Abstract
암세포와 주위의 비 - 암성 기질의 초기 이형 작용을 이해하는 것은 실질 활성화 및 종양 미세 환경 (TME) 설립 이어지는 이벤트를 아는데 중요하다. 시험 관내 및 생체 TME 모델 일부는 개발되었다; 그러나, 일반적으로 이러한 모델 용이 추후 연구 비 교란 조건 하에서 각각의 세포군의 분리를 허용하지 않는다. 이러한 어려움을 회피하기 위해 연장 된 공동에 대한 인서트의 멤브레인의 양측에 개별적으로 밀접 성장 고도로 농축 된 세포 집단의 단순 생성하면서도 허용하는 투과성 미다 공막 인서트 이루어진 세포 성장 기판을 이용한 시험 관내 TME 모델을 채용 한 - 문화 회. 이 모델의 사용을 통해, 우리는 정상 이배체 인간 섬유 아세포에서 (CAF) 인구는 다음과 같은 매우 풍부한 암 관련 섬유 아세포를 생성 할 수있다형광 태그 및 / 또는 셀의 정렬을 사용하지 않고 높은 전이성 인간 유방암 세포와 공 배양 (120 시간). 또한, 삽입물의 기공 크기를 조절함으로써, 우리는 개발 근본적인 메커니즘의 조사를 허용하는 두 개의 이형 세포 집단 사이 간 통신 (예를 들어, 갭 정션 통신 분비 인자)의 모드에 대해 제어 할 수있다 갭 접합 투과성의 역할을 포함 TME. 이 모델은 암 기질 개시의 TME의 초기 진화 및 치료제에 대한 암세포의 반응에 기질의 조절 효과로 이어지는 초기 사건에 대한 우리의 이해를 높이는 데 유용한 도구 역할을한다.
Introduction
종양 미세 환경 (TME)을 공존 기질 및 호스트와 함께 진화 암종 세포로 구성된 복잡한 시스템이다. 이 기질 성분은 일반적으로 섬유 아세포, 근육 섬유 모세포, 내피 세포, 다양한 면역 성분뿐만 아니라, 세포 외 매트릭스 (1)로 구성된다. 중요한 성분이 기질의 대부분은 종종 활성 섬유 아세포 자주 암 관련 아세포 또는 암 - 관련 아세포 (CAF) 2,3-라고 칭한다. 정상적인 비 - 활성화 된 섬유 아세포와 달리 CAFs에 유방, 전립선, 폐, 췌장, 피부, 결장, 식도를 포함한 암의 다양한에서 종양의 개시, 진행, 혈관 형성, 침윤, 전이 및 재발 4-11에 기여하고, 5,6,12-17 난소. 그러나, 암 발병에 걸쳐 CAFs에의 기여의 정확한 특성을 제대로 정의 된 상태로 유지됩니다. 또한, 임상 적 증거는 CAFs에의 예후 값을 보여 주었다높은 등급의 악성 종양, 치료 실패 및 전반적인 불량한 예후의 10,18,19에 자신의 존재의 상관 관계.
분명히, CAF 개발 개시 이벤트뿐만 아니라 TME 내 역할을 매개 세포 간 통신에 대한 이해를 향상 환자 결과를 향상시킬 수있는 새롭고 흥미로운 치료 대상 향상된 전략을 제공 할 수있다. 이 목표를 향해, 생체 내 및 생체 외 모델에서 여러 가지가 개발되어왔다. 생체 내 방법은 환자의 TME 더 반사하지만, 그들은 내 종양 사이에 모두 엄청난 복잡성과 이질성을 포함한 한계를 가지고있다. 또한, 피험자의 종양 샘플은 종종 매우 TME 개발 대표하고 TME 개시 이벤트에 대한 이해를 허용하지 않는다. 실험 동물 연구 때문에 그 풍모의 차이 그러나 인간에게 동물 데이터의 일반화가주의해야합니다 몇 가지 장점을 제공합니다같은 설치류 (예를 들어, 티올 화학 (20), 신진 대사 속도 (21), 관용 등, (22)을 강조하는)와 같은 인간과 동물 사이의 ology. 또한, 자연의 유전자 유형이있는 인구는 달리, 실험 동물은 일반적으로 동질성을 사육하고 있습니다. 또한, 일시적인 생리 학적 변화 및 세포 표현형의 변화를 조사 할뿐만 아니라 설치류 동물을 사용하는 실험의 특정 매개 변수를 제어하는 것이 곤란하다. 따라서, 체외 2- 및 3- 차원 (2D 및 3D) 조직 배양 모델에서 자주 TME 개발의 기본적인 이해를 전진하는 데에 이용된다. 생체 시스템의 복잡성을 정확하게 묘사의 부족에도 불구하고, 이러한 모델은 매우 기계적 조사를 용이 장점을 제공한다. 관내 모델은 TME보다 단순화 집중하고 비용 효과적인 분석을 위해, 이에 유의 허용 데이터가 생성 될 수있다동물에서 발생하는 전신 변동이없는 세포.
