Abstract
Forstå de tidlige heterotypic samspillet mellom kreftceller og omkringliggende ikke-kreft stroma er viktig å belyse hendelsene som førte til stromal aktivering og etablering av svulsten mikromiljøet (TME). Flere in vitro og in vivo modeller av TME har blitt utviklet; imidlertid, generelt disse modellene ikke lett tillater isolering av individuelle cellepopulasjoner, under ikke-perturbere betingelser, for videre studier. For å omgå denne vanskelighet, har vi anvendt en in vitro TME-modell ved hjelp av et cellevekst substrat bestående av en permeabel mikroporøs membran innsats som tillater enkel produksjon av høyanriket celle populasjoner dyrket nært, men hver for seg, på hver side av innlegget membran for utvidet co -Kultur ganger. Gjennom bruk av denne modellen, er vi i stand til å generere sterkt anriket kreft-assosiert fibroblast (CAF) populasjoner fra normale diploide humane fibroblaster følgendeko-kultur (120 timer) med høyt metastatisk humane bryst karsinomceller, uten bruk av fluorescerende merking og / eller cellesortering. I tillegg, ved å modulere pore-størrelse på innsatsen, kan vi kontrollere for modusen av intercellulær kommunikasjon (f.eks gap junction kommunikasjon, utskilles faktorer) mellom de to heterotypic cellepopulasjoner, som tillater undersøkelse av de mekanismer som ligger til grunn for utviklingen av TME, inkludert rollen til gap junction-permeabilitet. Denne modellen tjener som et verdifullt verktøy i å øke vår forståelse av de innledende hendelser som fører til kreft-stroma initiering, den tidlige utviklingen av TME, og den modulerende effekt av stroma på svarene av kreftceller til terapeutiske midler.
Introduction
Svulsten mikromiljøet (TME) er et svært komplekst system består av carcinoma celler som co-eksistere og utvikle seg sammen med verts stroma. Dette stromal komponenten består vanligvis av fibroblaster, myofibroblasts, endotelceller, forskjellige immunkomponenter, samt en ekstracellulær matriks 1. En vesentlig bestanddel, ofte størstedelen av denne stroma blir aktiverte fibroblaster, ofte referert til som kreftassosiert fibroblaster eller karsinom-assosiert fibroblaster (CAF) 2,3. I motsetning til vanlige, ikke-aktiverte fibroblaster, kafeer bidra til tumor initiering, progresjon, angiogenese, invasjon, metastase, og gjentakelse 4-11 i et bredt utvalg av karsinomer, inkludert bryst, prostata, lunge, bukspyttkjertel, hud, tarm, øsofagus, og eggstokk 5,6,12-17. Likevel forblir det nøyaktige innholdet i bidraget fra kafeer gjennom kreft patogenesen dårlig definert. Videre har kliniske bevis vist en prognostisk verdi av kafeer, Samkjøre deres tilstedeværelse til høyverdig malignitet, terapi svikt, og generelt dårlig prognose 10,18,19.
Åpenbart øke vår forståelse av hendelsene som starter i CAF utvikling, samt inter kommunikasjon medierer sin rolle innenfor TME, kan gi spennende nye terapeutiske mål og forbedrede strategier som kan forbedre pasientens utfall. Mot dette målet, har flere in vivo og in vitro-modeller er utviklet. Mens in vivo tilnærminger er mer reflektert av pasientenes TME, besitter de begrensninger, inkludert den enorme kompleksitet og heterogenitet både innenfor og mellom svulster. Videre tumorprøver fra mennesker ofte representerer høyt utviklet TME og tillater ikke en forståelse av TME initierende hendelser. Eksperimentelle dyrestudier har noen fordeler, men generalisering av data fra dyreforsøk til mennesker bør gjøres med forsiktighet på grunn av forskjeller i physiology mellom mennesker og dyr så som gnagere (f.eks, til tiol kjemi 20, metabolske rate 21, toleranse reke 22, etc.). Videre, i motsetning til den menneskelige befolkning, som er genetisk heterogen natur, forsøksdyr blir typisk avlet til homogenitet. Dessuten er det ofte vanskelig å undersøke fysiologiske transiente variasjoner og celle-fenotype forandringer, så vel som for å kontrollere for spesifikke eksperimentelle parametere ved bruk av dyr som gnagere. Således in vitro 2- og 3-dimensjonale (2D og 3D) vevkultursystemer modeller er ofte benyttet for å fremme den grunnleggende forståelse av TME utvikling. Til tross for deres mangel på en presis skildring av kompleksiteten i in vivo-systemer, disse modellene har fordeler som i stor grad forenkle mekanistiske undersøkelser. In vitro-modeller gir mulighet for en mer forenklet, fokusert og kostnadseffektiv analyse av TME, der statistisk signifikant data kan genereres iceller uten systemiske variasjoner som oppstår i dyr.
