physiology tra esseri umani e animali come roditori (ad esempio, la chimica tiolo 20, il tasso metabolico 21, la tolleranza allo stress 22, etc.). Inoltre, a differenza della popolazione umana, che è geneticamente eterogenea in natura, gli animali da laboratorio sono in genere allevati per omogeneità. Inoltre, è spesso difficile esaminare variazioni fisiologiche transitorie e cambiamenti fenotipo delle cellule, nonché per il controllo dei parametri sperimentali specifici utilizzando animali come roditori. Così, in vitro 2 e 3 dimensioni (2D e 3D) modelli di coltura dei tessuti sono spesso utilizzati per far progredire la comprensione di base dello sviluppo TME. Nonostante la loro mancanza di una rappresentazione accurata della complessità dei sistemi in vivo, questi modelli offrono vantaggi che facilitano notevolmente indagini meccanicistici. In vitro modelli consentono un'analisi più semplificata, concentrato e conveniente di TME, per cui statisticamente significativa i dati possono essere generati incellule gratuitamente da variazioni sistemici che sorgono in animali.
Ci sono diverse varietà di sistemi in vitro. I due modelli TME in vitro più comunemente utilizzati sono costituiti da monostrato misto o colture cellulari sferoidali. Entrambi i metodi di coltura sono vantaggiose per studi di base di interazioni intercellulari (ad esempio, le cellule normali con cellule tumorali) e per l'analisi di varie modifiche fenotipo cellulare specifici TME (ad esempio, emergere di fibroblasti cancro-associata di fibroblasti normali). Inoltre, gli sferoidi possono creare una struttura di tessuto simile più riflessivo della TME, e possono essere rappresentativi del tumore eterogeneità 23. Tuttavia sferoidi spesso producono molto diversi gradienti di tensione di ossigeno attraverso i livelli, che possono complicare le conclusioni sperimentali 24. Purtroppo, entrambi i modelli sono estremamente limitati nella loro capacità di isolare le popolazioni di cellule pure per un'ulteriore caratterizzazione e lo studio dopo cooperazionecultura. Per fare questo è necessario almeno un tipo di cellula di essere fluorescente-tag o etichettati con un produttore di identificazione, e quindi sottoponendo il misto di co-coltura di svariati processi di lavorazione e di smistamento delle cellule per separare le popolazioni di cellule. Mentre un cell sorter è in grado di isolare una popolazione di cellule piuttosto pura, si deve essere consapevoli di stress cellulare e potenziale contaminazione microbica rischi 25.
Per facilitare la comprensione della comunicazione intercellulare, grandi sforzi sono stati dedicati allo sviluppo e all'ottimizzazione sistemi in vitro che imitano da vicino l'ambiente in vivo, pur consentendo un approccio semplificato. Uno di questi strumenti è l'inserto microporosa permeabile, un substrato di membrana che è stata sviluppata nel 1953 26 e successivamente adattato per diverse applicazioni e gli studi (per esempio, la polarità delle cellule 27, endocitosi 28, il trasporto di droga 29, la modellazione del tessuto 30, FertSterilizza- 31, effetto astante 32,33, etc.). Questo sistema permette la crescita delle cellule in vivo con -come anatomica e differenziazione funzionale, nonché espressione di molti in vivo marcatori 34,35 che non si osserva quando coltivate su plasticware impermeabile. Inoltre, l'estremamente sottile membrana porosa (10 micron di spessore) consente la rapida diffusione delle molecole e tempi di equilibrazione, che simula l'ambiente in vivo e permette funzionamento cellulare indipendente in entrambi i domini di cellule apicali e basolaterale. Un ulteriore vantaggio di utilità dell'inserto come sistema TME è la separazione fisica dei due popolazioni cellulari eterotipica coltivati su entrambi i lati della membrana nelle stesse condizioni ambientali, mantenendo diverse modalità di comunicazione intercellulare attraverso i pori della membrana. Anche se fisicamente separati, le due popolazioni cellulari sono metabolicamente accoppiati tramite elementi secreti e, come dedescritto qui, anche attraverso i canali gap-giunzionale. Inoltre, mantenendo gli inserti a in vivo tensione parziale dell'ossigeno (PO 2), il modello riduce le complicazioni di ossigeno e chimiche gradienti osservati in altri sistemi. Piuttosto, aumenta la comprensione dei meccanismi naturali che controllano il TME. In particolare, le due popolazioni cellulari possono essere facilmente isolati con elevata purezza, senza codifica fluorescenti e / o separazione delle cellule dopo periodi prolungati di co-coltura.