체외 시스템의 여러 종류가 있습니다. 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 TME 체외 모델은 혼합 단층 또는 회전 타원체 세포 배양으로 구성되어 있습니다. 두 배양 방법은 세포 간 상호 작용과 각종 TME 특정 세포 표현형 변화를 분석 (종양 세포 예를 들어, 정상 세포)의 기초 연구에 유리하다 (예를 들면, 정상 섬유 아세포에서 암과 관련된 섬유 아세포의 출현). 또한, 구 상체는 TME보다 반사 형 조직 구조를 만들 수 있고, 종양 이질성 (23)을 대표 할 수있다. 그러나 타원체는 종종 실험의 결론 (24)를 복잡하게 할 수있다 층에 걸쳐 매우 다양한 산소 장력 구배를 생산하고 있습니다. 불행하게도, 두 모델은 매우 코 아래의 추가 특성화 및 연구를위한 순수한 세포 집단을 분리하는 능력에 제한이문화. 이렇게 형광 태그 또는 머신 식별 표지 한 후 세포 집단을 분리 정렬 광범위한 프로세싱 셀에 공 배양을 행하여 혼합되도록 적어도 하나의 세포 유형을 필요로 할 수있다. 셀 소터는 다소 순수한 세포 집단을 분리 할 수 있지만, 하나는 세포 스트레스 및 전위 미생물 오염을 인식 25 위험이어야한다.
간 통신의 이해를 용이하게하기 위해 많은 노력과 개발 간략화 된 방식을 허용하면서 밀접 생체 내 환경을 모방 한 시험 관내 시스템에서 최적화 향해 헌신되었다. 그러한 도구는 투과성 미다 삽입, 제 1953 26 개발이어서 다양한 애플리케이션 및 연구 (예를 들어, 셀의 극성 (27), 엔도 시토 시스 (28), 약물 수송 29 티슈 모델링 30 FERT 적응 된 막 기판ilization 31 방관자 효과 32, 33 등). 이 시스템은 불 침투성 plasticware에 때 배양 관찰되지 않은 34, 35 마커 생체 내에서 많은 사람들의 생체 -like 해부학 적 및 기능적 분화와 세포의 성장뿐만 아니라 표현을 허용한다. 또한, 매우 얇은 다공질 막 (10 μm의 두께)의 생체 내 환경을 시뮬레이트 모두 꼭대기 및 기저 세포 영역에서 독립적으로 세포 기능을 허용 분자 평형 시간의 신속한 확산을 허용한다. 멤브레인의 기공을 통해 간 다양한 통신 모드를 유지하면서 TME 시스템으로 삽입 효용의 추가적인 장점은 동일한 환경 조건에서 멤브레인의 양측 상에 성장 개의 이형 세포 집단의 물리적 분리된다. 비록 물리적으로 분리 된 두 세포 집단은 대사 드로 분비 소자를 통해 접속되며또한 갭 접합부 채널을 통해, 여기 스크라이브. 또한, 생체 부분 산소 장력의 인서트 (PO 2)를 유지함으로써,이 모델은 다른 시스템들에서 관찰 된 산소와 화학 구배의 합병증을 감소시킨다. 오히려, 그것은 자연 TME 제어 메커니즘에 대한 이해를 증가시킨다. 특히, 두 세포 집단 쉽게 공 배양 장기간 다음 형광 태그 및 / 또는 세포 소팅 않고 고순도로 분리 할 수있다.
여기서 우리는 멤브레인 기공을 통해 지속적인 양방향 통신 아직 인간 유방암 세포 투과성 미다 공막 인서트의 양쪽에 각각 자란 인간 섬유 아세포 이루어지는 관내 TME 프로토콜을 설명하지만. 우리는 그 표시 발달로 다양한 기공 크기와 간 통신의 특정 유형의 기여 (간극 연접 비교 예 분비 인자) 막을 사용하여TME으로 조사 할 수있다.
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Protocol
문화 미디어와 세포의 1. 준비
- 이글의 최소 필수 12.5 % (부피 / 부피)으로 보충 된 배지 열 활성화 된 우 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민, 페니실린 100 유니트 500 ㎖의 용액 당 스트렙토 마이신 100 μg의 준비.
주 : 성장 배지 및 보충 (들)을 쉽게 다른 세포 균주 또는 세포주의 성장 조건에 대해 교환 될 수있다. - 각각의 인서트 (6 웰 포맷 인서트)를위한 세포 배양 배지 70 ㎕를 준비 : 이글의 최소 필수 배지는 50 % (vol / vol) 열 활성화, FBS 2 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민, 100 단위로 보충 페니실린과 스트렙토 마이신 ml의 당 100 μg의.
주 : 배지는 인서트의 바닥면 (즉, 하측)에 세포 부착을 용이하게하기 위해 50 % FBS가 보충된다. 성장 배지 및 보충 (들)을 쉽게 다른 세포 균주 또는 세포주의 성장 조건에 대해 교환 될 수있다. - 인서트의 바닥면에 도금 될 운명 세포의 세포 현탁액을 준비한다.
주 : 여기에서, 결과 AG1522 75 ㎠로 세포 배양 플라스크에서 배양 정상적인 인간 섬유 아세포를 사용하여 수득하고, 이들 세포 따라서 세포 현탁액의 제조에 대한 설명이 분명 할 것이다. - 세포를 수집하기 위해, 성장 배지를 제거하고 5 ㎖ 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포 단층 배 씻는다.
- PBS를 제거하고 RT (실온)에서 2 분 동안 세포를 실온 (RT)을 미리 예열 2.21 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)과의 트립신, 0.25 % (부피 / 부피) 1 mL의 확산.