Det er flere varianter av in vitro-systemer. De to mest brukte TME in vitro modeller består av blandet enkeltlag eller sfæroide cellekulturer. Begge kultur metoder er en fordel for grunnleggende studier av intercellulære interaksjoner (f.eks normale celler med kreftceller) og for analyse av ulike TME spesifikke celle fenotype endringer (for eksempel fremveksten av kreft-assosiert fibroblaster fra normale fibroblaster). I tillegg sfæroidene er i stand til å skape et mer reflekterende vev-lignende struktur av TME, og kan være representativ for tumor-heterogenitet 23. Men kuler ofte produsere svært varierende oksygen spenning gradienter over lag, som kan komplisere eksperimentelle konklusjoner 24. Dessverre er begge modellene svært begrenset i sin evne til å isolere rene cellepopulasjoner for videre karakterisering og studere følgende co-kultur. For å gjøre dette ville kreve minst én celletype for å være fluorescent-merket, eller merket med et identifikasjonstrakter, og deretter underkaste den blandede ko-kultur til omfattende behandling og cellesortering for å skille cellepopulasjoner. Mens en celle sorter er i stand til å isolere en ganske ren cellepopulasjon, må man være bevisst cellulært stress og potensiell mikrobiell kontaminasjon risikerer 25.
For å lette forståelsen av inter kommunikasjon, har store anstrengelser vært viet til å utvikle og optimalisere in vitro systemer som tett etterligner in vivo miljø, samtidig som en tillater en forenklet tilnærming. Et slikt verktøy er gjennomtrengelig mikroinnsats, en membran substrat som først ble utviklet i 1953 26 og senere tilpasset for ulike applikasjoner og studier (f.eks celle polaritet 27, endocytose 28, narkotika transport 29, vev modellering 30, Fertilization 31, Tilskuereffekten 32,33, etc.). Dette systemet muliggjør vekst av celler med in vivo-lignende anatomisk og funksjonell differensiering, så vel som ekspresjon av mange in vivo markører 34,35 som er ikke observert når de dyrkes på ugjennomtrengelig plasticware. Videre er det ekstremt tynn porøs membran (10 um tykk) tillater hurtig diffusjon av molekyler og ekvilibrering ganger, noe som simulerer in vivo miljø og tillater uavhengig cellulær funksjon ved både de apikale og basolaterale celle domener. En ytterligere fordel med innsatsens anvendelse som et TME system er dets fysiske separasjon av to heterotypic celle populasjoner dyrket på hver side av membranen i de samme miljøforhold, og samtidig opprettholde ulike former for intercellulær kommunikasjon gjennom membranporene. Selv om fysisk adskilt, er de to cellepopulasjoner metabolisk koplet via utskilte elementer og, som debeskrevet her, også gjennom gap-junctional kanaler. I tillegg, ved å opprettholde innsatsene ved in vivo partielle oksygenspenning (PO 2), reduserer modellen komplikasjoner av oksygen og kjemiske gradienter observert i andre systemer. Snarere, det øker forståelsen av naturlige mekanismer som styrer TME. Spesielt kan de to cellepopulasjoner kan lett isoleres med høy renhet, uten fluorescerende merking og / eller cellesortering etter lengre perioder med ko-kulturen.
Her beskriver vi en in vitro TME protokoll bestående av humane brystcancer-celler og humane fibroblaster dyrket, henholdsvis på hver sin side av en permeabel mikroporøs membran sette inn, men likevel i kontinuerlig toveis kommunikasjon gjennom membranporene. Vi viser at ved å bruke membraner med forskjellige porestørrelser, bidraget av en bestemt type av intercellulær kommunikasjon (f.eks utskilt faktorer versus gap junctions) til utviklingav TME kan undersøkes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Culture Media og celler
- Fremstille 500 ml av Eagles minimale essensielle medium supplert med 12,5% (vol / vol) varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamin, og 100 enheter av penicillin og 100 ug streptomycin pr ml.
MERK: vekstmedium og supplement (e) lett kan byttes for vekst hos andre cellestammer eller cellelinjer. - Fremstille 70 ul av cellekulturmedium for hver innsats (6-brønns format innsats): Eagles minimum essensielt medium supplert med 50% (volum / volum) varme-inaktivert FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamin, og 100 enheter av penicillin og 100 ug streptomycin pr ml.
MERK: medium er supplert med 50% FBS for å lette cellefesting til undersiden (dvs. undersiden) av innsatsen. Den vekstmedium og supplement (e) kan lett bli byttet ut med vekstbetingelser i andre cellestammer eller cellelinjer. - Fremstille en cellesuspensjon av cellene bestemt til å bli belagt på undersiden av innsatsen.
MERK: Her ble resultatene oppnådd ved bruk AG1522 normale humane fibroblaster dyrket i 75 cm2 cellekulturflasker, og disse cellene vil derfor være fokus på beskrivelse av cellesuspensjonen forberedelse. - For å samle cellene, fjerner vekstmedium og vaske celle monolag 2x med 5 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Fjern PBS og spre 1 ml av 0,25% (vol / vol) trypsin med 2,21 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), pre-oppvarmet til romtemperatur (RT) over cellene i 2 min ved RT (romtemperatur).