Qui si descrive un protocollo in vitro TME costituito da cellule di carcinoma mammario umano e fibroblasti umani coltivati rispettivamente, ai due lati di un inserto membrana microporosa permeabile, ma ancora in continua comunicazione bidirezionale attraverso i pori della membrana. Abbiamo dimostrato che utilizzando membrane con differenti dimensioni dei pori, il contributo di un tipo specifico di comunicazione intercellulare (per esempio, fattori secreti contro giunzioni) allo sviluppodella TME può essere indagato.
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Protocol
1. Preparazione della cultura dei media e delle cellule
- Preparare 500 ml di mezzo di Eagle minimo essenziale integrato con 12,5% (vol / vol) siero bovino fetale inattivato al calore (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutammina, e 100 unità di penicillina e 100 pg di streptomicina per ml.
NOTA: Il mezzo di crescita e integrazione (s) può essere facilmente scambiato per le esigenze di crescita di altri ceppi cellulari o linee cellulari. - Preparare 70 ml di terreno di coltura cellulare per ogni inserto (formato 6-ben inserto): mezzo essenziale minimo Eagle integrato con il 50% (vol / vol) inattivato al calore FBS, 2 mM di L-alanil-L-glutammina, e 100 unità di penicillina e 100 pg di streptomicina per ml.
NOTA: Il mezzo è completato con 50% FBS per facilitare l'adesione delle cellule al lato inferiore (cioè, inferiore) dell'inserto. Il mezzo di crescita e integrazione (s) possono essere facilmente scambiate per le esigenze di crescita di altri ceppi cellulari o linee cellulari. - Preparare una sospensione cellulare delle cellule destinate a essere placcato sul lato inferiore dell'inserto.
NOTA: Qui, i risultati sono stati ottenuti utilizzando AG1522 normali fibroblasti umani coltivati in 75 cm 2 fiasche di coltura cellulare, e queste cellule saranno quindi al centro di descrizione della preparazione della sospensione cellulare. - Per raccogliere le cellule, rimuovere il mezzo di crescita e lavare i 2x monostrato cella con 5 ml di 1x tampone fosfato (PBS).
- Rimuovere il PBS e diffondere 1 ml di 0,25% (vol / vol) di tripsina con 2,21 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pre-riscaldato a temperatura ambiente (RT) sulle cellule per 2 min a RT (temperatura ambiente).
- Quench l'attività tripsina con 9 ml di mezzo di crescita completo (preparato al punto 1.1) e raccogliere le cellule pipettando delicatamente la sospensione cellulare sulla superficie del pallone 10x.
- Determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro o contatore elettronico e pipettare il volume sospensione cellulare che provide 250.000 cellule per inserire in una sterile 15 ml provetta da centrifuga.
- Pellet la sospensione cellulare mediante centrifugazione (800 xg, 2 min). Sospendere il pellet di cellule con mezzo di crescita (preparato al punto 1.2) per creare una concentrazione di 250.000 cellule per 70 microlitri.
NOTA: Come coltura cellulare in inserti membrana microporosa permeabile è basato su substrati 2D, semina cella è eseguita in modo simile, eccetto le cellule devono essere inizialmente sospese in terreno contenente 50% (vol / vol) FBS per facilitare il fissaggio.
2. Preparazione di Inserti
NOTA: Per assicurare condizioni di sterilità, il lavoro in una cappa a flusso laminare di sicurezza biologica dedicata alla coltura cellulare.
- Selezionare inserti con una dimensione dei pori di membrana di 0,4 micron, 1 micron o 3 micron (determinata dalla interesse sperimentale (s), come la dimensione dei pori possono essere usati per esplorare il ruolo dei diversi modi di comunicazione intercellulare).
NOTA: Il poro 0,4 micron è Smalabbastanza l di limitare la formazione di giunzioni gap funzionali tra celle su entrambi i lati della membrana inserto e può essere usato per studiare la comunicazione intercellulare da fattori secreti. Considerando che, il 1 micron e 3 micron pori sono abbastanza grandi da permettere la formazione di giunzioni funzionali e possono essere utilizzati per studiare la comunicazione intercellulare da entrambe le giunzioni e fattori secreti. - Rimuovere i singoli inserti dalla confezione e posto in un altrettanto dimensioni multi-ben piatto.
NOTA: Gli inserti sono disponibili con diverse superfici di membrana per soddisfare esigenze applicative specifiche (ad esempio, 6-pozzetti, inserti 12-bene, e 24 pozzetti.). Qui, i risultati sono stati ottenuti utilizzando l'inserto 6-bene, e sarà quindi al centro della descrizione del modello. - Coprire il piatto, contenente gli inserti con il coperchio piatto. Tenendo il piatto multi-bene con entrambe le mani, capovolgere delicatamente il piatto in modo che il fondo di inserimento (cioè inferiore) sono ora rivolti verso l'alto.