- (단계 1.1에서 제조) 완전 성장 배지 9 ml의 트립신 활성을 켄 칭하고 부드럽게 플라스크에 10 배의 표면에 세포 현탁액을 피펫 팅하여 세포를 수집한다.
- 혈구 전자 계수기를 사용하여 세포 농도를 결정하고 제공하기 것이다 세포 현탁액 부피 피펫전자 멸균 15 ML의 원심 분리기 튜브에 삽입 당 250,000 세포.
- 원심 분리하여 세포 현탁액 (800 XG, 2 분) 펠렛. 70 μL 당 250,000 세포의 농도를 생성한다 (단계 1.2에서 제조) 성장 배지에서 세포 펠렛을 중지.
주 : 투과성 미다 공막 인서트의 세포 배양 물이 2 차원 기판에 근거 같이 세포가 초기에 부착을 촉진하는 50 % (부피 / 권) FBS를 포함하는 배지에 현탁한다 제외한 셀 시드가 마찬가지로 실행된다.
삽입 2. 준비
참고 : 세포 배양에 전념 층류 생물 안전 캐비닛에 무균 조건, 작업을 확인하십시오.
- 0.4 ㎛의 멤브레인 기공 크기 1 ㎛, 3 ㎛의로 선택 인서트 (기공 크기 실험이자 (들)에 의해 결정이 간 통신의 다른 모드의 역할을 조사하기 위해 사용될 수있다).
주 : 0.4 μm의 기공에 작은입니다L은 충분히 삽입 막의 양쪽 셀 간의 기능 차이 접합의 형성을 제한하는 요인에 의해 분비 세포 간 통신을 연구하는데 사용될 수있다. 반면, 1 ㎛ 내지 3 ㎛의 기공이 작동 갭 접합의 형성을 허용하기에 충분히 크고 갭 정션 분비 인자 모두 간 통신을 연구하는데 사용될 수있다. - 포장에서 개별 삽입물을 제거하고 동일한 크기의 멀티 잘 접시에 배치합니다.
참고 : 삽입 특정 애플리케이션 요구에 맞게 다양한 막 표면 영역을 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 6 자, 12도, 24도 삽입.). 여기서, 결과는 6- 웰 인서트를 사용하여 수득 하였다, 따라서 모델 설명의 초점이 될 것이다. - 접시 뚜껑 인서트를 포함, 접시를 커버. 두 손으로 멀티 잘 접시를 잡고 부드럽게 삽입 바닥 (즉, 아래쪽은) 지금 위쪽으로 향하게되도록 접시를 반전.
- 일을 제거인서트의 바닥면을 노출시키는 멀티 웰 접시의 바닥 E. 한 번에 하나의 삽입 작업, 포셉의 살균 쌍을 사용하여 조심스럽게 제자리에 삽입을 누릅니다. 무료 손으로, 25 만 세포를 포함하는 세포 현탁액 (단계 1.3-1.8에서 제조)의 70 μl를 그리는 넓은 입 팁 피펫을 사용합니다.
- 세포를 플레이트에 삽입의 멤브레인의 중심을 부드럽게 피펫 팁을 배치하고, 천천히 막의 표면 주위 피펫 팁을 이동하면서 서서히 세포 현탁액 70 μL 피펫. 삽입의 가장자리에 피펫 팁 및 세포 현탁액을 연장하지 않도록주의하십시오.
주 : 인서트의 가장자리를 터치하면 첨부 동안 건조 셀에 이르는 세포 현탁액 모세관 장력의 손실을 초래할 수있다. - 주의를 행사하지 않을 가능성이 미생물 오염을 방지하기 위해 노출 삽입을 통해 직접 작업에, 나머지 삽입을 반복합니다.
- 조심스럽게 다 잘 돌아갑니다접시 바닥은 삽입을 포함합니다. 반전 인서트 접시 유지 30-45 분 동안 37 ℃에서 5 % (부피 / 부피) CO 2의 가습 된 공기 분위기에서 배양한다.
주 : 삽입 콘택트 웰 바닥의 세포 현탁액을 조심스럽게 접시 바닥을 들어 올려이 약간의 각도를 형성하고, 접시의 표면 사이에 큰 거리를 생성되도록 접시 상부 가장자리에 나머지 경우 (세포를 시딩) 인서트의 바닥면. 이 대신 인서트의 웰의 표면에 부착로부터 세포를 방지한다. - 30 ~ 45 분 배양 시간에 따라 부드럽게 삽입이 들어있는 접시를 제거하고 층류 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.
- 두 손으로 꽉 접시 뚜껑을 유지하면서 부드럽게 부착 세포를 함유하는 인서트의 바닥면은 이제 아래로 향하도록 상기 접시를 다시 반전.
- 3 μm의 기공이 migrati을 방지하기 위해 삽입을 위해 차분히 2 ㎖ (1 ml에 추가삽입의 바닥 침지되도록 미리 예열 완료 매체의 삽입 구멍)을 통해 세포에 (각 웰 단계 1.1)을 참조하십시오.
- 삽입을 포함하는 모든 우물에서 성장 매체를 추가 한 후, 가습 인큐베이터에 다시 접시를 놓습니다.
- 인서트 48 시간 동안 인큐베이터에 그대로 남아 있습니다. 48 시간 후, 웰의 바닥에서 중간의 2 ml의 흡입 신선한 성장 배지 2 ㎖를 첨가하여 세포를 공급.