- Slukke trypsinaktivitet med 9 ml komplett vekstmedium (fremstilt i trinn 1.1) og samle celler ved forsiktig pipettering cellesuspensjonen over overflaten av kolben 10x.
- Bestemme cellekonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer eller elektronisk teller og pipettere cellesuspensjonen volum som vil kunne leveree 250.000 celler pr enheten i et sterilt 15 ml sentrifugerør.
- Pelletere cellesuspensjonen ved sentrifugering (800 x g, 2 min). Suspen cellepelleten med vekstmedium (fremstilt i trinn 1.2) for å skape en konsentrasjon på 250.000 celler per 70 mikroliter.
MERK: Som cellekultur i permeable mikroporøse membraninnsatser er basert på 2D-substrater, blir celle såing utføres på samme måte, bortsett fra at cellene skal innledningsvis suspenderes i medium inneholdende 50% (volum / volum) FBS for å lette festing.
2. Utarbeidelse av innlegg
MERK: For å sikre sterile forhold, arbeid i en laminær biologisk sikkerhetskabinett dedikert til cellekultur.
- Velger innsatser med en membran porestørrelse på 0,4 pm, en mikrometer, eller 3 um (bestemt av den eksperimentelle interesse (e), som porestørrelsen kan anvendes for å undersøke hvilken rolle forskjellige moduser av intercellulær kommunikasjon).
MERK: Den 0,4 mikrometer pore er small nok til å begrense dannelsen av funksjonelle gap junctions mellom cellene på hver side av innlegget membranen og kan brukes til å studere intercellulær kommunikasjon av utskilte faktorer. Mens o 1 pm og 3 pm porer er store nok til å tillate dannelsen av funksjonelle gap junctions og kan brukes til å studere intercellulær kommunikasjon av både gap junctions og utskilte faktorer. - Fjern individuelle innsatser fra emballasjen og plasser det i like store multi-brønn parabolen.
MERK: Setter er tilgjengelig med ulike membran flater for å passe spesifikke behov (for eksempel 6-brønnen, 12-brønnen, og 24-brønns innsatser.). Her ble resultatene oppnådd ved bruk av 6-brønnen insert, og vil derfor være fokus på modellbeskrivelsen. - Dekk formen, som inneholder innleggene med parabolen lokk. Hold multi-brønn tallerken med begge hender, forsiktig snu tallerken slik at innsatsen bunner (dvs. undersiden) er nå vendt oppover.
- Fjern the bunnen av multi-brønners skål, utsette bunnsiden av innsatsene. Arbeide med en innsats av gangen, bruk en steril pinsett og holder innsatsen på plass forsiktig. Med frie hånden, bruk en pipette med en bred munn spissen for å trekke 70 mL av cellesuspensjon (utarbeidet i trinn 1,3-1,8), som inneholder 250.000 celler.
- Til platen cellene, plassere pipettespissen forsiktig på midten av innsatsen membran, og langsomt pipette 70 mL av cellesuspensjonen under sakte beveger pipettespissen rundt overflaten av membranen. Vær forsiktig med å forlenge pipettespissen og cellesuspensjon til kanten av innsatsen.
MERK: Når du trykker på kanten av innsatsen kan føre til tap av kapillær spenning av cellesuspensjonen fører til cellene uttørking under vedlegg. - Gjenta for de resterende innsatser, med forsiktighet utøves ikke å jobbe direkte over de eksponerte setter inn for å unngå potensiell mikrobiell kontaminasjon.
- Forsiktig tilbake multi-brønntallerken bunnen for å dekke innleggene. Å holde fatet med innsatser invertert, inkuberes i en fuktig luft atmosfære av 5% (volum / volum) CO2 ved 37 ° C i 30-45 min.
MERK: Hvis cellesuspensjonen på innsatsen i kontakt med bunnen av brønnen, løfter forsiktig fatet bunnen og la den hvile på kanten av fatet toppen, slik at den danner en liten vinkel og skaper større skille mellom overflaten av parabolen og undersiden av innsatsene (hvor cellene blir sådd). Dette vil hindre at celler fra å feste seg til overflaten av brønnene i stedet for innsatsen. - Etter 30-45 min inkubasjonstid, fjern forsiktig fatet inneholder innsatser og plassere den i laminær biologisk sikkerhetskabinett.
- Med to hender og holde tallerken lokket tett, svakt gjen snu fatet slik at bunnsiden av innsatsene inneholdende de festede celler nå vender ned.
- Sakte og forsiktig tilsett 2 ml (1 ml for 3 mikrometer pore innsatser for å unngå migratipå celler gjennom innsatsen porer) for forvarmet komplett medium (se trinn 1.1) til hver brønn, slik at bunnen av innsatsen er nedsenket.
- Etter å legge vekstmedium i alle brønnene som inneholder innsatser, sett formen tilbake i fuktet inkubator.
- Tillat innsatsene forbli uforstyrret i inkubatoren i 48 timer. Etter 48 timer, mate cellene ved å aspirere 2 ml medium fra bunnen av brønnen og tilsetning av 2 ml friskt vekstmedium.