- rimuovere °e fondo del piatto multi-bene, esponendo il lato inferiore degli inserti. Lavorare con un inserto alla volta, utilizzare un paio di pinze sterili e tenere delicatamente l'inserto in posizione. Con la mano libera, utilizzare una pipetta con una punta bocca larga per disegnare 70 ml di sospensione cellulare (preparato in passaggi 1,3-1,8), contenente 250.000 cellule.
- Al piatto le celle, inserire la punta della pipetta delicatamente sul centro della membrana di inserimento, e pipetta lentamente 70 ml di sospensione cellulare mentre lentamente spostando la punta della pipetta attorno alla superficie della membrana. Fare attenzione a non estendere la punta della pipetta e sospensione cellulare al bordo dell'inserto.
NOTA: toccando il bordo dell'inserto potrebbe causare la perdita di tensione capillare della sospensione cellulare che porta alle celle di essiccazione durante allegato. - Ripetere per inserti rimanenti, con cura viene esercitato non lavorare direttamente sopra gli inserti esposti per evitare la potenziale contaminazione microbica.
- tornare delicatamente il multi-pozzofondo piatto per coprire gli inserti. Mantenere il piatto con inserti invertita, incubare in atmosfera aria umidificata 5% (vol / vol) di CO 2 a 37 ° C per 30-45 min.
NOTA: Se la sospensione cellulare sui contatti inserto del fondo del pozzo, sollevare con cura il fondo piatto e di riposo sul bordo del piano piatto, in modo da formare un leggero angolo e crea una maggiore distanza tra la superficie del piatto e il lato inferiore degli inserti (dove vengono seminate cellule). Ciò impedirà le cellule di attaccarsi alla superficie dei pozzetti invece dell'inserto. - Dopo il tempo di incubazione 30-45 min, rimuovere delicatamente il piatto contenente gli inserti e posizionarlo nella cappa di sicurezza biologica a flusso laminare.
- Con due mani e mantenendo il coperchio piatto stretto, gentilmente re-invertire il piatto in modo che il lato inferiore degli inserti contenenti le cellule attaccate ora rivolto verso il basso.
- Lentamente e con attenzione aggiungere 2 ml (1 ml per 3 micron pori inserti per evitare migratisu cellule attraverso i pori inserto) di terreno completo pre-riscaldato (vedere fase 1.1) a ciascun pozzetto, in modo che il fondo dell'inserto è immersa.
- Dopo l'aggiunta di terreno di crescita in tutti i pozzetti contenenti inserti, posizionare il piatto di nuovo nel incubatore umidificato.
- Lasciare gli inserti di rimanere indisturbata in incubatrice per 48 ore. Dopo 48 ore, alimentare le cellule aspirando i 2 ml di terreno dal fondo del pozzo e aggiungendo 2 ml di terreno di coltura fresco.
- Dopo aver aggiunto mezzo fresco al fondo del pozzo, sementi 1 ml della seconda sospensione popolazione cellulare (~ 250.000 cellule / ml) sul lato superiore dell'inserto, che ha già la prima popolazione cellulare crescente sul lato inferiore (per queste esperimenti, cellule (controllo) AG1522 o cellule tumorali (sperimentali) sono placcati sulla sommità degli inserti, che hanno già cellule AG1522, destinate a diventare CAF, crescente sul lato inferiore degli inserti). Porre la capsula di nuovo nel incubatore umidificato.
NOTA: Se il lavorore con cellule che non aderiscono bene al fondo dell'inserto, queste cellule possono essere coltivate in alternativa sul lato superiore dell'inserto. - Cambiare il mezzo a 24, 72, e 96 ore dopo la semina della seconda popolazione di cellule sul lato superiore dell'inserto aspirando il mezzo dall'alto dell'inserto e fondo del pozzetto. Delicatamente aggiungere 1 ml di mezzo fresco al lato superiore dell'inserto e 2 ml al fondo del pozzo. Lasciare le due popolazioni cellulari di rimanere in co-coltura su entrambi i lati della membrana microporosa permeabile inserto per 120 ore.
3. Raccolta Cellule da Inserisci per tripsinizzazione
NOTA: Oltre alla facilità di ottenere popolazioni cellulari arricchiti, il modello TME inserto permette anche per trattamenti sperimentali simili (ad esempio, l'incubazione con sostanze chimiche, esposizione a condizioni di ossigeno che sono sopra o sotto atmosfera ambiente, trattamento con radiazioni ionizzanti, ecc) come altri in vitro (ad esempio, in situ immuno-rilevazione, Western blotting) o propagate per le successive 36 esperimenti.
- Per raccogliere le cellule, rimuovere l'inserto del terreno di coltura e metterlo in un piatto di coltura cellulare 35 millimetri contenente 1 ml di PBS. Lavare la parte inferiore e superiore lati dei 1x inserto con 1 ml di PBS.