- 이러한 경우 (이미 바닥면에 성장하는 제 1 셀 인구 인서트의 상부면에 상기 제 세포군 현탁액 (~ 250,000 세포 / ml)의 잘 시드 1 ml의 하단에 새로운 배지를 첨가 한 후 실험은, AG1522 (대조군) 세포 암 (실험) 세포)는 인서트의 바닥면에 성장 될 운명 CAFs에 이미 AG1522 세포를 갖는 인서트의 상부에 도금된다. 가습 인큐베이터에 다시 접시를 놓습니다.
참고 : 만약 작품삽입물의 아래쪽에 잘 부착되지 않는 세포를 보내고,이 세포는 다르게 인서트의 상부면 상에 성장 될 수있다. - 웰의 삽입과 하단의 상부에서 배지를 흡인함으로써 인서트의 윗면에 셀의 두번째 집단을 시딩 한 후 24, 72의 중간 및 96 시간을 변경한다. 부드럽게 웰의 바닥에 인서트의 윗면에 새로운 배지 1 ㎖를 2 ㎖에 추가한다. 두 세포 인구 120 시간의 투과성 미세 삽입 막의 양쪽에 공동 문화에 남아있을 수 있습니다.
3. 트립신에 의해 삽입에서 세포를 수집
주의 : 농축 된 세포 집단을 수득하는 용이성에 더하여, 삽입 TME 모델은 유사한 실험 치료 가능 (예를 들어, 화학, 상기 주위 공기보다 낮은 산소 환경에 노출, 이온화 방사선 처리 등으로 배양) 등 다른 시험관 (시츄 면역 검출, 웨스턴 블랏에서 예) 다음에 엔드 포인트의 분석에 이용 될 수있는 고농축 집단을 얻기 위해 삽입 멤브레인의 양측에서 수확 될 수 있거나 후속 실험 36 전파.
- 세포를 수집하기 위해, 성장 배지로부터 삽입물을 제거하고 1 ㎖의 PBS를 함유하는 35mm 세포 배양 접시에 배치. 1 ml의 PBS로 삽입 1 배의 아래쪽과 위쪽을 씻으십시오.
- PBS를 제거를 0.25 % 2.21 mM의 EDTA와 트립신 (부피 / 부피) 200 μl를 추가, RT에 미리 예열.
- 인서트의 바닥면에 성장 된 세포를 수집하는 경우, 35mm 접시에 트립신 용액을 넣고 부드럽게 RT에서 2 분 동안 트립신 용액으로 인서트의 바닥에 놓는다.
- 세포를 수집하면삽입물의 상부면 상에 성장 S, A 35mm 접시에 삽입 배치하고, 삽입물의 상부에 트립신 용액을 첨가하고 실온에서 2 분간 배양한다.
- 완전 성장 배지 800 μl를 첨가함으로써 트립신의 활성을 해소.
- 인서트의 저면에 성장 된 세포를 수집하는 경우, 35mm 접시에 성장 배지를 추가하고 부드럽게 삽입이 약간 유지되면서 삽입 배의 표면 위에 세포 현탁액 1 ml의 피펫 팅하여 세포를 수집 각도는, 세포 현탁액은 접시에 수집되도록.
- 인서트의 상면으로부터 세포를 수집하는 경우, 상면에 성장 배지를 추가하고 부드럽게 삽입 배의 표면 위에 세포 현탁액 1 ml의 피펫.
유동 세포 계측법에 의해 세포 순도 4. 특성
주 : t의 순도를 유지하는 통기성 미세 다공성 막 삽입 능력을 특성화120 시간까지, 섹션 1-3 녹색 형광 단백질 (GFP)을 수행 하였다 위해 (즉, 상단과 하단) 그는 두 개의 세포 집단은 MDA-MB-231 세포는 삽입물의 상단면에 도금되는 -tagged하고, 비 GFP 태깅 AG1522 세포는 0.4 μm-의 바닥면에 1 μm-, 3 ㎛의 포어 인서트 도금된다.
- 인서트의 바닥 측으로부터 셀 (절차 3 장에 기재되어 있음)을 수집 후 원심 분리하여 세포 현탁액 (500g, 30 초) 펠렛.
- 상층 액을 제거하고 1 % (부피 / 권) FBS로 보충 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS) 400 μL의 세포 펠렛을 일시 중지합니다.
- GFP 및 GFP의 광자 (37)를 검출하기 30분의 530의 대역 통과 필터를 여기하는 사이토 488 nm 인 레이저를 구비 한 흐름 세포 측정 분석을 수행한다.
- 셀 식별을 위해, 유동 세포 계측기에 순방향 조정할 AG1522 조절 세포 집단 및 측면 산란 전압을 사용한다. 맞추다GFP의 채널 전압은 GFP 신호에 대한 낮은 검출 임계치와 셀룰러 형광도 값을 설정한다.
- 대조군 세포를 이용하여 임계 값을 결정 게이팅. 제어 대 GFP 양성 세포의 존재에 기초하여 각각의 세포 집단의 순도를 평가한다.
주 : 순수 인구가 감지 된 GPF 양성 세포의 반사 될 것이다.