- Etter tilsetning av frisk medium til bunnen av brønnen, frø 1 ml av den andre cellepopulasjon suspensjon (~ 250.000 celler / mL) på oversiden av innsatsen, som allerede har den første cellepopulasjon voksende på bunnsiden (for disse eksperimenter er AG1522 (kontroll) celler eller kreft (eksperimentelle) celler sådd ut på toppen av innsatser, noe som allerede har AG1522 celler, ment til å bli kafeer, vokser på bunnsiden av innsatsene). Sett fatet tilbake i fuktet inkubator.
MERK: Hvis arbeideting med celler som ikke fester seg godt til bunnen av innsatsen, kan disse cellene bli alternativt dyrkes på oversiden av innsatsen. - Skift medium ved 24, 72 og 96 timer etter utsåing den andre populasjon av celler på oversiden av innsatsen ved å aspirere mediet fra toppen av innsatsen og bunnen av brønnen. Tilsett 1 ml friskt medium til oversiden av innsatsen og 2 ml til bunnen av brønnen. La de to cellepopulasjoner for å forbli i ko-kultur på hver side av den gjennomtrengelige mikroporøse membran innsatsen i 120 timer.
3. Samle Celler fra Insert ved trypsinering
MERK: I tillegg til den enkle skaffe beriket celle populasjoner, innsatsen TME modellen gjør det også for lignende eksperimentell behandling (f.eks inkubasjon med kjemikalier, eksponering for oksygen forhold som er over eller under omgivelses atmosfære, ioniserende stråling behandling, etc.) som andre in vitro eksempel in situ immuno-deteksjon, Western blotting) eller formeres for etterfølgende eksperimenter 36.
- Å samle celler, fjerne innsatsen fra vekstmediet og plassere den i en 35 mm cellekulturskål inneholder 1 ml PBS. Vask bunnen og toppen sider av innleggs 1x med 1 ml PBS.
- Fjern PBS og tilsett 200 ul av 0,25% (vol / vol) trypsin med 2,21 mM EDTA, pre-oppvarmet til romtemperatur.
- Ved oppsamling av celler dyrket på undersiden av innsatsen, plasserer trypsin oppløsningen inn i 35 mm skål og plassere forsiktig bunnen av innsatsen i trypsin-løsning i 2 minutter ved RT.
- Hvis samle cellens dyrket på oversiden av innsatsen, plasserer innsatsen i et 35 mm tallerken og legg til trypsin løsning på toppen av innsatsen og inkuberes i 2 min ved RT.
- Slukke trypsin aktivitet ved å tilsette 800 mL av komplett vekstmedium.
- Ved oppsamling av celler dyrket på bunnen av innsatsen, tilsett vekstmedium til 35 mm skål og samle cellene ved forsiktig pipettering av 1 ml cellesuspensjon over overflaten av innsatsen 10x, med innsatsen blir holdt ved en liten vinkel, slik at cellesuspensjonen samles i formen.
- Ved å samle cellene fra oversiden av innsatsen, tilsett vekstmedium til oversiden og forsiktig pipettere o 1 ml cellesuspensjon over overflaten av innsatsen 10x.
4. Karakterisering av Cell Purity ved flowcytometri
NB: For å karakterisere evnen til de permeable mikroporøse membran setter inn for å opprettholde renheten i than to celle populasjoner (dvs. topp og bunn) for opp til 120 timer, §§ 1-3 ble utført, med grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged MDA-MB-231 celler blir belagt på oversiden av innsatsen, og ikke-GFP-merket AG1522 cellene blir sådd ut på undersiden av 0,4 μm-, en μm-, eller 3 pm pore-innsatser.
- Når cellene fra den nedre side av innlegget ble oppsamlet (fremgangsmåten beskrevet i avsnitt 3), pelletere cellesuspensjonen ved sentrifugering (500 g, 30 sek).
- Fjern supernatanten og suspen cellepelleten i 400 ul av Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) supplementert med 1% (volum / volum) FBS.
- Utføre cytometri-analyse på en flowcytometer utstyrt med en 488 nm laser for å eksitere GFP og et båndpassfilter for å detektere 530/30 GFP-foton emisjon 37.
- For celleidentifikasjonsformål, bruker AG1522 kontroll cellepopulasjoner å justere frem og side scatter spenninger på flowcytometeret. JustereGFP kanalen spenning for å sette den cellulære autofluorescence verdi som den nedre deteksjonsgrensen for GFP signal.
- Bestem gating terskel bruker kontrollceller. Bedømme renheten av hver cellepopulasjon basert på tilstedeværelsen av GFP-positive celler versus kontroll.
MERK: En ren befolkningen ville være representative for noen GPF-positive celler oppdages.
5. Karakterisering av celler ved in situ Immunofluorescence
- Etter trypsinering av celler fra innsatsen (se punkt 3), samle celler, plate 5 x 10 4 celler i 250 mL vekstmedium (se trinn 1.1) på sterile dekkglass, og innrømmer å feste for en time i en fuktet luft atmosfære av 5% (volum / volum) CO2 ved 37 ° C inkubator.