- Rimuovere il PBS e aggiungere 200 ml di 0,25% (vol / vol) di tripsina con 2.21 mM EDTA, pre-riscaldato a RT.
- Se la raccolta delle cellule cresciute sul lato inferiore dell'inserto, posizionare la soluzione tripsina nella piastra da 35 mm e posizionare delicatamente il fondo dell'inserto nella soluzione tripsina per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Se la raccolta delle cellules cresciuto sul lato superiore dell'inserto, posizionare l'inserto in una piastra da 35 mm e aggiungere la soluzione tripsina all'inizio dell'inserto e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Placare l'attività tripsina con l'aggiunta di 800 ml di terreno di coltura completo.
- Se la raccolta delle cellule cresciute sul fondo dell'inserto, aggiungere il medium di crescita alla piastra da 35 mm e raccogliere le cellule pipettando delicatamente i 1 ml di sospensione cellulare sulla superficie dell'inserto 10x, con l'inserto essendo tenuto leggermente angolo tale che la sospensione cellulare raccoglie nel piatto.
- Se la raccolta delle cellule dal lato superiore dell'inserto, aggiungere il medium di crescita al lato superiore e pipettare delicatamente i 1 ml di sospensione cellulare sulla superficie dell'inserto 10x.
4. Caratterizzazione di cellule purezza, in citometria a flusso
NOTA: per caratterizzare la capacità degli inserti membrana microporosa permeabile per mantenere la purezza del tegli due popolazioni cellulari (cioè, superiore e inferiore) fino a 120 ore, sezioni 1-3 sono state eseguite, con la proteina fluorescente verde (GFP) -tagged MDA-MB-231 cellule essendo placcato sul lato superiore dell'inserto, e cellule AG1522 non GFP-tagged di essere placcato sul lato inferiore del 0,4 μm-, 1 μm-, o 3 micron inserti pori.
- Una volta che le cellule dal lato inferiore dell'inserto stati raccolti (procedura descritta al punto 3), pellet la sospensione cellulare per centrifugazione (500 g, 30 sec).
- Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 400 ml di soluzione salina bilanciata Hanks '(HBSS) supplementato con 1% (vol / vol) FBS.
- Eseguire citometria su un citofluorimetro equipaggiato con un laser 488 nm per eccitare GFP ed un filtro passa-banda di 530/30 per rilevare GFP emissione di fotoni 37.
- Ai fini dell'identificazione delle cellule, usare popolazioni di cellule di controllo AG1522 per regolare l'ora e le tensioni lato scatter sul citofluorimetro. Regolarela tensione del canale GFP per impostare il valore autofluorescenza cellulare come la soglia di sensibilità inferiore per il segnale GFP.
- Determinare gating soglia utilizzando cellule di controllo. Valutare purezza ciascuna popolazione cellulare basato sulla presenza di cellule GFP-positive rispetto controllo.
NOTA: Una popolazione pura sarebbe riflettente di nessuna cellula GPF-positivi rilevati.
5. caratterizzazione di cellule in situ immunofluorescenza
- Dopo tripsinizzazione delle cellule dall'inserto (vedi sezione 3), raccogliere le cellule, piatto 5 x 10 4 cellule in 250 medie microlitri di crescita (vedi punto 1.1) su vetrini sterili, e consentono di allegare per 1 ora in un atmosfera di aria umidificata di 5% (vol / vol) di CO 2 a 37 ° C incubatore.
- Al termine dell'incubazione, rimuovere delicatamente il piatto contenente il coprioggetto e posizionarlo nella cappa di sicurezza biologica a flusso laminare.
- Aggiungere con cautela 2 ml di terreno completo pre-riscaldato (vedere fase1.1) per ogni piatto, in modo che il vetrino è immerso.
- Dopo aver aggiunto terreno di crescita a tutti i piatti contenenti coprioggetto, restituire i piatti in un'atmosfera umidificata di 5% (vol / vol) di CO 2 a 37 ° C in un incubatore per 48 ore.
- Dopo l'incubazione 48 hr, lavare i 3x campione con PBS e fissare con 4% (peso / volume) di formaldeide in PBS per 10 minuti a RT.
- Risciacquare 5x con Tris Buffered Saline (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) e poi permeabilize con 0,25% (vol / vol) Triton X-100, 0,1% (peso / volume) saponina per 5 min a RT.
- Bloccare non specifici siti di legame con 2% (vol / vol) siero normale di capra (NGS), 1% (peso / volume) di albumina di siero bovino (BSA), 0,1% (vol / vol) Triton X-100 in TBS (blocco soluzione) per 1 ora a RT.