제자리에 면역 형광에 의한 세포의 5. 특성
- 삽입에서 세포의 트립신에 따라, (3 절 참조) 세포를 수집, 판 5 × 10 4 멸균 커버 글라스 상에 250 ㎕의 성장 매체 (참조 단계 1.1) 세포, 그리고 가습 공기 분위기에서 1 시간 동안 부착 할 수 있도록 37 ° C 배양기에서 5 % (부피 / 부피) CO 2.
- 인큐베이션의 끝에, 부드럽게 커버 슬립을 함유하는 접시를 제거하고 층류 생물학적 안전 캐비넷에 배치.
- 조심스럽게 (단계 참조 미리 예열 완전 배지 2 ㎖를 추가1.1) 각 접시에,되도록 커버 슬립을 담근다.
- 커버 슬립을 포함하는 모든 요리에 성장 매체를 추가 한 후, 48 시간 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 5 % (부피 / 부피) CO 2의 가습 공기 분위기에 요리를 반환합니다.
- 48 시간 배양 후, PBS로 샘플 배를 씻어 RT에서 10 분 동안 PBS에서 4 % (중량 / 부피) 포름 알데히드로 고정한다.
- 트리스 완충 식염수 (TBS : 50 mM 트리스 - CL, 산도 7.5, 150 mM의 염화나트륨)로 5 배를 씻어 후 5 분에서 0.25 % (부피 / 부피) 트리톤 X-100, 0.1 % (중량 / 부피) 사포닌과 Permeabilize 하시려면 RT.
- 비특이적 2 % (부피 / 권) 정상 염소 혈청 (NGS), 1 % (중량 / 부피) 소 혈청 알부민 (BSA), 0.1 % (부피 / 부피) TBS 트리톤 X-100을 가진 결합 부위를 차단 (블로킹 RT에서 1 시간 동안 용액).
- 밤새 4 ° C에서 솔루션을 차단에 : 차 항체 (1,000 방지 카베 올린 1 (CAV1), 1)에 품어.
- 0.2 % NGS (부피 / 부피), 1 % (중량 / 부피) BSA, 0.1 %로 언 바운드 일차 항체 (배, 5 분 / 세척)을 씻어 (VOl / 부피) TBS 트리톤 X-100 (세정액).
- 솔루션을 차단에서 1 시간 동안 실온에서 차 항체와 함께 품어 (섹션 5.4 참조).
- 언 바운드 차 항체 세척 용액 (3 배, 5 분 / 세척)을 씻어 (단계 5.6 참조).
- 마운트 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)를 포함하는 안티 - 페이드 장착 매체와 슬라이드에 커버 슬립, 매니큐어로 밀봉.
- 형광 여기를 위해 외부 광원을 구비 거꾸로 현미경에 오일 63X 배율 대물 렌즈를 사용하여 세포를 관찰하고, 후속 분석을 위해 부착 된 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡쳐.
서양의 얼룩에 의해 세포의 6. 특성
주 : 웨스턴 블롯 절차는 다른 38 설명한다. 간략한 개요는 여기에 설명되어 있습니다 :
- 트립신 처리에 의해 삽입로부터 세포의 분리 이후, (제 3) 원심 분리 (500g, 30 초)에 의해 세포 현탁액 펠렛.
- 상층 액을 제거하고 100 μl의 PBS로 세포 펠렛의 2 배를 일시 중지합니다.
- 변성 radioimmunoprecipitation 분석 50 μL의 상등액를 Lyse 세포를 제거 (RIPA) 완충액 (트리스 pH를 7.5의 50 mM NaCl을 150 mm의 NP40 1 % (부피 / 권), 소듐 데 옥시 콜레이트 수화물 (DOC) 0.5 % (부피 / 부피), 소듐 도데 실 설페이트 (SDS), 0.1 % (부피 / 부피의)), 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유.
- 4 ℃에서 15 분 동안 19,000g에서 얼음과 원심 분리기에 20 분 동안 품어.
- RIPA 버퍼 내의 세제와 호환 가능한 광학 밀도 단백질 분석을 이용하여 상등액의 단백질 농도를 결정한다.
- 0.2 μm의 니트로 셀룰로오스 막 상 electroblot 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리 된 단백질.
- 0.1 % (부피 / 부피) 트윈 - 20 (TBST), 4 % (중량 / 부피)를 포함하는 TBS에서 막을 품어 60 분 동안 우유 (차단 솔루션을) 탈지 및 (4 ° C에서 하룻밤 일차 항체와 반응 방지CAV1, 1 : 1000).
- RT (5 분 / 세탁)에서 TBST로 막 배를 씻으십시오.
- 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) (5,000 1)와 접합 항 - 마우스 이차 항체를 함유하는 차단 용액에 30 분 동안 막을 인큐베이션.
- RT (5 분 / 세탁)에서 TBST로 막 배를 씻으십시오.
- 웨스턴 블 롯팅 검출 시스템을 이용하여 화학 발광 법에 의해 반응 생성물을 가시화.
유동 세포 계측법에 의해 세포 간 통신의 7 특성
주 : 투과성 미다 공막의 적응성을 특징들은 간 통신 (예를 들어, 분비 된 인자 간극 연접)의 다양한 모드를 검사하기 위해 삽입한다. 섹션 1-2.12 비 형광 AG1522 세포 0.4 μm-의 바닥면, 한 μm-, 3 μm의 구멍에 삽입되는 도금으로 수행 하였다.