- Ved slutten av inkubasjonstiden, forsiktig fjerne parabolen som inneholder dekkglass og plasser den i laminær biologisk sikkerhetskabinett.
- Nøye tilsett 2 ml forvarmet komplett medium (se trinn1,1) til hver skål, slik at dekkglass er nedsenket.
- Etter tilsetning av vekstmedium til alle de retter som inneholder Dekkglass, returnerer retter til et fuktet luft atmosfære av 5% (volum / volum) CO2 ved 37 ° C i en inkubator i 48 timer.
- Etter den 48 timers inkubasjon vaskes eksempel 3x med PBS og feste med 4% (vekt / volum) formaldehyd i PBS i 10 min ved RT.
- Skyll 5x med Tris-bufret saltvann (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) og deretter permeabilize med 0,25% (vol / vol) Triton X-100, 0,1% (vekt / volum) saponin i 5 minutter ved RT.
- Blokkere ikke-spesifikke bindingsseter med 2% (volum / volum) normalt geiteserum (NGS), 1% (vekt / volum) bovint serumalbumin (BSA), 0,1% (vol / vol) Triton X-100 i TBS (blokkering løsning) i 1 time ved RT.
- Inkuber med primært antistoff (anti-Caveolin 1 (CAV1), 1: 1000) i blokkeringsløsning ved 4 ° C over natten.
- Vask av ubundne primære antistoffer (3 x 5 min / vask) med 0,2% NGS (vol / vol), 1% (vekt / volum) BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 i TBS (vaskeløsning).
- Inkuber med sekundært antistoff ved RT i 1 time i blokkeringsløsning (se avsnitt 5.4).
- Vask av ubundet sekundært antistoff (3x, 5 min / vask) med vaskeløsning (se trinn 5.6).
- Mount Dekk på et lysbilde med en anti-fade monteringsmedium som inneholder 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI), og forsegle med neglelakk.
- Observer celler ved hjelp av en 63X olje forstørrelse objektiv på en invertert mikroskop utstyrt med en ekstern lyskilde for fluorescens eksitasjon, og ta bilder ved hjelp av en vedlagt digitalkamera for nærmere analyse.
6. Karakterisering av celler ved hjelp av Western Blot
MERK: Western blot prosedyren er beskrevet andre steder 38. En kort oversikt er beskrevet her:
- Etter avløsning av celler fra innsatsen ved trypsinering (se punkt 3), pellet cellesuspensjonen ved sentrifugering (500 g, 30 sek).
- Fjern supernatant og suspen cellepelleten 2x med 100 ul PBS.
- Fjern supernatant og lyse-celler i 50 pl modifisert radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 1% (vol / vol), natriumdeoksycholat monohydrat (DOC) 0,5% (vol / vol), natriumdodecylsulfat (SDS) 0,1% (vol / vol)), inneholdende protease og fosfatase-inhibitor cocktail.
- Inkuber i 20 minutter på is og sentrifuger ved 19.000 g i 15 min ved 4 ° C.
- Bestem konsentrasjonen av proteiner i supernatanten ved bruk av en protein optisk tetthet assay forenlig med vaskemidler i RIPA buffer.
- Separate proteiner ved natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel gelelektroforese (SDS-PAGE) og electroblot mot en 0,2 mikrometer nitrocellulosemembran.
- Inkuber membraner i TBS inneholdende 0,1% (vol / vol) Tween-20 (TBST) og 4% (vekt / volum) skummet melk (blokkeringsløsning) i 60 minutter og reagere med primært antistoff ved 4 ° C over natten (anti-CAV1, 1: 1000).
- Vask membran 3x med TBST ved romtemperatur (5 min / vask).
- Inkuber membraner i 30 minutter i blokkeringsløsning inneholdende et anti-muse-sekundært antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (HRP) (1: 5000).
- Vask membran 3x med TBST ved romtemperatur (5 min / vask).
- Visualiser reaksjonsprodukter ved kjemiluminescens hjelp av en Western blotting detection system.
7. Karakterisering av inter Kommunikasjon ved flowcytometri
MERK: For å karakterisere tilpasningsevne av permeable mikro membran setter inn for å undersøke forskjellige moduser av interkommunikasjon (for eksempel skilles faktorer, gap veikryss). Seksjoner 1-2.12 ble utført med ikke-fluorescerende AG1522 cellene blir sådd ut på undersiden av 0,4 μm-, en μm-, eller 3 pm pore-innsatser.
- Kultur non-merket AG1522 celler i en 35 mm rett til 90% konfluens bruker medium beskrevet i kapittel 1.1.
- Rinse celler 1x med 1 ml HBSS.
- Veieceller med Calcein AM ved å inkubere cellene i HBSS som inneholder 30 mikrometer av Calcein AM.
- Inkuber i 15 min i en fuktet luft atmosfære av 5% (volum / volum) CO2 ved 37 ° C.