- Incubare con l'anticorpo primario (anti-Caveolin 1 (CAV1), 1: 1000) in soluzione bloccante a 4 ° C durante la notte.
- Lavare non legati anticorpi primari (3x, 5 min / lavaggio) con lo 0,2% NGS (vol / vol), 1% (peso / volume) BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 in TBS (soluzione di lavaggio).
- Incubare con anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora a soluzione bloccante (vedi paragrafo 5.4).
- Lavare non legato l'anticorpo secondario (3x, 5 min / lavaggio) con soluzione di lavaggio (vedi punto 5.6).
- Monte coprioggetto su un vetrino con un mezzo di montaggio anti-sbiadimento contenente 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), e sigillare con smalto.
- Osservare cellule utilizzando un obiettivo di ingrandimento olio 63X su un microscopio invertito dotato di una fonte di luce esterna per eccitazione di fluorescenza, e catturare le immagini utilizzando una fotocamera digitale collegata per la successiva analisi.
6. caratterizzazione di cellule di Western Blot
NOTA: La procedura di Western Blot è descritto altrove 38. Un breve profilo è descritto qui:
- Dopo il distacco delle cellule dal inserto da tripsinizzazione (vedi sezione 3), pellet la sospensione cellulare per centrifugazione (500 g, 30 sec).
- Rimuovere il surnatante e sospendere i 2x pellet cellulare con 100 ml di PBS.
- Rimuovere le cellule surnatante e lisare in 50 ml di dosaggio radioimmunoprecipitazione modificato (RIPA) tampone (Tris pH 7.5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 1% (vol / vol), desossicolato sodico monoidrato (DOC) 0,5% (vol / vol), dodecil solfato di sodio (SDS) 0,1% (v / v)), contenenti proteasi e inibitori della fosfatasi cocktail.
- Incubare per 20 min in ghiaccio e centrifugare a 19.000 g per 15 min a 4 ° C.
- Determinare la concentrazione delle proteine nel supernatante utilizzando un saggio densità ottica proteine, compatibili con i detergenti nel buffer RIPA.
- proteine separate mediante elettroforesi gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) e electroblot su una membrana di nitrocellulosa 0,2 micron.
- Incubare membrane in TBS contenente 0,1% (vol / vol) di Tween-20 (TBST) e il 4% (peso / volume) latte scremato (soluzione bloccante) per 60 min e reagire con l'anticorpo primario a 4 ° C per una notte (anti-CAV1, 1: 1.000).
- Lavare 3x membrana con TBST a temperatura ambiente (5 min / lavaggio).
- Incubare le membrane per 30 minuti nel bloccare soluzione contenente un anticorpo secondario anti-topo coniugata con perossidasi di rafano (HRP) (1: 5.000).
- Lavare 3x membrana con TBST a temperatura ambiente (5 min / lavaggio).
- Visualizza prodotti di reazione per chemiluminescenza utilizzando un sistema di rilevamento Western blotting.
7. Caratterizzazione di intercellulare comunicazione mediante citometria di flusso
NOTA: Per caratterizzare l'adattabilità della membrana microporosa permeabile inserti di esaminare diverse modalità di comunicazione intercellulare (ad esempio, i fattori secreti, giunzioni). Sezioni 1-2.12 stati eseguiti con cellule AG1522 non fluorescenti essendo placcato sul lato inferiore del 0,4 μm-, 1 μm-, o 3 inserti micron-pori.
- Cultura non etichettati cellule AG1522 in un piatto 35 millimetri al 90% di confluenza con supporto descritto nel paragrafo 1.1.
- Rcellule INSE 1x con 1 ml di HBSS.
- Le celle di carico con calceina AM incubando le cellule in HBSS contenente 30 micron di calceina AM.
- Incubare per 15 minuti in una atmosfera di aria umidificata al 5% (vol / vol) di CO 2 a 37 ° C.
- Lavare le cellule 2x con 1 ml di HBSS.
- Trypsinize cellule aggiungendo soluzione di 200 ml di 0,25% (vol / vol) di tripsina con 2.21 mM EDTA per 2 min a RT.
- Placare l'attività tripsina con l'aggiunta di 800 ml di terreno completo contenente 12,5% (vol / vol) FBS.
- Portare le cellule in sospensione pipettando ripetutamente.
- Calcolare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro o contatore elettronico e piastra 250.000 cellule caricate con calceina AM al lato superiore di inserti che già hanno cellule AG1522 crescente sul lato inferiore.
- Incubare gli inserti in un'atmosfera aria umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C per 6 ore.
- Dopo 6 ore, raccogliere le cellule dal lato inferiore degli inserti, come descrittonella sezione 3.
- Pellet la sospensione cellulare per centrifugazione (500 g, 30 sec).
- Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 400 ml di HBSS integrato con 1% (vol / vol) FBS.
- Analizzare le cellule su un citometro equipaggiato con un laser e filtrata in grado di eccitare e rilevare le emissioni di calceina (496 nm e 516 nm, rispettivamente), secondo il protocollo del produttore.
- Ai fini dell'identificazione delle cellule, utilizzare una popolazione di cellule di controllo AG1522 senza macchia per regolare l'ora e le tensioni lato scatter sul citofluorimetro. Regolare la tensione del canale Calceina per impostare il valore di autofluorescenza cellulare come la soglia di rilevamento inferiore per il segnale calceina.
- Determinare il limite di soglia superiore utilizzando cellule di controllo Calceina-caricati. Valutare comunicazione per ciascun inserto cella in base alla presenza di cellule calceina-positivi rispetto ai controlli.
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Representative Results
Qui abbiamo adattato un inserto membrana microporosa permeabile per sviluppare un sistema cellulare di co-coltura heterotypic in vitro che simula il microambiente tumorale in vivo (Figura 1). Questo sistema permette due popolazioni cellulari differenti per essere coltivate su entrambi i lati della membrana porosa-dell'inserto per lunghi periodi di tempo (fino a 120 ore, nel nostro uso). È importante sottolineare che il sistema è in grado di mantenere la purezza delle popolazioni cellulari, come determinato da placcatura GFP-tagged MDA-MB-231 cellule della parte superiore del 0.4-, 1-, o 3 inserti m-poro e consentendo loro di crescere in co-coltura con cellule AG1522 crescente sul lato inferiore dell'inserto, per 120 ore. Dopo questo tempo, le cellule sono state raccolte dalla parte inferiore dell'inserto e analizzate mediante citometria di flusso per identificare la presenza di eventuali MDA-MB-231 cellule GFP-positive, che indicherebbe una perdita di purezza popolazione cellulare. L'analisi ha rivelato il 99,9% e il 99,8% di poliuretanore popolazioni da 0,4 e 1 micron inserti-pori, rispettivamente; Tuttavia, l'inserto di 3 micron pori era in grado di mantenere la separazione delle popolazioni cellulari, i pori sono abbastanza grandi da consentire a un numero significativo di MDA-MB-231 cellule GFP-positive migrare attraverso la membrana (Figura 2) .
È importante sottolineare che, attraverso in situ immunofluorescenza e analisi Western Blot siamo stati in grado di dimostrare la capacità di questo sistema per generare in modo efficace i fibroblasti cancro associato dal normale diploide umana AG1522 fibroblasti seguenti co-coltura con MDA-MB-231 delle cellule del cancro al seno, come determinato da ridotta espressione di Caveolina-1, una consolidata CAF biomarker 39-42 (Figura 3). CAV1 è una proteina che forma il ponteggio caveolae nel dominio zattera lipidica della membrana plasmatica, che è coinvolto in molteplici processi cellulari 43. Nella Western blot, Sono stati osservati due bande distinte, corrispondenti ai alfa e beta isoforme di CAV1 44. Purtroppo, poco si sa circa la differenza (s) tra le isoforme, in particolare il loro ruolo di biomarcatori CAF.
Abbiamo anche dimostrato la competenza del sistema di co-coltura inserto di modulare la comunicazione intercellulare tra le due popolazioni cellulari eterotipica (Figura 4). -Etichettato, gap-giunzione competenti diploidi fibroblasti umani AG1522 sono state coltivate a confluenza sul lato inferiore dell'inserto. Una seconda serie di celle AG1522 sono stati caricati con calceina AM, fluorescente gap-junction dye permeabile verde e placcato sul lato superiore dell'inserto. Le due popolazioni di cellule è stato permesso di comunicare per 6 ore, e poi le cellule sul lato inferiore dell'inserto sono state isolate e analizzate mediante citometria di flusso. cellule calceina-positivo dal lato inferiore dell'inserto sarebbero riflettente di cellule che éstablished accoppiamento gap-giunzionale attraverso i pori inserto. La dimensione dei pori 0,4 micron inserire limitata formazione gap junction funzionale tra le cellule crescono su entrambi i lati dell'inserto, limitando così la comunicazione a fattori secreti (per esempio, fattori di crescita, microvescicole, ecc). In alternativa, le dimensioni delle 1 micron e 3 micron pori sono apparentemente abbastanza grandi da consentire l'accoppiamento funzionale delle cellule attraverso giunzioni. Pertanto, modulando la dimensione dei pori, si può cominciare a capire il ruolo diversificato (s) che le diverse modalità di comunicazione intercellulare possono avere sullo sviluppo e l'evoluzione TME.