- 문화 섹션 1.1에 기재된 배지를 사용하여 90 % 포화 상태에 35mm 접시에 AG1522 세포는 비 - 표지.
- 아르 자형INSE 세포 HBSS 1 mL의 1 배.
- 칼 세인 오전 30 μM을 포함하는 HBSS에 세포를 배양하여 칼 세인 AM와로드 셀.
- 37 ℃에서 5 % (부피 / 부피) CO 2의 가습 된 공기 분위기에서 15 분 동안 인큐베이션.
- 워시 세포 HBSS 1 mL의 2 배.
- RT에서 2 분 동안 2.21 mM의 EDTA와 0.25 % 트립신 200 μL 용액 (부피 / 부피)을 첨가하여 세포를 Trypsinize.
- 12.5 %를 함유하는 완전 배지 (부피 / 부피) FBS 800 μl를 첨가함으로써 트립신의 활성을 해소.
- 반복 피펫 팅에 의해 현탁액에 세포를 가져와.
- 혈구 전자 계수기를 사용하여 세포 농도를 결정 이미 바닥면에 성장 AG1522 셀이 인서트의 윗면에 칼 세인 AM 로케이션 250,000 세포 접시.
- 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 공기 분위기에서 삽입 부화 6 시간 동안.
- 설명 된 바와 같이 6 시간 후, 인서트의 바닥면으로부터 세포를 수집섹션 3인치
- 원심 분리하여 세포 현탁액 (500g, 30 초) 펠렛.
- 상층 액을 제거하고 1 % (부피 / 부피) FBS로 보충 된 HBSS 400 μL의 세포 펠렛을 일시 중지합니다.
- 레이저가 장착 된 사이토에 세포를 분석하고 흥미로운 가능한 필터 제조사의 프로토콜에 따라, 칼 세인 (496 nm 내지 516 nm의 각각)의 방출을 검출.
- 셀 식별을 위해, 유동 세포 계측기에 전방 및 측면 스 캐터 전압을 조정하는 흠 AG1522 조절 세포 집단을 사용한다. 칼 세인 신호 낮은 검출 임계치와 셀룰러 형광도 값을 설정하기 위해 칼 세인 채널 전압을 조정한다.
- 칼 세인 제어로드 셀을 사용하여 상위 임계 값 제한을 결정한다. 제어 대 칼 세인 양성 세포의 존재에 기초하여 각각의 셀을 삽입 통신 평가.
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Representative Results
여기서 우리는 생체 내 종양 미세 환경 (도 1)를 모방 한 시험 관내 이형 세포 공 배양 시스템을 개발하는 투과성 미다 공막 인서트 장치. 서로 다른 세포 집단은 (유스에서는, 120 시간 이하) 장시간 동안 삽입물의 다공질 막의 양측에 성장 될 때까지 이러한 시스템은 허용한다. 0.4-, 1-, 3 M-세공 인서트의 윗면에 GFP 표지 된 MDA-MB-231 세포를 도금들이 성장할 수에 의해 결정되는 중요한에있어서, 상기 세포 집단의 순도를 유지할 수 AG1522 세포는 120 시간 동안 상기 인서트의 바닥면에 성장하는 공존 배양. 이 시간 후, 세포는 인서트의 바닥면으로부터 수집하고, 세포 집단 순도의 손실을 표시하는 어떤 GFP 양성 MDA-MB-231 세포의 존재를 확인하기 위해 유세포 분석. 분석은 99.9 %와 99.8 % 폴리 우레탄 밝혀각각 0.4와 1 ㎛ 기공 삽입에서 인구 재; 기공 막에 걸쳐 마이그레이션 할 GFP 양성 MDA-MB-231 세포의 상당수를 허용하기에 충분했다 그러나, 3 μm의 구멍으로 삽입, 셀 인구의 분리를 유지 할 수 없습니다 (그림 2) .
에 의해 결정되는 중요한 시츄 면역 및 웨스턴 블롯 분석을 통하여 우리는 효과적으로 MDA-MB-231 유방암 세포와 공동 배양 다음 정상적인 인간 이배체 AG1522 섬유 아세포에서 발암 관련 섬유 아세포를 생성하기 위해이 시스템의 능력을 입증 할 수 있었다 카베 올린 -1의 감소 표현, 잘 설립 CAF 바이오 마커 39-42 (그림 3). CAV1 여러 세포 과정 (43)에서 포함되는 세포막의 지질 래프트 도메인에서 카베 올래를 구성하는 발판 단백질이다. 웨스턴 블롯에서두 개의 별개의 밴드 CAV1 (44)의 α 및 β 이소 형에 대응하는 관찰되었다. 불행하게도, 약간은 동종의 차이 (들), CAF 바이오 마커로 특히 자신의 역할에 대한 알려져있다.