- Vask cellene 2x med 1 ml HBSS.
- Trypsineres cellene ved tilsetning av 200 ul løsning av 0,25% (vol / vol) trypsin med 2,21 mM EDTA i 2 minutter ved RT.
- Slukke trypsin-aktivitet ved å tilsette 800 ul av fullstendig medium inneholdende 12,5% (volum / volum) FBS.
- Ta med celler i suspensjon ved gjentatt pipettering.
- Bestem cellekonsentrasjonen ved hjelp av en hemocytometer eller elektronisk teller og plate 250.000 celler lastet med Calcein AM til oversiden av innstikk som allerede har AG1522 celler som vokser på undersiden.
- Inkuber innstikk i en fuktet luft atmosfære av 5% CO2 ved 37 ° C i 6 timer.
- Etter 6 timer, samle celler fra bunnsiden av innsatsene, slik det er beskreveti kapittel 3.
- Pelletere cellesuspensjonen ved sentrifugering (500 g, 30 sek).
- Fjern supernatanten og suspen cellepelleten i 400 ul HBSS supplert med 1% (volum / volum) FBS.
- Analyser av cellene på en cytometer utstyrt med en laser og filter i stand til å spennende og detektere utslipp av Calcein (496 nm og 516 nm, respektivt), i henhold til produsentens protokoll.
- For celleidentifikasjonsformål, må du bruke en unstained AG1522 kontroll cellepopulasjon å justere frem og side scatter spenninger på flowcytometeret. Juster Calcein kanal spenning for å sette den cellulære autofluorescence verdi som den nedre deteksjonsgrensen for Calcein signal.
- Bestem øvre grenseverdi hjelp Calcein-lastet kontrollceller. Vurdere kommunikasjon for hver celle innsatsen basert på tilstedeværelsen av Calcein-positive celler versus kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her tilpasset vi en gjennomtrengelig mikro membran innsats for å utvikle en in vitro heterotypic celle co-kultur system som gjenspeiler in vivo svulstens mikromiljø (figur 1). Dette systemet gjør det mulig for to forskjellige cellepopulasjoner for å bli dyrket på hver side av innlegget er porøs membran i lengre tid (opp til 120 timer, i vår bruk). Viktigere systemet er i stand til å opprettholde renheten av cellepopulasjoner, som bestemt ved utsåing GFP-merket MDA-MB-231-celler på oversiden av 0.4-, 1- eller 3 m-pore innsatser og tillater dem å vokse i ko-kultur med AG1522 celler vokser på undersiden av innsatsen, i 120 timer. Etter denne tiden ble cellene samlet opp fra undersiden av innsatsen og analysert ved strømningscytometri for å identifisere tilstedeværelsen av eventuelle GFP-positive MDA-MB-231-celler, noe som ville indikere et tap av cellepopulasjon renhet. Analysen avdekket 99,9% og 99,8% pure befolkninger fra 0,4 og 1 mikrometer-pore innleggsdeler, henholdsvis; Men innsatsen med 3 um porer var ute av stand til å opprettholde adskillelsen av cellepopulasjoner, som porene var store nok til å tillate et betydelig antall av de GFP-positive MDA-MB-231-celler til å migrere over membranen (Figur 2) .
Viktigere, via in situ immunfluorescens og Western blot-analyse var vi i stand til å demonstrere evnen til dette system til effektivt å generere kreft-assosiert fibroblaster fra normal human diploid AG1522 fibroblaster følgende ko-kultur med MDA-MB-231 brystkreftcelle, som bestemmes av redusert uttrykk for Caveolin-en, et veletablert CAF biomarkør 39-42 (figur 3). CAV1 er et stillas protein som danner caveolae i lipid flåten domenet til plasmamembranen, som er involvert i flere cellulære prosesser 43. I Western blotTo distinkte bånd ble observert, svarende til a og p-isoformer av CAV1 44. Dessverre, er lite kjent om forskjellen (e) mellom isoformene, spesielt deres rolle som CAF biomarkører.
Vi har også vist ferdighet av innsatsen ko-kultursystem for å modulere intercellulær kommunikasjon mellom de to heterotypic cellepopulasjoner (figur 4). Ikke-merket, gap junction-kompetente humane diploide AG1522 fibroblaster ble dyrket til konfluens på undersiden av innsatsen. Et annet sett med AG1522 celler ble lastet med Calcein AM, en grønn fluorescerende gap junction-gjennomtrengelige fargestoff, og belagt på oversiden av innsatsen. De to cellepopulasjonene ble tillatt å kommunisere i 6 timer, og deretter cellene på undersiden av innsatsen ble isolert og analysert ved strømningscytometri. Calcein-positive celler fra den nedre side av innlegget vil være representative for celler som established gap-junctional kobling gjennom innleggs porene. Størrelsen på 0,4 pm pore sett begrenset funksjonell gap junction dannelse mellom celler som vokser på hver side av innsatsen, og dermed begrenser kommunikasjon til utskilles faktorer (for eksempel vekstfaktorer, mikrovesikler, etc.). Alternativt kan størrelsen på 1 mikrometer og 3 um porene er tydeligvis store nok til å tillate funksjonell kopling av cellene gjennom gap veikryss. Derfor, ved modulering av porestørrelse, kan man begynne å forstå diverse rolle (e) som forskjellige moduser av intercellulær kommunikasjon kan ha på TME utvikling og utvikling.