Figura 1:. Permeabile membrana microporosa Inserire sistema modello di (a) apparentemente normali diploidi fibroblasti umani (cellule AG1522 bassa di passaggio) destinati a diventare CAF vengono seminate su invertitainserti microporose permeabili costituiti da una membrana di poliestere di spessore 10 micron con 0,4 micron, 1 micron, o 3 micron pori. A seguito di attacco, gli inserti sono invertiti e collocati in pozzetti di piastre e colta di confluenza. (B) cellule tumorali e fibroblasti di controllo sono coltivati separatamente in boccette prima di essere seminati sul lato superiore degli inserti con fibroblasti crescita intimamente sul lato inferiore. (C) Le cellule co-coltura sono alimentati a giorni alterni e conservati per il tempo desiderato. (D) Ai rispettivi tempi seguenti co-coltura e / o trattamenti sperimentali, i CAF (lato inferiore degli inserti) e / o cellule tumorali (lato superiore dell'inserto) sono accuratamente isolato mediante tripsinizzazione, cedendo popolazioni cellulari altamente puri, che può essere utilizzato per l'analisi degli endpoint o propagato per gli studi successivi. cliccate quiper visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Generazione di popolazioni di cellule altamente arricchito flusso rappresentante citometria risultati dimostrano la capacità dell'inserto da mantenere altamente arricchito, popolazioni di cellule eterotipica ancora indipendenti seguenti 120 HR co-coltura. (A) cellule AG1522 raccolte dal lato inferiore dell'inserto 0,4 micron pori mostrano 99,9% della popolazione di essere liberi di MDA-MB-231 cellule GFP-etichettata crescente sul lato superiore dell'inserto (quadrante inferiore sinistro). (B) cellule AG1522 raccolte dal lato inferiore del poro dell'inserto 1 micron mostrano anche 99,8% della popolazione arricchita (quadrante inferiore sinistro). (C) le cellule AG1522 raccolte dal lato inferiore del poro dell'inserto 3 micron rivelano che solo il 68,5% della popolazione è privo di cellule GFP-marcato (quadrante inferiore sinistro), Indicando che un gran numero di MDA-MB-231 cellule GFP-positive sono stati in grado di migrare attraverso i 3 micron pori. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Generazione di cancro associata fibroblasti ridotta espressione di CAV1 è un biomarker coerente e affidabile CAF. (A) immagini microscopiche di immunofluorescenza in situ (scala bar = 20 micron), e (b) Analisi Western Blot di CAV1 nelle cellule AG1522 che era stato in co-coltura con cellule AG1522 (controllo) (a sinistra), o con MDA- le cellule del cancro al seno MB-231 (a destra) per 120 ore. Colorazione con Ponceau S Rosso è stato utilizzato per il controllo di carico e di determinare il cambiamento volte in Western blot. I risultati sono rappresentativi ditre esperimenti separati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Modulazione di intercellulare Comunicazione Inserire Pore-Size citometria a flusso analisi che dimostrano l'adattabilità del microporosa modello di TME inserto membrana permeabile di selezionare per le diverse modalità di comunicazione intercellulare tra calceina AM caricato cellule AG1522 crescente sulla parte superiore dell'inserto e controllo AG1522 cellule in crescita sul suo lato inferiore. (A) cellule raccolte dal lato inferiore di 0,4 um inserti porosi mostrano livelli molto bassi di cellule calceina-positive (0,57%), indicando limitato comunicazione gap-junction attraverso i pori inserto. (B) le cellule raccolte dal lato inferiore di 1 um inserti pori mostrano hlivelli igher di cellule calceina-positiva (9.98%), che indica la formazione delle giunzioni gap funzionali. (C) le cellule raccolte dal lato inferiore di 3 micron inserti pori mostrano alti livelli di cellule calceina-positivi (87,8%), indicando un'ampia comunicazione gap-giunzionale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto è un semplice, adattabile a procedura vitro (Figura 1) che utilizza un inserto membrana microporosa permeabile per generare altamente arricchito popolazioni di cellule individuali di una co-coltura di cellule eterotipica. Significativamente, il modello è adatto per studiare vari modi di comunicazione intercellulare. Le fasi critiche comprendono selezionando l'inserto pori di dimensioni appropriate per specifiche interesse sperimentale (s), seminando la prima popolazione di cellule sul lato inferiore dell'inserto in mezzo supplementato con 50% FBS, semina la seconda popolazione cellulare sul lato superiore della inserire e co-coltura due distinte popolazioni cellulari per un periodo di tempo appropriato. Abbiamo dimostrato che questo sistema è in grado di mimare varie caratteristiche in vivo, fornendo così una maggiore opportunità di comprendere le basi molecolari, fenotipiche e cambiamenti latenti che si verificano durante la prima evoluzione TME, che risponde a una grande disadvantage di molti modelli stabiliti TME in vitro (Figura 2).