우리는 또한 두 가지 이형 세포 집단 (도 4) 사이의 간 통신을 조절하는 삽입 공 배양 시스템의 능력을 보여 주었다. 표지되지 않은 갭 정션 유능한 사람 이배체 AG1522 섬유 아세포는 인서트의 바닥면에서 포화 상태로 배양 하였다. AG1522 셀의 제 2 세트는 칼 세인 AM, 녹색 형광 갭 정션 투과성 염료 로딩하고 인서트의 상부면에 도금 하였다. 두개의 세포 집단을 6 시간 동안 통신을 허용 한 후, 인서트의 바닥면에있는 세포는 단리 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 인서트의 바닥면으로부터 칼 세인 양성 세포는 세포 말이지 반사 될삽입 구멍을 통해 갭 접합부 커플 링을 tablished. 0.4 ㎛의 기공의 크기는 따라서 (예를 들면, 성장 인자, 마이크로 소포 등) 분비 인자 통신을 구속 인서트의 측면에 성장 세포 간의 기능적 제한 갭 접합 형성을 삽입한다. 대안 적으로, 1 ㎛ 및 3 ㎛의 기공의 크기는 간극 연접을 통해 세포 기능의 결합을 허용하기에 충분히 분명히 크다. 따라서, 기공 크기를 조절함으로써, 하나의 세포 간 통신의 다른 모드는 TME 개발 및 진화에 미칠 수있는 다양한 역할 (들)을 이해하기 시작할 수있다.
그림 1 :. 침투성 미세 다공성 막 삽입 모델 제도 (가) 분명히 정상적인 인간 이배체 AG1522 섬유 아세포 CAFs에 될 운명 (낮은 통로 세포) 역에 씨앗을 품고있다0.4 μm의, 1 ㎛, 또는 3 μm의 기공으로 10 μm의 두께 폴리 에스테르 막으로 구성된 투과 미세 삽입. 부착 후, 인서트 반전 및 포화 상태에 플레이트의 웰에 넣고 배양 하였다. (b) 종양 세포 및 섬유 아세포의 제어 전에 바닥면에 밀접하게 섬유 아세포 성장과 인서트의 윗면에 놓는되기 플라스크에 별도로 성장된다. (c) 상기 공동 배양 된 세포는 격일로 공급되고, 원하는 시간 동안 유지된다. 공동 배양 및 / 또는 실험적 치료 다음 각각 상시 (d)는 상기 CAFs에 (인서트의 바닥면) 및 / 또는 암세포 (삽입물의 상부면)은 신중하게 고순도의 세포 집단을 수득 트립신 처리에 의해 분리되고 엔드 포인트의 분석에 사용 또는 후속 연구에 전파 될 수있다. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2 :. 매우 농축 세포 집단의 생성 결과 세포 계측법 대표 흐름은 매우 120 시간 공동 문화 다음, 아직 독립 이형 세포 집단을 농축 유지하기 위해 삽입의 능력을 보여줍니다. 0.4 ㎛의 세공 인서트의 바닥면에서 수확 (a) AG1522 세포 집단의 99.9 %가 삽입 (하부 좌측 사분면)의 상면에 성장 GFP 표지 MDA-MB-231 세포의 자유를 나타낸다. (b)이 1 μm의 세공 인서트의 바닥면에서 수확 AG1522 세포는 99.8 % 농축 인구 (하부 좌측 사분면)을 나타낸다. 3 ㎛의 세공 인서트의 바닥면에서 수확 (c) AG1522 세포 집단의 68.5 %가 (하부 좌측 사분면은 GFP 표지 된 세포 없는지 공개), GFP 양성 MDA-MB-231 세포의 큰 숫자가 3 μm의 구멍을 통해 마이그레이션 할 수 있었던 것을 나타내는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 암 - 관련 섬유 아 세포의 생성 CAV1의 감소 된 표현은 일관되고 신뢰할 수있는 CAF 바이오 마커입니다. (a) 또는 MDA-와 시츄 면역의 현미경 사진 (배율 바 = 20 μm의) 및 AG1522 세포 (대조군)와 함께 공동 배양 있었다 AG1522 세포 CAV1의 (b) 웨스턴 블롯 분석 (왼쪽) MB-231 유방암 세포 (오른쪽) 120 시간 동안. 부하 제어를 위해 사용하고, 서양 말의 배의 변화를 결정하기 위해 폰소 s 레드로 염색. 결과의 대표세 개의 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 삽입 기공 크기에 의하여 세포 간 통신의 변조 세포 계측법 칼 세인 오전 AG1522 세포가 삽입 및 AG1522 컨트롤의 상단에 성장로드 사이에 세포 간 통신의 다양한 모드를위한 선택 투과성 미세 다공성 막 삽입 TME 모델의 적응성을 보여주는 분석 흐름 바닥면에 성장하는 세포. (a) 0.4 ㎛의 세공 인서트의 바닥면으로부터 수확 된 세포는 삽입 구멍을 통해 제한 갭 정션 통신을 나타내는 칼 세인 양성 세포 (0.57 %)의 매우 낮은 수준을 나타낸다. (b) 1 ㎛ 세공 인서트의 바닥면으로부터 수확 된 세포는 H 보여기능성 간극 연접의 형성을 나타내는 칼 세인 양성 세포 (9.98 %)의 igher 수준. 3 μm의 기공 삽입의 바닥면에서 수확 (C) 세포는 광범위한 갭 접합부 통신을 나타내는 칼 세인 양성 세포 (87.8 %)의 높은 수준을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 투과성 미다 공막 인서트 이형 세포의 공 배양에서 고농축 개별 세포 집단을 생성하기 위해 이용하는 간단한 시험 관내 절차에 적응 (도 1)이다. 현저하게, 간 모델은 다양한 통신 방식을 연구하기에 적합하다. 중요한 단계는 상단 측에 제 세포군 시드 50 % FBS로 보충 된 배지에서 인서트의 바닥면에 상기 제 세포군 시드 특정 실험이자 (S)에 적절한 기공 크기의 삽입물을 선택하는 것을 포함 삽입하고, 적절한 시간 동안 두 개의 별개의 세포 집단을 공동 배양. 우리는이 시스템은 따라서 분자 표현형을 이해하는 큰 기회를 제공하는 다양한 생체 내 특성을 모방 할 수 있음을 보여 주며, 잠재적 변화는 주요 D를 해결 초기 TME 발전 중에 생기는많은 설립 TME 체외 모델의 isadvantage (그림 2).