Figur 1:. Permeable mikroporøs membran Sett Modell Scheme (a) Tilsynelatende normale humane diploide AG1522 fibroblaster (lav passasje celler) bestemt til å bli kafeer er seedet på invertertgjennomtrengelige mikroporøse innsatser som består av en 10 um tykk polyestermembran med 0,4 um, 1 um, eller 3 um porer. Etter festing, er innsatsene invertert og plassert i brønnene i platene og dyrket til konfluens. (B) Kreftceller og kontroll fibroblaster dyrket separat i kolber før de ble sådd på oversiden av innsatsene med fibroblaster vokser intimt på bunnsiden. (C) ko-dyrkede celler blir matet hver annen dag og opprettholdt i den ønskede tid. (D) Til de respektive tidspunkter etter ko-kultur og / eller eksperimentell behandling, blir de kafeer (bunnsiden av innsettinger) og / eller kreftceller (overside av innsatsen) omhyggelig isolert ved trypsinering, hvilket ga meget rene cellepopulasjoner, som kan brukes for analyse av endepunkter eller spredd for senere studier. klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Generering av høyanriket celle populasjoner Representant flowcytometri resultater viser evne til innsatsen for å opprettholde høyanriket, men uavhengige heterotypic celle populasjoner følgende 120 t co-kultur. (A) AG1522 celler høstet fra bunnsiden av 0,4 pm pore innsats viser 99,9% av befolkningen til å være fri for GFP-merket MDA-MB-231 celler som vokser på oversiden av innsatsen (nedre venstre kvadrant). (B) AG1522 celler høstet fra undersiden av en um pore innsats viser også 99,8% anriket populasjon (nedre venstre kvadrant). (C) AG1522 celler høstet fra bunnsiden av den 3 um pore innsatsen viser imidlertid at bare 68,5% av befolkningen er fri for GFP-merkede celler (nedre venstre kvadrant), Noe som indikerer at et stort antall av GFP-positive MDA-MB-231 celler var i stand til å migrere gjennom de 3 mikrometer porene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Generation of Cancer-assosiert fibroblaster Redusert uttrykk for CAV1 er et konsistent og pålitelig CAF biomarkør. (A) Mikroskopiske bilder av in situ immunfluorescens (skala bar = 20 mikrometer), og (b) Western blot analyse av CAV1 i AG1522 celler som hadde vært i co-kultur med AG1522 celler (kontroll) (til venstre), eller med MDA- MB-231 brystkreftceller (til høyre) for 120 hr. Farging med Ponceau S Red ble brukt til lasting kontroll og for å bestemme ganger endring i Western blot. Resultatene er representative fortre separate forsøk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Modulation av inter Kommunikasjon ved Insert Pore stort Flowcytometri analyser viser tilpasningsevne av permeable mikro membran innsats TME modell for å velge for ulike former for interkommunikasjon mellom Calcein AM lastet AG1522 cellene vokser på toppen av innsatsen og AG1522 kontroll celler som vokser på sin nedre side. (A) Celler høstes fra bunnsiden av 0,4 um pore skjær viser meget lave nivåer av Calcein-positive celler (0,57%), som indikerer begrenset gap junction-kommunikasjon gjennom innleggs porene. (B) Celler høstes fra bunnsiden av 1 um pore skjær viser higher nivåer av Calcein-positive celler (9,98%), noe som indikerer dannelsen av funksjonelle gap veikryss. (C) Celler høstes fra undersiden av 3 mikrometer pore skjær viser høye nivåer av Calcein-positive celler (87,8%), noe som indikerer omfattende gap-junctional kommunikasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her er en enkel, tilpasningsdyktig in vitro prosedyre (figur 1) som benytter en gjennomtrengelig mikro membran innsats for å generere høyanriket enkelte cellepopulasjoner fra en co-kultur heterotypic celler. Betydelig, er modellen egnet til å undersøke ulike former for interkommunikasjon. De kritiske trinnene omfatter å velge den passende pore-størrelse innsats for spesifikk eksperimentell interesse (s), såing den første cellepopulasjon på undersiden av innsatsen i medium supplert med 50% FBS, poding av andre cellepopulasjon på oversiden av sette inn, og ko-dyrking av to distinkte cellepopulasjoner for en passende varighet av gangen. Vi viser at dette systemet er i stand til å etterligne forskjellige in vivo egenskaper, og dermed gi en større mulighet til å forstå den molekylære, fenotypiske, og latente forandringer som oppstår under tidlig TME evolusjonen, som omhandler en stor disadvantage av mange etablerte TME in vitro modeller (figur 2).