Il modello può essere facilmente modificato per consentire studio di vari aspetti delle interazioni cellula-cellula nello sviluppo del cancro-stroma e TME evoluzione (Figura 4). Mentre il 0,4 micron pori inserto consente accoppiamento intimo tra le due popolazioni cellulari 45, limita notevolmente la formazione di giunzioni gap funzionali tra cellule cresciute su entrambi i lati della membrana inserto (Figura 4). Pertanto, facilitando così indagine sul ruolo dei fattori diffusibili (per esempio, fattori di crescita) e / o vescicole extracellulari (ad esempio, esosomi), che mediano sviluppo CAF 46-48. In alternativa, i 1 micron e 3 micron pori sono abbastanza grandi da permettere la formazione di giunzioni funzionali, permettendo così lo studio di entrambi accoppiamento metabolico diretto attraverso canali giunzionali e comunicazione indiretta tramiteFattori secreti diffusibili. Tuttavia, come il poro inserto 3 micron consente migrazione cellulare attraverso i pori (vedi figura 2), non mantiene la purezza di due popolazioni cellulari eterotipica separati durante i periodi co-coltura prolungati (ad es., 120 hr). Considerando che il presente modello consente lo studio di vari aspetti della TME, è limitato nella sua capacità di spiegare molte delle complesse interazioni fisiologiche che si verificano all'interno di un in vivo TME (ad esempio, scambi fluidi vascolari, etc.).
La comprensione dei primi eventi di attivazione tumore-stroma e lo sviluppo della TME è importante per chiarire i passaggi implicati nell'iniziazione e progressione tumorale primaria, così come metastasi. E 'ormai ampiamente riconosciuto che lo stroma del cancro, in particolare CAF, possiedono un ruolo fondamentale nel sostenere la carcinogenesi (rivisto nel 49). Questo ha portato allo sviluppo di molti modelli in vitro 2D e 3D, scopoEd a strategie illuminanti per indirizzare i primi meccanismi che contribuiscono alla stromali-attivazione e la progressione del tumore. Sfortunatamente, molti di questi modelli sono limitate dalla loro incapacità di consentire l'isolamento di singole popolazioni cellulari, senza tempo e trasformazione stressante, per ulteriori studi. Così questo protocollo fornisce un significativo Oltre al campo della ricerca TME, in quanto combina in vivo come proprietà con la possibilità di ottenere facilmente e rapidamente popolazioni cellulari altamente arricchito o puri per analisi immediata o propagazione per studi successivi.
Una volta che la tecnica è padroneggiata, il modello TME inserto può essere utilizzato per indagare diversi TME interazioni bidirezionali (ad esempio, il cancro al endoteliali, cancro alle cellule immunitarie, etc.). Inoltre, la complessità della co-coltura può essere aumentata inserendo una popolazione cellulare mista su un lato dell'inserto e una singola popolazione sul lato alternate, ottenendo cosìing un altro in vivo come TME popolazione di cellule complessità. Tuttavia, si deve prestare attenzione nella scelta di un inserto con la corretta dimensione dei pori se utilizzando cellule di specie di piccolo diametro (ad esempio, linfociti umani con un diametro di ~ 7 micron 50), in quanto potrebbero essere in grado di migrare attraverso i pori più piccoli ( ad esempio, 0,4 micron o 1 micron). Prima di co-coltura, esperimenti di migrazione (Figura 2) può essere giustificata per garantire il mantenimento di popolazioni di cellule pure durante esperimenti di co-coltura estese.
Questo modello è anche suscettibile per lo studio degli effetti delle varie sfide terapeutiche (ad esempio, radiazioni ionizzanti, chemioterapici, ipertermia) e alterazioni fisiologiche (ad esempio, ipossia, iperossia, inibitori biologici) in popolazioni di cellule miste che sono accoppiati attraverso l'inserto membrana microporosa permeabile. Il modello ha dimostrato la sua capacità di generare con successo CAF, identified da un biomarker ampiamente accettata CAF (cioè, down-regulation della CAV1) 39-42 (Figura 3), che è stato ulteriormente ridotto del 55% quando il sistema di inserimento è stata mantenuta a in vivo come PO 2 (7 mmHg; 0,5% O 2) 51, evidenziando l'adattabilità del modello per vari disegni e condizioni sperimentali (dati non mostrati). In sintesi, questo modello offre un approccio semplificato e la possibilità di modulare fattori temporali ed esterni al fine di ottenere informazioni più approfondite in attivazione cancro-stroma, la prima evoluzione della TME, e le risposte cellulari agli agenti terapeutici o ambientali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione o in conflitto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence - 1:2,000 |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
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