모델은 쉽게 암 기질 개발 및 진화 TME (도 4)에서 세포 - 세포 상호 작용의 다양한 양태의 조사를 허용하도록 변경 될 수있다. 0.4 ㎛의 세공 삽입 두 세포 집단 (45) 사이의 밀접한 결합을 가능하게하지만, 크게 삽입 멤브레인의 양측 상에 성장 세포 (도 4) 사이의 기능성 간극 연접의 형성을 제한한다. 따라서, 이와 CAF 개발 46-48을 매개 확산 인자 (예, 성장 인자) 및 / 또는 세포 외 소포 (예, 엑소 좀)의 역할에 대한 연구를 촉진. 대안 적으로, 1 ㎛ 및 3 ㎛의 기공 따라서 접합부 채널을 통하여 간접 통신을 통해 모두 직접 결합 대사의 연구를 허용하는 기능성 간극 연접의 형성을 허용하기에 충분히 큰확산 분비 요인. 3 μm의 기공 삽입 모공을 통해 세포 이동을 허용하지만, 그것은 확장 된 공동 배양 시간 동안 두 개의 분리 된 이형 세포 집단의 순도를 유지하지 않습니다 (그림 2 참조) (예 :., 120 시간을). 본 모델은 TME의 여러 측면의 연구를 가능하게하는 반면, 그것은 생체 TME (예, 혈관 유체 교환 등)에서 발생하는 복잡한 생리 학적 상호 작용의 대부분을 설명 할 수있는 능력이 제한된다.
TME의 암 기질의 활성화 및 개발의 초기 이벤트를 이해하는 것은 기본 종양 개시 및 진행뿐만 아니라 전이에 관여하는 단계를 해명 중요하다. 이제 널리 암 간질, 특히 CAFs에가 (49 평가) 발암지지에 중요한 역할을 갖고 있음을 인정한다. 이는 시험관 2D 및 3D 모델의 많은 발전하게되었다, 목표조명 전략에서 에드는 간질 활성화 및 종양 진행에 기여하는 초기 메커니즘을 대상으로한다. 불행하게도,이 모델의 대부분은 추가 연구를 위해, 시간과 스트레스를 처리하지 않고, 개별 세포 집단의 분리를 허용하기 위해 자신의 무능력에 의해 제한됩니다. 용이하고 신속하게 후속 연구에 즉시 분석하거나 전파 고도로 농축 된 순수 세포 집단을 수득하는 능력 속성과 같은 생체 내에서 결합으로 따라서이 프로토콜은 TME 연구 분야에 상당한 추가 제공한다.
기술을 습득 한 후에 삽입 TME 모델은 다양한 TME 양방향 상호 작용을 연구에 이용 될 수있다 (예를 들면, 암, 면역 세포 등 암 내피). 또한, 공동 - 배양의 복잡성 얻었다 따라서, 하나의 인서트의 측 및 다른 측에 단일 모집단 혼합 된 세포 집단을 배치하여 향상 될 수있다TME 세포 인구의 복잡성과 같은 생체 내에서 더 보내고. 그러나주의 특히 작은 지름 (~ 7 μm의 (50)의 직경 예를 들어, 인간 림프구)의 세포를 사용하는 경우 적절한 기공 크기의 삽입을 선택하는 행사해야한다,로에게 그들은 (작은 구멍을 통해 마이그레이션 할 수있다 예를 들어, 0.4 μm의 또는 1 ㎛). 하는 공동 문화 전, 이주 실험 (그림 2) 확장 공동 배양 실험을 통해 순수 세포 집단의 유지 보수를 보장하기 위해 보증 할 수있다.
이 모델은 다양한 치료 학적 문제 (예를 들어, 이온화 방사선, 화학 요법, 온열 요법) 및 투과성 미다 공막 인서트를 통해 연결되는 혼합 된 세포 집단에서의 생리적 변화 (예를 들면, 저산소증, 고농도 산소, 생물학적 억제제)의 효과를 조사 할 의무가있다. 모델 CAFs에 성공적으로 생성 할 수있는 능력을 보여 주었다, IDE삽입 시스템 2 (7 mmHg로 PO와 같은 생체 내에서 유지 될 때 추가로 55 % 감소 하였다 널리 CAF 바이오 마커 (CAV1의 즉, 하향 조절) 39 ~ 42 (그림 3)에 의해 ntified 0.5 % 다양한 실험 설계 및 조건에 대한 모델의 적응성을 강조 O 2) (51), (데이터) 도시하지 않음. 요컨대,이 모델은 치료 학적 또는 환경 에이전트 간단한 접근법 암 기질의 활성화는 TME 초기 진화에 깊은 통찰력을 얻기 위해 시간 및 외부 요인을 조절하기위한 기회, 및 세포 반응을 제공한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 또는 상충되는 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence - 1:2,000 |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
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