Modellen kan enkelt endres til å tillate undersøkelse av ulike aspekter ved celle-celle interaksjoner i kreft-stroma utvikling og TME evolusjon (figur 4). Mens 0,4 pm pore innsats tillater intim kobling mellom de to cellepopulasjoner 45, det begrenser i betydelig grad dannelsen av funksjonelle gap junctions mellom celler dyrket på hver side av innlegget membranen (figur 4). Derfor, og dermed legge til rette for etterforskning av rollen diffusible faktorer (for eksempel vekstfaktorer) og / eller ekstracellulære vesikler (f.eks exosomes), som formidler CAF utvikling 46-48. Alternativt kan 1 pm og 3 pm porer er store nok til å tillate dannelsen av funksjonelle gap junctions, og således tillater studiet av både direkte metabolsk kopling via synaptiske kanaler og indirekte kommunikasjon viadiffusible utskilt faktorer. Imidlertid, som det 3 um pore innsats tillater cellemigrering gjennom porene (se figur 2), er det ikke opprettholde renheten av to separate heterotypic cellepopulasjoner under lengre ko-kultur tider (f.eks., 120 timer). Mens den foreliggende modellen muliggjør studium av flere aspekter av TME, er det begrenset i sin evne til å ta hensyn til mange av de komplekse fysiologiske interaksjoner som forekommer innenfor en in vivo-TME (f.eks vaskulære fluid utveksling, etc.).
Forstå de tidlige hendelsene i kreft-stroma aktivering og utvikling av TME er viktig å belyse trinnene involvert i primærtumor initiering og progresjon, samt metastasering. Det er nå allment akseptert at kreften stroma, spesielt kafeer, har en avgjørende rolle i å støtte kreftutvikling (anmeldt i 49). Dette har ført til utviklingen av mange in vitro 2D- og 3D-modeller, måled på å belyse strategier for å målrette de tidlige mekanismer som bidrar til stromal-aktivering og tumorprogresjon. Dessverre er mange av disse modellene er begrenset av deres manglende evne til å tillate isolering av individuelle cellepopulasjoner, uten tidkrevende og stressende behandling, for videre studier. Derfor er denne protokollen gir et betydelig tillegg til feltet av TME forskning, fordi den kombinerer in vivo lignende egenskaper med evne til å raskt og enkelt få høyanriket eller rene cellepopulasjoner for umiddelbar analyse eller forplantning for senere studier.
Når teknikken er mestret, kan innsatsen TME-modellen benyttes for å undersøke forskjellige TME toveis interaksjoner (for eksempel kreft til endotele, kreft til immunceller, etc.). I tillegg kan kompleksiteten i ko-kulturen bli forbedret ved å anbringe en blandet cellepopulasjon på en side av innlegget, og en enkelt populasjon på den alternative side, og dermed oppnåing en mer in vivo som TME cellepopulasjon kompleksitet. Men forsiktighet bør utvises i å velge et innstikk med riktig pore-størrelse hvis du bruker cellene i spesielt liten diameter (f.eks humane lymfocytter med en diameter på ~ 7 mikrometer 50), da de kan være i stand til å migrere gjennom de mindre porene ( for eksempel 0,4 mikrometer eller en mikrometer). Før co-kultur, kan migrasjon eksperimenter (figur 2) være berettiget å sikre vedlikehold av rene cellepopulasjoner gjennom utvidet samarbeid kultur eksperimenter.
Denne modellen er også mottagelig for å undersøke effekten av ulike terapeutiske utfordringer (for eksempel ioniserende stråling, kjemoterapeutika, hypertermi) og fysiologiske endringer (f.eks hypoksi, hyperoksi, biologiske hemmere) i mixed cellepopulasjoner som er koblet på tvers av gjennomtrengelige mikro membran innsats. Modellen har vist sin evne til å generere kafeer, identified av et allment akseptert CAF biomarkør (dvs. nedregulering av CAV1) 39-42 (figur 3), som ble ytterligere redusert med 55% når innsatsen systemet ble holdt ved in vivo som PO 2 (7 mm Hg, 0,5% O 2) 51, fremhever modellens tilpasningsevne til ulike eksperimentelle design og betingelser (data ikke vist). I sum gir denne modellen en forenklet tilnærming og en mulighet til å modulere tidsmessige og ytre faktorer for å oppnå en dypere innsikt i kreft-stroma-aktivering, den tidlige utviklingen av TME, og cellulære responser til terapeutiske eller miljømessige midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende eller motstridende interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence - 1:2,000 |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
- Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
- Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59 (19), 5002-5011 (1999).
- Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
- Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
- Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
- Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
- Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
- Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
- De Wever, O., Nguyen, Q. -D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
- Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
- Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
- Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
- Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407 (2009).
- Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638 (2013).
- Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
- Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387 (2010).
- Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
- Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540 (2011).
- Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
- Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
- Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
- Ducrest, A. -L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65 (2002).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
- Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
- Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
- Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102 (2013).
- Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
- Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
- Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
- Tyan, S. -W., Kuo, W. -H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313 (2011).
- Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
- Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310 (2013).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
- Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Research. 51 (12), 3316-3322 (1991).
